Um Protocolo de Chelex simples para extração de DNA de Anopheles Spp.

O objetivo geral deste procedimento é extrair malária, parasitas e DNA de mosquitos do intestino médio e seções de glândulas salivares de anomalias, espécimes. Isso é feito cortando primeiro o mosquito exatamente na articulação entre o abdômen e o tórax, separando assim o intestino médio da seção da glândula salivar. Em seguida, cada seção é moída separadamente em água deionizada.

Em seguida, a suspensão de tecido é deitada e lavada e o pellet celular é recuperado. Finalmente, o pellet celular é reconstituído e fervido, e o DNA é extraído. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram mosquito de alta qualidade e parasita da malária, DNA, adequado para uso como modelo para identificar anomalias, espécies de vetores e infecções por malária de genótipo por meio de PCR e digestão de enzimas de restrição específicas de alelos.

Portanto, a principal vantagem dessa técnica muito simples sobre as existentes, como extração orgânica e métodos de classificação, é que ela usa muito poucos reagentes seguros e prontamente disponíveis e muito menos tempo de processamento também. Para começar a dissecar o mosquito, coloque-o em um pequeno pedaço de paraforma e monte-o em um microscópio de dissecação. Cubra-o com uma gota de água deionizada.

Para amolecer o tecido em tamanho, a carcaça do mosquito precisamente na articulação entre o tórax e o abdômen. Assim, cortando a cabeça e o tórax da seção abdominal. Transfira cada seção de mosquito dissecada para uma autoclave limpa, tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro pré-rotulado com o número de identificação do mosquito e a seção do corpo, descarte o filme para e, usando um pano Kim umedecido com álcool a 70%, limpe cuidadosamente o estágio do microscópio antes de processar para o próximo mosquito para extrair o DNA do mosquito primeiro pipetar 20 microlitros de água deionizada no tubo de amostra.

E use a ponta da pipeta para moer a seção de mosquito submersa em uma suspensão uniforme. Adicione 100 microlitros de uma autoclave, uma solução de saponina XPBS 1% ao homogeneizado da amostra e bata suavemente para misturar. Incubar a amostra à temperatura ambiente durante 20 minutos.

Em seguida, centrifugar a 20 000 G durante dois minutos e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 100 microlitros um XPBS. Em seguida, repita o giro.

Adicione 75 microlitros de água deionizada estéril e 25 microlitros de 20% de peso por volume. Cellex 100 suspensão de resina em água deionizada e vórtice suave para ressuspender o pellet usando uma agulha hipodérmica estéril de calibre 23 inflamada em bico de bunsen. Faça um furo na tampa do tubo de amostra.

Ferva a suspensão da amostra em um bloco de aquecimento por 10 minutos. Centrifugue a 20.000 G por um minuto e transfira a solução de DNA para um frasco de armazenamento pré-rotulado para uso como modelo em reações de PCR para verificar a qualidade do DNA extraído, amplificar uma região do gene da subunidade quatro da nicotinamida adenina dinucleotídeo desidrogenase da nicotinamida mitocondrial do artrópode, que deve produzir um fragmento de 400 pares de bases. Em seguida, para diferenciar entre as espécies de Ananais Gâmbia, amplifique uma região flanqueando SNPs na região espaçadora intergênica que deve produzir tamanhos de 390 pares de bases para Ananais Gâmbia Sens Stricto e 315 pares de bases para ananais api.

Ansis então para o genótipo p falciparum anti polimorfismos de resistência a drogas de folato. Realize PCR aninhado para amplificar a região flanqueando os códons de aminoácidos 16, 51, 59, 108 e 164. Nos parasitas, o gene dihidro folato redutase realiza a digestão específica do alelo do amplicon para detectar resistência a drogas antifolato.

Polimorfismos associados. Verifique as reações em um exame de gel AROS a 2%. Exemplos de resultados de ensaios de PCR para análise de qualidade de extrato de DNA de mosquito, identificação molecular RABIS e genotipagem p falciparum mostram que o método Kelex simplificado produz resultados semelhantes ao protocolo de salga padrão, apesar de menos etapas e menos de um quarto do tempo com qualidade de DNA comparável nos respectivos extratos, não é surpreendente que as taxas de positividade da amostra em relação a anomalias, As espécies irmãs da Gâmbia, bem como as taxas de infecção por parasitas, não foram estatisticamente diferentes com base no teste qui-quadrado de McNear.

A adição de BSA às misturas de reação resulta em um aumento geral de PCR positivos devido à remoção de inibidores de PCR para o kelex simplificado e o protocolo de salga regular. No entanto, esse aumento não foi estatisticamente significativo, exceto para a qualidade do DNA nos extratos de kelex. A digestão enzimática de restrição específica do alelo do amplicon p falciparum permite a genotipagem de infecções por malária do intestino médio e das glândulas salivares para alelos de resistência a medicamentos, uma vez dominado.

Esta técnica deve ser executada em cerca de 37 minutos se executada corretamente.