Isolamento de RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizar o trato gastrointestinal Murino
28 de setembro de 2011
Um método confiável para o isolamento do RNA Pseudomonas aeruginosa Recuperou de cecums murino é descrito. O RNA recuperado é de quantidade e qualidade suficientes para qPCR subseqüentes, perfis de transcrição, RNA e experimentos Seq. Esta técnica pode ser adaptada para o isolamento de RNA outros micróbios intestinais.
O objetivo geral deste procedimento é isolar o RNA total de Pseudomonas aerogen recuperado de ECMs murinos. Isso é realizado primeiramente colhendo o conteúdo luminal sequencial. Em seguida, o RNA bacteriano é isolado.
Em seguida, realiza-se o tratamento com D'S e a purificação do RNA. Por fim, o RNA é quantificado e a pureza do isolado é verificada por análise em bioanalisador e por espectrofotometria. Assim, pode-se obter RNA bacteriano de qualidade e quantidade suficientes para avaliações experimentais subsequentes, como QPCR, análise de perfil de transcrição ou experimentos de sequenciamento de RNA.
A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a extração com triol, é que este método incorpora múltiplas etapas de lise em ácido extremamente rigoroso e etapas de extração com clorofórmio feminino para garantir RNA de alta qualidade. Uma demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas de lise e extração são difíceis de aprender, já que protocolos escritos omitem pequenos detalhes críticos para o sucesso. O procedimento será demonstrado por Eduardo Lopez Medina, pesquisador pós-doutorando, e Megan Neubauer, gerente do laboratório, ambos do meu laboratório. Antes de iniciar a coleta, IMSA limpa o almofariz de aço inoxidável em um banho de nitrogênio líquido.
Em seguida, após eutanasiar um camundongo C3 HHEN colonizado com Pseudomonas aerogen de seis a oito semanas de idade, posicione o animal em posição supina sobre uma placa de isopor e higienize o abdômen com etanol 95%. A seguir, faça uma incisão longitudinal mediana através da pele, desde o esterno até o períneo. Então, retraiam-se a pele e o peritônio e expõe-se a cavidade abdominal.
Agora resseque todo o ceco usando pinças. Segure o ceco sobre o almofariz de aço inoxidável e, em seguida, corte ambas as extremidades do ceco com tesoura de dissecação. Encha a ponteira de uma pipeta P 1000 com um mililitro de tampão Flush 8, e depois insira a ponteira na extremidade proximal do ceco.
Lave o tampão Flush Oito e o conteúdo luminal do Sequel para dentro do almofariz de aço inoxidável. Agora triture o Sequel. Lave o conteúdo do Oito com uma pisão estéril.
Em seguida, despeje etanol em um recipiente com gelo seco e coloque um tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros no banho de etanol com gelo seco. Transfira o conteúdo moído do lume congelado para o tubo cônico e armazene o tubo a menos 80 graus Celsius. Esta próxima série de etapas é a mais difícil do procedimento.
Dada a natureza complexa dos materiais obtidos do ceco MI, as repetidas extrações com filóforma fria são absolutamente necessárias para alcançar uma separação aceitável; podem ser exigidas entre três e cinco extrações até que a interface ampla entre as fases aquosa e orgânica seja eliminada. Transfira um volume de fenol ácido com clorofórmio para um tubo de centrífuga Oak Ridge de 50 mililitros. Fixe a tampa com parafina e aqueça o tubo em banho-maria a 65 graus Celsius.
Coloque metade do volume do tampão de lise em um tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros e, em seguida, ferva o tampão por cinco minutos. Após retirar o conteúdo luminal do sequenciador do armazenamento a menos 80 graus Celsius, aqueça brevemente o tubo com uma fricção rápida entre as mãos e, então, adicione o tampão de lise fervente ao tubo. Agite a mistura para homogeneizar a solução do conteúdo luminal SQL com o tampão de lise.
Ferva o tampão de lise e o conteúdo luminal de SQL por cinco minutos. Com vortexação periódica, desvende o tubo de centrífuga Oak Ridge contendo a solução de fenol-clorofórmio e transfira a amostra de lise do conteúdo de SQL para o tubo. Em seguida, refeche a tampa com perfil e coloque o tubo novamente no banho-maria a 65 graus Celsius por 10 minutos, agitando o tubo a cada dois minutos.
Centrifugue a amostra a 2.500 ×g durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo cônico de centrífuga Oak Ridge de 50 mililitros, evitando qualquer parte da interface branca. Então, adicione um volume igual de fenol clorofórmico ácido ao novo tubo.
Selar a tampa com perfil e misturar bem o conteúdo por vortexamento do tubo em alta velocidade. Continuar centrifugando a amostra e transferir a fase aquosa para o tubo de centrífuga. Se o volume da fase aquosa superior ficar muito pequeno, pode-se transferi-lo para um tubo de diâmetro menor.
Continue este processo até que não haja mais interface branca visível entre as fases aquosa e orgânica. Quando a interface branca desaparecer, transfira cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo cônico. Em seguida, adicione ao tubo um volume igual de clorofórmio e álcool isoamílico, feche a tampa e misture bem o conteúdo por vortexagem.
Em seguida, após centrifugar a amostra novamente, transfira a fase aquosa para um tubo cônico de polipropileno de 15 mililitros e adicione um volume igual de isopropanol. Incube então a solução a menos 20 graus Celsius por pelo menos duas horas ou durante a noite. Após a incubação da amostra, centrifugue o tubo por 45 minutos.
Após identificar o pellet com aspecto gelatinoso no fundo do tubo, remova o sobrenadante. Agora, lave o pellet com um mililitro de etanol a 70% gelado, agitando o tubo em vórtex, e em seguida centrifugue a amostra a 10.000 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Por fim, remova o sobrenadante e inverta o tubo para deixar o pellet secar ao ar à temperatura ambiente por 10 minutos.
Em seguida, re-suspenda o pellet de RNA em 200 microlitros de água livre de RNAses. Primeiro, adicione 20 microlitros de tampão 10 x turbo DNA e dois microlitros de turbo DNAse ao tubo de microcentrífuga e misture a solução suavemente. Incube então o tubo a 37 graus Celsius por 20 minutos e, em seguida, adicione 20 microlitros do reagente de inativação de DNA re-suspendido ao tubo e misture bem.
Agora, incube o tubo por mais cinco minutos à temperatura ambiente, com mistura ocasional. Em seguida, centrifugue o pellet em uma microcentrífuga a 10.000 ×g por 1,5 minuto e, então, transfira o sobrenadante para um novo tubo microfuge. Adicione um volume de fenol ácido clorofórmico frio ao pellet e, em seguida, misture completamente a solução por vortexagem durante um minuto.
Após centrifugar a solução por dois minutos a 12.500 ×g, transfira a fase aquosa para um novo tubo e adicione um volume de clorofórmio-álcool isoamílico. Em seguida, homogeneíze a solução por vortex e, depois, centrifugue novamente sob as mesmas condições. Transfira a fase aquosa para um novo tubo microfuga.
Em seguida, adicione 0,1 volume de acetato de sódio 3 M e 2,5 volumes de etanol a 100%, gelado. Agite o tubo em vórtex para homogeneizar. Incube a amostra a menos 80 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, após centrifugar a 12.000 × g durante 30 minutos a quatro graus Celsius, remova o sobrenadante. Por fim, lave o pellet com um mililitro de etanol a 70% gelado. Remova o sobrenadante e seque o pellet ao ar por 10 minutos.
Em seguida, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de água livre de RNAses. O Agilent Bioanalyzer é uma plataforma baseada em microfluídica para dimensionamento, quantificação e controle de qualidade de DNA, RNA, proteínas e células, e utiliza uma métrica de integridade de RNA conhecida como número de integridade de RNA ou RIN-RNA. O RNA extraído com este protocolo produz razões A260/A280 variando de 1,7 a 2,0 e valores de RIN maiores ou iguais a 7,0.
Um exemplo de eletroferograma de RNA bacteriano obtido no bioanalisador Agilent é mostrado aqui à esquerda, e uma imagem semelhante a um gel de *Pseudomonas arosa* recuperada de conteúdos intestinais de camundongos é mostrada aqui à direita. Após este procedimento, outros métodos como PCR quantitativa ou sequenciamento de RNA podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como perfis refinados de expressão gênica.
Visão Geral
Este artigo descreve um método confiável para o isolamento de RNA de Pseudomonas aeruginosa recuperada de cecos de camundongos. A técnica fornece RNA de qualidade suficiente para qPCR, perfilamento de transcrição e sequenciamento de RNA.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Biologia Molecular
- Técnicas de Isolamento de RNA
Antecedentes
- Pseudomonas aeruginosa é um patógeno significativo em várias infecções.
- O isolamento de RNA de alta qualidade é crucial para o estudo da expressão gênica.
- Os métodos existentes podem não fornecer a qualidade desejada de RNA.
- Este método incorpora etapas rigorosas de lise e extração.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável de isolamento de RNA para Pseudomonas aeruginosa.
- Garantir que o RNA seja adequado para aplicações posteriores.
- Demonstrar a eficácia do método por meio de demonstração visual.
Métodos Utilizados
- Coleta de conteúdos luminais de cecos de camundongos.
- Múltiplas etapas de lise e extração utilizando fenol ácido clorofórmico.
- Quantificação e avaliação da pureza do RNA.
- Demonstração visual do protocolo por membros da equipe de laboratório.
Resultados Principais
- RNA de alta qualidade foi isolada com sucesso das amostras.
- O método mostrou-se mais eficaz do que as técnicas tradicionais.
- O RNA foi adequado para qPCR e outras análises.
- Recursos visuais aprimoraram a compreensão do procedimento complexo.
Conclusões
- O método desenvolvido é confiável para o isolamento de RNA de Pseudomonas aeruginosa.
- Pode ser adaptado para outros microrganismos intestinais.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para diversas aplicações.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de RNA de alta qualidade de patógenos colonizadores do trato gastrointestinal permite a desmistificação mecanicista de alvos de virulência em modelos pré-clínicos. Este método apoia a validação de alvos ao associar a expressão gênica bacteriana às alterações no status imunológico do hospedeiro. Ele fornece confiança preditiva para a priorização de candidatos anti-infecciosos antes da identificação de compostos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao capturar estados transcricionais in vivo de Pseudomonas aeruginosa durante a modulação imune do hospedeiro.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da recuperação reprodutível de RNA do patógeno a partir de matrizes gastrointestinais complexas.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao correlacionar alterações na expressão gênica bacteriana com o risco de disseminação em modelos neutropênicos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente, gerando RNA adequado para aplicações de qPCR e sequenciamento.
- Valor Operacional: Aborda a padronização de ensaios por meio de etapas rigorosas de lise e extração que minimizam a variabilidade entre lotes em amostras complexas.
- Escalabilidade: Destaca o potencial de reutilização da plataforma, pois o método pode ser adaptado a outras bactérias e fungos intestinais para triagem ampla de alvos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Conecta a descoberta por meio da continuidade pré-clínica, permitindo o isolamento de RNA a partir de um modelo murino relevante para doenças de colonização gastrointestinal.
- Valor Operacional: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, fornecendo métricas quantificáveis de integridade do RNA (RIN ≥7,0, 260/280 entre 1,7–2,0) para critérios de prosseguir/não prosseguir.
- Alinhamento de Biomarcadores Traducionais: Facilita a redução de riscos mecanicistas ao vincular a expressão bacteriana dependente da condição do hospedeiro ao potencial invasivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a verificação de hipóteses na fase inicial de descoberta até a validação mecanicista em estudos pré-clínicos, permitindo leituras baseadas em RNA para confirmação de alvos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao isolar RNA de bactérias residentes no ceco murino sob condições imunes definidas.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios e saídas quantitativas por meio da espectrofotometria e confirmação da pureza e rendimento do RNA com o bioanalisador.
- Análises: Gera resultados mensuráveis (RIN, razões 260/280) que permitem a equipes multidisciplinares comparar a consistência do isolamento entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica utilizando um modelo de disseminação induzida por neutropenia, relevante para populações de pacientes imunocomprometidos.
- Reutilização Corporativa: Apresenta o protocolo como uma capacidade reutilizável para o isolamento de RNA de matrizes gastrointestinais desafiadoras em múltiplas campanhas de triagem de patógenos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos, redução da ambiguidade mecanicística na seleção de fatores de virulência.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade entre laboratórios por meio de etapas definidas de lise, extração e controle de qualidade.
- Valor Estratégico: Decisões de avançar/interromper mais precisas, eficiência do capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados em programas antiinfeciosos.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base em dados de interação com o alvo confirmados pela qualidade do RNA.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em segurança microbiológica, manipulação de RNA e técnicas de extração com fenol-clorofórmio.
- Requer instrumentação incluindo banhos de nitrogênio líquido, vórtex, centrífugas (4°C e temperatura ambiente), espectrofotômetros e bioanalizadores.
- Exige padronização entre equipes quanto ao tempo de lise, cuidado na separação de fases e consistência no tratamento com DNase.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes cargas bacterianas, carga fecal e viscosidade da amostra entre os sistemas modelo.
- Inclui limitações práticas, como a duração do processo de extração em múltiplas etapas e a dependência de uma rigorosa separação de fases para evitar contaminação.
