Name: Isolamento de RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizar o trato gastrointestinal Murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a isolar RNA de alta qualidade de Pseudomonas aeruginosa a partir de cecos murinos. Este método utiliza lise rigorosa e extração com fenol-clorofórmico ácido para análises de qPCR, perfil de transcrição e sequenciamento de RNA.

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Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede AI62983 (AYK), AI22535 (GPB).

1. Modelo murino de P. Colonização aeruginosa GI e Difusão <ol><li> Camundongos C3H/HeN (6-8 semanas de idade, do sexo feminino, Harlan) são tratadas com antibióticos orais para esgotar flora comensal e então mono-colonizados com PA como descrito anteriormente 4. </li></ol> 2. Colheita murino Cecal Conteúdo Luminal <ol><li> Mergulhe uma argamassa de aço inoxidável limpa em um banho de nitrogênio líquido. </li><li> Euthanize ratos por asfixia dióxido de carbono. </li><li> Carcaça de camundongo segura em uma placa de isopor e chuveiro com etanol a 95%. Faça uma incisão mediana longitudinal através da pele do esterno para o períneo. Refletir a pele e peritônio para expor a cavidade abdominal. </li><li> Ressecção do ceco inteiro. Segure o ceco com uma pinça sobre a argamassa de aço inoxidável. Snip ambas as extremidades do ceco com tesouras de dissecação. </li><li> Inserir uma ponteira P1000 cheia com 1 ml de tampão flushate cecal (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA e 200 mM NaCl) 5 na extremidade proximal do ceco. Liberar o buffer flushate cecal e conteúdo cecal luminal na argamassa de aço inoxidável. 1 ml de tampão flushate cecal será suficiente para a lavagem de todo o conteúdo cecal. Conteúdo cecal flushate irá congelar imediatamente após entrar em contato com a argamassa. </li><li> Moer o conteúdo flushate cecal com um pilão estéril. </li><li> Solo congelado lugar cecal conteúdo luminal em um tubo de polipropileno 50 ml submersa em um banho de gelo / etanol seco. </li><li> Repita os passos 2.2 a 2.7 para cada rato adicionais. </li><li> Armazenar a -80 ° C. </li></ol> 3. Isolamento de bactérias RNA <ol><li> Volume 1 quente (com base no volume final de dois cecal conteúdo luminal, cerca de 3 ml) de ácido fenol / clorofórmio (5:1, v / v) contido em um carvalho de 50 ml tubo de centrifugação cume com a tampa garantidos em parafilme em 65 · Banho de água C. </li><li> Ferva 0,5 volume de tampão de lise (2% SDS, 16 mM EDTA e 200 mM NaCl) 6 contida em um tubo de polipropileno 50 ml por 5 minutos. </li><li> Adicionar tampão de lise de ebulição para cecal conteúdo luminal. Homogeneizar. Ferva por 5 minutos com vortex periódica. </li><li> Adicione a 100 ° C conteúdo cecal / amostra de lise para a 65 ° C ácido fenol / clorofórmio no tubo de ensaio de Oak Ridge. Seal tampa com parafilme. </li><li> Incubar a 65 ° C por 10 minutos com vortex periódicas (a cada 2 minutos). </li><li> Centrifugar a 2.500 g de amostra a 4 ° por 15 minutos. </li><li> Transferir cuidadosamente fase aquosa (evitando qualquer da interface branco) para uma centrífuga de 50 ml fresco Oak Ridge. O volume da fase aquosa será de aproximadamente 50% do volume total do conteúdo cecal, tampão de lise e ácido fenol / clorofórmio. Adicionar um volume igual de ácido fenol / clorofórmio. </li><li> Seal tampa com parafilme e misturar bem em vórtice em alta velocidade. </li><li> Centrifugar a 2.500 g de amostra a 4 ° por 15 minutos. </li><li> Repita as etapas 3,7-3,9 até que não haja interface visível em branco entre as fases aquosa e orgânica. </li><li> Cuidado de transferência de fase aquosa a uma nova centrífuga 50 ml de Oak Ridge. Adicionar um volume igual de clorofórmio / álcool isoamílico (24:1, v / v). </li><li> Seal tampa e misture bem em vórtice. </li><li> Centrifugar a 2.500 g de amostra a 4 ° por 15 minutos. Remover fase aquosa (volume será de aproximadamente 50% do volume total da reacção) a 15 tubo de polipropileno ml cônico e adicionar um volume igual de isopropanol. </li><li> Incubar a -20 ° por pelo menos duas horas ou durante a noite. </li><li> Centrifugar a 2.500 g de amostra a 4 ° por 45 minutos. Um gel-like pellet formarão no fundo do tubo. Remover o sobrenadante. </li><li> Lave o pellet com 1 ml de etanol gelado 70%. Vortex. Centrífuga de amostra em menos 10.000 g a 4 ° por 5 minutos. </li><li> Remover o sobrenadante e inverter o tubo para deixar o pellet secar em temperatura ambiente por 10 minutos. </li><li> Ressuspender o sedimento em 200 mL de RNA de RNase água. </li></ol> 4. DNase Tratamento (Turbo DNA-Livre, a Applied Biosystems) <ol><li> Adicionar 20 mL de tampão 10X DNase Turbo e 2 l Turbo DNase e misture delicadamente. </li><li> Incubar a 37 ° por 20 minutos. </li><li> Adicionar 20 mL de reagente ressuspenso inativação DNase e misture bem. </li><li> Incubar 5 minutos à temperatura ambiente, mexendo ocasionalmente. </li><li> Centrifugar a 10.000 g à temperatura ambiente durante 1,5 minutos e transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga novo. </li><li> Adicionar um volume de ácido (4 º) frio de fenol / clorofórmio e misture bem em vortex por 1 minuto. </li><li> Centrifugar a 12.500 g à temperatura ambiente por 2 minutos. </li><li> Transferir a fase aquosa para um novo tubo e adicionar 1 volume de clorofórmio / álcool isoamílico (49:1 v / v), vórtice. </li><li> Centrifugar a 12.500 g à temperatura ambiente por 2 minutos. </li><li> Transferir a fase aquosa (aproximadamente 50% do volume total de reacção) para um novo tubo. </li><li> Adicionar 0,1 volume de acetato de sódio 3M, pH 5,5 e2,5 volumes de etanol gelado de 100%. Vortex. </li><li> Incubar a -20 ° por pelo menos 2 horas ou a -80 ° por 30 minutos. </li><li> Centrifugar a 12.000 g por 30 minutos a 4 ° </li><li> Remover o sobrenadante. </li><li> Lave o pellet com 1 ml de etanol gelado 70% por centrifugação por 5 minutos a 10.000 g a 4 °. </li><li> Remover o sobrenadante e secar o ar por 10 minutos. </li><li> Ressuspender o sedimento em 100 ml de RNase água. Pode precisar para colocar em banho-maria 65 ° a ressuspender e dissolver o sedimento. </li><li> Para testar a eficácia do tratamento DNase, um padrão de reação RT-PCR para a amplificação de uma proteína ribossomal (ou gene outra referência) poderia ser realizado para as amostras tratadas e não tratadas, utilizando qualquer controles RT. </li></ol> 5. RNA etapa de limpeza (Qiagen, RNeasy Kit) <ol><li> Consulte as páginas 56-57 da Qiagen RNeasy Mini Manual (4 ª Edição, Abril de 2006). Siga o caminho. </li></ol> 6. Resultados representante A quantidade de bactérias RNA total recuperado usando esse protocolo é de aproximadamente 2-3 mg de dois cecums. O RNA recuperado é de quantidade e qualidade suficientes para qPCR subseqüentes, perfis de transcrição, RNA e experimentos Seq. Pureza RNA é avaliada rotineiramente através da medição da relação de 260nm/280nm 7 da amostra, mas este método não fornece nenhuma informação sobre a integridade do RNA. O Bioanalyzer Agilent é uma plataforma microfluídica baseado para o dimensionamento, quantificação e controle de qualidade de DNA, RNA, proteínas e células, e utiliza uma métrica integridade RNA conhecido como RNA Número Integrity (RIN) 8. RNA extraído com este protocolo produz 260/280 proporções que variam 1,7-2,0 e valores RIN ≥ 7.0. Um exemplo de uma análise Bioanalyzer Agilent do RNA bacteriano recuperado por este protocolo é mostrado na Figura 1. <img src="/files/ftp_upload/3293/3293fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Agilent Bioanalyzer electroferograma e gel-como a imagem de Pseudomonas aeruginosa amostra de RNA total isolado e recuperado de murino conteúdo cecal. RIN 8.0.

<ol><li>Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+caused+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infections caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).</li>
<li>Bertrand, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endemicity%2C+molecular+diversity+and+colonisation+routes+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units.</a> Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+in+vivo+transcription+profiling+for+identifying+Pseudomonas+aeruginosa+genes+needed+for+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination.</a> PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).</li>
<li>Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+murine+model+of+gastrointestinal+colonization+and+dissemination+in+neutropenia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia.</a> Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).</li>
<li>Alexander, R. J., Raicht, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+total+RNA+from+human+stool+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of total RNA from human stool samples.</a> Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).</li>
<li>Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+gene+expression+detected+in+human+faeces+by+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR.</a> J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).</li>
<li>Manchester, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+UV+methods+for+measurement+of+protein+and+nucleic+acid+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations.</a> Biotechniques. 20, 968-970 (1996).</li>
<li>Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).</li>
<li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+gut+microbiome+in+obese+and+lean+twins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A core gut microbiome in obese and lean twins.</a> Nature. 457, 480-484 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de extração de RNA descrita aqui permite a recuperação de quantidades suficientes de alta qualidade Pseudomonas aeruginosa RNA total colhido a partir do trato GI murino. Este método não é restrito a P. aeruginosa e pode potencialmente ser aplicada a outras bactérias. A recuperação de microrganismos suficientes a partir do intestino irá variar significativamente de organismo para organismo. Em nosso modelo murino, P. aeruginosa tipicamente coloniza o trato GI murino em níveis entre 5 x 10 7 a 5 x 10 8 ufc / g fezes 4. Uma vez que o conteúdo recuperado cecal são aproximadamente 0,5 grama, o número estimado de P. aeruginosa recuperou de duas cecums está entre 5 x 7-5 x 10 10 8 ufc. Se outros microorganismos são utilizados, seria prudente para verificar os níveis de colonização GI e depois calcular o número de cecums necessário para recuperar o número alvo de ufc. Também é importante notar que, ao usar este modelo em particular murino, tratado com antibióticos camundongos não infectados com o PA tem nenhum valor quantificável de RNA isolado de seu conteúdo cecal. Nosso modelo murino de Pseudomonas aeruginosa gastrointestinal e as tentativas de divulgação para emular a patogênese de P. aeruginosa bacteremia em pacientes de câncer e transplante de células-tronco. Nesta população de pacientes, comensais da flora é muitas vezes esgotadas secundárias ao tratamento com antibióticos ou quimioterápicos (por exemplo, o esgotamento antibiótico de GI comensais flora), resultando em crescimento de micróbios patogênicos (por exemplo, mono-associação com P. aeruginosa) e posterior divulgação após a supressão imunológica. As vantagens e limitações deste modelo murino, já foram abordados anteriormente 4. O objetivo deste estudo é fornecer uma metodologia para isolar RNA total microbiana do trato GI. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para outros modelos murinos que estudam outros aspectos da patogênese microbiana no trato GI (ou seja, interações comensais flora, efeitos bacteriana na doença inflamatória intestinal, etc.) Uma vantagem deste método é a incorporação das etapas de lise múltiplos, incluindo congelamento / descongelamento, a perturbação mecânica (pulverização com argamassa / pilão homogeneização), fervendo, e lise química (por exemplo SDS). Apesar da multiplicidade de etapas de lise, alguns microorganismos (principalmente bactérias gram-positivas e fungos / leveduras) podem exigir a interrupção mecânica adicional. Após a lise quente / ácido fenol-clorofórmio de incubação (Passo 3.5), a adição de contas (0,1 mm para as bactérias e / ou 0,5-0,7 mm para levedura) e um passo-a bater talão subseqüentes deve ser suficiente para lisar estes 9 organismos, 10. Dada a natureza complexa de materiais recuperados a partir do ceco murino, o frio acid-phenol/chloroform repetidas extrações (Passo 3,7-3,9) são absolutamente necessários para atingir a qualidade aceitável RNA e integridade para outras reações a jusante. Entre 3-5 frio acid-phenol/chloroform extrações podem ser necessários antes que a interface branco entre as fases aquosa e orgânica é eliminada. Finalmente, a combinação de ambos o tratamento DNase (Etapa 4) e Protocolo de Limpeza RNeasy (Passo 5) são essenciais para a remoção de DNA contaminante e pequenas não mRNA (5s e tRNA). Como dito anteriormente, o RNA recuperado através da utilização deste protocolo é de quantidade e qualidade suficientes para posterior transcrição perfil 3, qPCR (não publicado), e Seq RNA (não publicado) experimentos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Almofariz e pilão </td><td> Pescador </td><td> 12-947-1 </td></tr><tr><td> Homogeneizador </td><td> Omni </td><td> TM-125 </td></tr><tr><td> Oak Ridge tubos de centrífuga (50 ml) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td></tr><tr><td> Ácido fenol / clorofórmio </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td></tr><tr><td> Clorofórmio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2432 </td></tr><tr><td> Álcool isoamílico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W205702 </td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 190764 </td></tr><tr><td> Dietil pyrocarbonate (DEPC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 40718 </td></tr><tr><td> DNase </td><td> Ambion </td><td> AM2238 </td></tr><tr><td> RNeasy Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> 3M acetato de sódio </td><td> Ambion </td><td> AM9740 </td></tr><tr><td> O etanol 100% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7023 </td></tr></tbody></table>

isolamento de rna pseudomonas aeruginosa colonizar o trato gastrointestinal murino

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) resultado infecções em significativa morbidade e mortalidade em hosts com sistemas imunológicos comprometidos, tais como doentes com leucemia, queimaduras graves, ou transplantes de órgãos 1. Em pacientes de alto risco para o desenvolvimento de infecções da corrente sanguínea PA, do trato gastrointestinal (TGI) é o principal reservatório para a colonização 2, mas os mecanismos pelos quais as transições de um micróbio PA colonização assintomática a uma invasivo, e muitas vezes mortal, patógeno não são claras. Anteriormente, foi realizada em experimentos in vivo perfis de transcrição, recuperando mRNA PA a partir de células bacterianas residentes no cecums de ratos colonizados 3, a fim de identificar mudanças na expressão gênica de bactérias durante a alterações do estado imunológico do hospedeiro. Como acontece com qualquer experiência de perfis de transcrição, o passo limitante da velocidade está no isolamento de quantidades suficientes de mRNA de alta qualidade. Dada a abundância de enzimas, detritos, resíduos de alimentos, e as partículas no trato gastrintestinal, o desafio do isolamento do RNA é assustador. Aqui, apresentamos um método para o isolamento fiável e reprodutível de RNA bacterianos recuperados do trato gastrointestinal de camundongos. Este método utiliza um modelo bem estabelecido murino de PA colonização GI e neutropenia induzida por difusão 4. Colonização, uma vez GI com PA for confirmada, os ratos são sacrificados e conteúdo cecal são recuperados e flash congelado. RNA é então extraído usando uma combinação de perturbação mecânica, ferver, fenol / clorofórmio extrações, tratamento de DNase, e cromatografia de afinidade. Quantidade e pureza são confirmadas por espectrofotometria (Nanodrop Technologies) e Bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig. 1). Este método de GI isolamento microbiano RNA pode ser facilmente adaptado para outras bactérias e fungos.

Um método confiável para o isolamento do RNA<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Recuperou de cecums murino é descrito. O RNA recuperado é de quantidade e qualidade suficientes para qPCR subseqüentes, perfis de transcrição, RNA e experimentos Seq. Esta técnica pode ser adaptada para o isolamento de RNA outros micróbios intestinais.

Isolamento de RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizar o trato gastrointestinal Murino

As infecções por Pseudomonas aeruginosa (PA) resultam em morbidade e mortalidade significativas em hospedeiros com sistemas imunológicos comprometidos, tais como pacientes com ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar o RNA total de Pseudomonas aerogen recuperado de ECMs murinos. Isso é realizado primeiramente colhendo o conteúdo luminal sequencial. Em seguida, o RNA bacteriano é isolado.Em seguida, realiza-se o tratamento com D'S e a purificação do RNA. Por fim, o RNA é quantificado e a pureza do isolado é verificada por análise em bioanalisador e por espectrofotometria. Assim, pode-se obter RNA bacteriano de qualidade e quantidade suficientes para avaliações experimentais subsequentes, como QPCR, análise de perfil de transcrição ou experimentos de sequenciamento de RNA.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a extração com triol, é que este método incorpora múltiplas etapas de lise em ácido extremamente rigoroso e etapas de extração com clorofórmio feminino para garantir RNA de alta qualidade. Uma demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas de lise e extração são difíceis de aprender, já que protocolos escritos omitem pequenos detalhes críticos para o sucesso. O procedimento será demonstrado por Eduardo Lopez Medina, pesquisador pós-doutorando, e Megan Neubauer, gerente do laboratório, ambos do meu laboratório. Antes de iniciar a coleta, IMSA limpa o almofariz de aço inoxidável em um banho de nitrogênio líquido.Em seguida, após eutanasiar um camundongo C3 HHEN colonizado com Pseudomonas aerogen de seis a oito semanas de idade, posicione o animal em posição supina sobre uma placa de isopor e higienize o abdômen com etanol 95%. A seguir, faça uma incisão longitudinal mediana através da pele, desde o esterno até o períneo. Então, retraiam-se a pele e o peritônio e expõe-se a cavidade abdominal.Agora resseque todo o ceco usando pinças. Segure o ceco sobre o almofariz de aço inoxidável e, em seguida, corte ambas as extremidades do ceco com tesoura de dissecação. Encha a ponteira de uma pipeta P 1000 com um mililitro de tampão Flush 8, e depois insira a ponteira na extremidade proximal do ceco.Lave o tampão Flush Oito e o conteúdo luminal do Sequel para dentro do almofariz de aço inoxidável. Agora triture o Sequel. Lave o conteúdo do Oito com uma pisão estéril.Em seguida, despeje etanol em um recipiente com gelo seco e coloque um tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros no banho de etanol com gelo seco. Transfira o conteúdo moído do lume congelado para o tubo cônico e armazene o tubo a menos 80 graus Celsius. Esta próxima série de etapas é a mais difícil do procedimento.Dada a natureza complexa dos materiais obtidos do ceco MI, as repetidas extrações com filóforma fria são absolutamente necessárias para alcançar uma separação aceitável; podem ser exigidas entre três e cinco extrações até que a interface ampla entre as fases aquosa e orgânica seja eliminada. Transfira um volume de fenol ácido com clorofórmio para um tubo de centrífuga Oak Ridge de 50 mililitros. Fixe a tampa com parafina e aqueça o tubo em banho-maria a 65 graus Celsius.Coloque metade do volume do tampão de lise em um tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros e, em seguida, ferva o tampão por cinco minutos. Após retirar o conteúdo luminal do sequenciador do armazenamento a menos 80 graus Celsius, aqueça brevemente o tubo com uma fricção rápida entre as mãos e, então, adicione o tampão de lise fervente ao tubo. Agite a mistura para homogeneizar a solução do conteúdo luminal SQL com o tampão de lise.Ferva o tampão de lise e o conteúdo luminal de SQL por cinco minutos. Com vortexação periódica, desvende o tubo de centrífuga Oak Ridge contendo a solução de fenol-clorofórmio e transfira a amostra de lise do conteúdo de SQL para o tubo. Em seguida, refeche a tampa com perfil e coloque o tubo novamente no banho-maria a 65 graus Celsius por 10 minutos, agitando o tubo a cada dois minutos.Centrifugue a amostra a 2.500 ×g durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo cônico de centrífuga Oak Ridge de 50 mililitros, evitando qualquer parte da interface branca. Então, adicione um volume igual de fenol clorofórmico ácido ao novo tubo.Selar a tampa com perfil e misturar bem o conteúdo por vortexamento do tubo em alta velocidade. Continuar centrifugando a amostra e transferir a fase aquosa para o tubo de centrífuga. Se o volume da fase aquosa superior ficar muito pequeno, pode-se transferi-lo para um tubo de diâmetro menor.Continue este processo até que não haja mais interface branca visível entre as fases aquosa e orgânica. Quando a interface branca desaparecer, transfira cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo cônico. Em seguida, adicione ao tubo um volume igual de clorofórmio e álcool isoamílico, feche a tampa e misture bem o conteúdo por vortexagem.Em seguida, após centrifugar a amostra novamente, transfira a fase aquosa para um tubo cônico de polipropileno de 15 mililitros e adicione um volume igual de isopropanol. Incube então a solução a menos 20 graus Celsius por pelo menos duas horas ou durante a noite. Após a incubação da amostra, centrifugue o tubo por 45 minutos.Após identificar o pellet com aspecto gelatinoso no fundo do tubo, remova o sobrenadante. Agora, lave o pellet com um mililitro de etanol a 70% gelado, agitando o tubo em vórtex, e em seguida centrifugue a amostra a 10.000 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Por fim, remova o sobrenadante e inverta o tubo para deixar o pellet secar ao ar à temperatura ambiente por 10 minutos.Em seguida, re-suspenda o pellet de RNA em 200 microlitros de água livre de RNAses. Primeiro, adicione 20 microlitros de tampão 10 x turbo DNA e dois microlitros de turbo DNAse ao tubo de microcentrífuga e misture a solução suavemente. Incube então o tubo a 37 graus Celsius por 20 minutos e, em seguida, adicione 20 microlitros do reagente de inativação de DNA re-suspendido ao tubo e misture bem.Agora, incube o tubo por mais cinco minutos à temperatura ambiente, com mistura ocasional. Em seguida, centrifugue o pellet em uma microcentrífuga a 10.000 ×g por 1,5 minuto e, então, transfira o sobrenadante para um novo tubo microfuge. Adicione um volume de fenol ácido clorofórmico frio ao pellet e, em seguida, misture completamente a solução por vortexagem durante um minuto.Após centrifugar a solução por dois minutos a 12.500 ×g, transfira a fase aquosa para um novo tubo e adicione um volume de clorofórmio-álcool isoamílico. Em seguida, homogeneíze a solução por vortex e, depois, centrifugue novamente sob as mesmas condições. Transfira a fase aquosa para um novo tubo microfuga.Em seguida, adicione 0,1 volume de acetato de sódio 3 M e 2,5 volumes de etanol a 100%, gelado. Agite o tubo em vórtex para homogeneizar. Incube a amostra a menos 80 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, após centrifugar a 12.000 × g durante 30 minutos a quatro graus Celsius, remova o sobrenadante. Por fim, lave o pellet com um mililitro de etanol a 70% gelado. Remova o sobrenadante e seque o pellet ao ar por 10 minutos.Em seguida, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de água livre de RNAses. O Agilent Bioanalyzer é uma plataforma baseada em microfluídica para dimensionamento, quantificação e controle de qualidade de DNA, RNA, proteínas e células, e utiliza uma métrica de integridade de RNA conhecida como número de integridade de RNA ou RIN-RNA. O RNA extraído com este protocolo produz razões A260/A280 variando de 1,7 a 2,0 e valores de RIN maiores ou iguais a 7,0.Um exemplo de eletroferograma de RNA bacteriano obtido no bioanalisador Agilent é mostrado aqui à esquerda, e uma imagem semelhante a um gel de *Pseudomonas arosa* recuperada de conteúdos intestinais de camundongos é mostrada aqui à direita. Após este procedimento, outros métodos como PCR quantitativa ou sequenciamento de RNA podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como perfis refinados de expressão gênica.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Morrill, S. R., et al. Modelos de colonização vaginal murina por bactérias cultivadas anaeróbicas. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra um protocolo para modelar a colonização vaginal em camundongos usando bactérias anaeróbicas resistentes a antibióticos. Começa com o tratamento hormonal para aumentar a suscetibilidade epitelial, seguido pela inoculação vaginal e co-inoculação em condições anaeróbicas. O procedimento termina com amostragem pós-inoculação e cultura para avaliar a...

Modelagem da colonização vaginal murina por bactérias anaeróbias

Fonte: Taylor, M. N., et.al. Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade nas interações Caenorhabditis elegans-bacterianas. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra a exposição de vermes Caenorhabditis elegans livres de germes e pareados por idade a uma cepa bacteriana para colonização intestinal. Explica a remoção seletiva de bactérias externas e não aderidas, deixando apenas bactérias viáveis aderidas ao epitélio intestinal para quantificação.

Avaliação da colonização bacteriana intestinal em C. elegans livre de germes

A colonização da nasofaringe murina com Streptococcus pneumoniae e a subsequente extração de células aderentes ou recrutadas é descrita. Esta técnica envolve a lavagem da nasofaringe e a coleta do fluido através das nares e é adaptável para várias leituras, incluindo quantificação celular diferencial e análise da expressão mRNA in situ.

Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

O wormsorter facilita telas genéticas em Caenorhabditis elegans, classificando vermes de acordo com a expressão de repórteres fluorescentes. Aqui, descrevemos um novo uso: triagem de acordo com a colonização por um patógeno expressando GFP, e empregá-lo para examinar o papel mal compreendida de reconhecimento do patógeno em iniciar respostas imunes.

A separação automática de<em&gt; C. elegans</em&gt; Variably Colonizada por um patógeno bacteriano

Aqui, é descrito um procedimento para o estabelecimento de uma infecção sistémica no rato neonatal com culturas de Escherichia coli K1. Este procedimento não-invasivo permite a colonização do tracto gastrointestinal, a translocação do agente patogénico para a circulação sistémica, e invasão do sistema nervoso central no plexo coróide.

Modelo não-invasiva da neuropatogênicos Escherichia coli Infecção no Rato Neonatal

Um protocolo detalhado de um modelo de mouse para enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) colonização usando bactérias bioluminescência-etiquetado é apresentado. A detecção destas bactérias bioluminescentes por um não-invasivo na vivo sistema de animais vivos de imagem pode avançar nossa compreensão atual da colonização de EHEC.

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

Este protocolo descreve um método simples de isolar células epiteliais única, infectados-bexiga de um modelo murino de infecção do trato urinário.

Isolamento de comunidades de bacterianas intracelulares único gerado a partir de um modelo murino de infecção do trato urinário para análise de célula única a jusante

Aqui, descrevemos um protocolo simples e reproduzível do modelo de infecção do rato para avaliar a atenuação das cepas geneticamente modificadas de Pseudomonas aeruginosa em comparação com os Estados Unidos Food and Drug Administration (FDA) aprovado Escherichia coli para aplicações comerciais.

Geração de mutantes de deleção de genes no quadro em Pseudomonas aeruginosa e testes para atenuação de virulência em um modelo simples de infecção por camundongos

Um modelo de camundongos de uropatogenic E. coli (UPEC) inoculação transuretral para estabelecer reservatórios de bexiga intracelular latente e subsequente exposição à bexiga a G. vaginalis para induzir a UTI UPEC recorrente é demonstrado. Também são demonstradas a enumeração de bactérias, citologia urinária, e fixação e processamento in situ bexiga para a varredura de microscopia eletrônica.

Infecção recorrente do trato urinário de Escherichia coli desencadeada por gardnerella vaginalis exposição bexiga em camundongos

Este protocolo descreve as etapas necessárias para a colonização de camundongos com pks+ Escherichia coli em condições não inflamatórias, bem como métodos não invasivos para validação da colonização e avaliação da expansão de pks+ E. coli nas fezes.

Colonização com Escherichia coli de Murine pks+ Escherichia coli sob condições não inflamatórias

Aprenda a isolar RNA de alta qualidade de Pseudomonas aeruginosa a partir de cecos murinos. Este método utiliza lise rigorosa e extração com fenol-clorofórmico ácido para análises de qPCR, perfil de transcrição e sequenciamento de RNA.

Isolamento de RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizar o trato gastrointestinal Murino

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