Name: Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: Aprenda a visualizar crawling intraluminal de neutrófilos, migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular cremaster de camundongo usando microscopia intravital em campo claro. Este protocolo permite estudar interações dinâmicas entre neutrófilos e células endoteliais durante o recrutamento in vivo.

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Este trabalho foi financiado por uma bolsa de investigação da Canadian Institutes of Health Research (CIHR, MOP-86749). L. Liu é um receptor de CIHR New Investigator Award (MSH-95374).

1. Preparação de quimioatraente em gel de agarose <ol><li> Pipeta de 10 mL de 2 × PBS em um tubo cônico de 50 ml, e aquecer o tubo colocando-o em um copo contendo água quente. </li><li> Pipetar 10 mL de água destilada e adicionar 0,4 g de pó de agarose em outro tubo cônico de 50 mL (com a tampa ligeiramente soltos) e aquecer a mistura ferver até ficar em um forno de microondas (por 1 min ~ em um forno de microondas 700-watt) . </li><li> Adicione o aquecido 2 × PBS para a solução de agarose tubo, redemoinho solução mista e mantê-lo aquecido no copo de água quente. </li><li> Micropipeta solução chemoattractant (por exemplo, 10 ml de 0,5 mg de CXC quimiocinas MIP-2 ou 12 mL de uma WKYMVm mM) na tampa de um tubo Eppendorf de 1,5 mL contendo 3 mL de tinta da Índia e misture bem por aspiração utilizando uma micropipeta (evitar bolha de ar). </li><li> Corte a extremidade da ponta de uma pipeta de 200 mL e 110 mL micropipeta de agarose solução (42 ° C) na tampa e imediatamente misture bem utilizando outra ponta da pipeta (evitar bolhas de ar). </li><li> Armazenar o gel chemoattractant contendo a +4 ° C. </li></ol> 2. Preparação de músculo Cremaster para Microscopia intravital (Figura 1) <ol><li> Anestesiar um rato macho adulto por uma injeção ip de uma mistura de xilazina 10 mg / kg e 200 mg de cloridrato / kg cetamina. </li><li> Raspar a área ao longo da veia jugular externa direita e face anterior do escroto com um barbeador elétrico. Após a anestesia, é importante dar atenção e cuidados especiais para o rato anestesiado. A lâmpada de calor pode ser usado para impedir o mouse de hipotermia. O mouse deve estar livre de dor reflexa. </li><li> Faça uma incisão horizontal, encontrar e cateterização da veia jugular utilizando um tubo PE-10 preenchido com solução salina com heparina 100 U / mL. Cateterismo da veia jugular é necessário para a administração de anestésicos e medicamentos adicionais, quando necessário. </li><li> Fixar as pernas traseiras do mouse com fita umbilical com o mouse deitado de barriga para cima em um home-made bordo do músculo cremaster (Figura 1). </li><li> Conectar a placa para um circulador de água 37 ° C para manter o músculo cremaster eo corpo do mouse quente. </li></ol> Nota: Todos os procedimentos 2,6-2,14 deve ser realizada muito gentilmente 5. <ol start="6"><li> Faça uma incisão na pele escrotal para expor o músculo cremaster esquerda. Dissecar cuidadosamente o músculo da fáscia associados. </li><li> Superfuse o músculo cremaster com 37 ° C-aquecido bicarbonato-buffered saline (131,9 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO 4, 20 NaHCO 3, em mM, pH 7,4) usando uma bomba peristáltica. </li><li> Amarre uma sutura 4-0 para a extremidade distal do músculo cremaster para segurá-la para baixo sobre o pedestal de vidro clara visualização da placa do músculo cremaster. </li><li> Cauterizar o músculo cremaster longitudinalmente. Com sutura 4-0, mantenha o plano muscular e fixá-lo ao longo das bordas sobre o pedestal. Separar o testículo e epidídimo do músculo subjacente e movê-los para dentro da cavidade abdominal. </li><li> Superfuse o músculo em ~ 0,6 ml / min com o tampão de perfusão 37 ° C-aquecido e cobrir o músculo exposto com uma lamela de vidro 22 × 22 mm. </li><li> Coloque a placa do músculo cremaster no palco microscópio, examine o músculo sob o microscópio, encontrar uma vênula adequado postcapillary (Selecione a vênula que é reto e não ramificados e tem taxa de cisalhamento normal e um diâmetro de 25-40 mm) e ajustar a câmera de vídeo para permitir a vênula para ser visualizado em uma posição vertical em ambos os lados esquerdo ou direito do monitor de TV. </li><li> Após 30 min de equilíbrio, a gravar as imagens de vídeo da vênula selecionados postcapillary por 5 min como dados de base de controle utilizando um gravador de vídeo. </li><li> Parar o superfusão e retire a lamínula sobre o músculo. </li><li> Coloque um ~ 1-3 mm de tamanho gel chemoattractant contendo na superfície do músculo cremaster em uma área pré-selecionadas 350 mM de e paralela à vênula observado postcapillary, adicione lamela para segurar o gel no local e superfuse o tecido muscular em muito ritmo lento (≤ 10 mL / min) para permitir o estabelecimento de um gradiente de chemoattractant que é liberada lentamente e formado a partir do gel. </li><li> Gravar a imagem de vídeo de 90 min após a adição do gel contendo chemoattractant. Durante a gravação, ajustar e manter o foco microscópio sobre a aderir, rastejando, transmigrando e chemotaxing leucócitos dentro da vênula e no tecido muscular. </li><li> Após a experiência, importe o arquivo de vídeo para um computador para análise. </li></ol> 3. Rastreamento de células Usando ImageJ <ol><li> Em um computador, extrair e converter o vídeo para o formato AVI (por exemplo, use software livre bitRipper computador para converter vídeo de DVD para arquivos AVI). </li><li> Use software de edição de vídeo para gerar o filme tempo decorrido. Por exemplo, use o Windows Movie Maker para fazer um filme tempo decorrido (até 1 / 512 ou 1 / 1024 tempo-lapsot taxa de 30 fps) a partir do original, vídeo em tempo real. Converter e salvar o filme tempo decorrido sem compressão de DV-AVI formato. </li><li> Gravar as imagens de um micrômetro de calibração sob o microscópio mesma configuração, importar imagens para o computador, abra as imagens com ImageJ. No ImageJ, o total de pixels aparecem no canto superior esquerdo da tela (por exemplo, 720 × 480 pixels). Medir o tamanho da tela em ambos os eixos X e Y (por exemplo, 200 × 150 mm). A partir daí, calcular o número de pixels por M (por exemplo, x = 720 / 200 = 3,6 pixels / M, e y = 480 / 150 = 3,2 pixels / mm). </li><li> Para importar o filme, abra ImageJ novamente, clique em "File-Import-Usando Movies Quicktime Plug-in", selecionar o filme a ser analisado e clique em "OK" na interface de "abridor de Filme QT". </li><li> Clique em "Rastreamento Plugins-Manual" para rastrear células. Preencha as informações relevantes para os campos no fundo antes de iniciar o rastreamento. Brevemente, <ol><li> Intervalo de tempo (em seg) = fold-time-lapse/30 (Por exemplo, um 1020 × lapso de tempo seria 1020-1030 = 34 intervalo de seg / frame). </li><li> x / y = calibração da medição M / pixel usando a calibração da imagem do micrômetro. </li><li> z = 0 calibração (como o mouse músculo cremaster é uma camada extremamente fina de tecidos e células rastejando e migração são aproximadamente 2D sob brilhante-campo transiluminação). </li><li> Pesquisa tamanho quadrado para centrar = 1. </li><li> Dot size / Linha de largura / Tamanho da fonte: eles podem ser ajustados se necessário. </li></ol></li><li> Selecione um ponto estável e claro como um ponto de referência. Este ponto de referência pode ser qualquer ponto claro e pequenas estruturais que permanece inalterado e estável durante todo o experimento. Clique em "Add Track" para rastrear o ponto de referência do primeiro ao último frame e clique em "Track End". Os dados aparecem na tabela de resultados automaticamente. </li><li> Acompanhar o rastreamento ea migração de neutrófilos, um por um: clique em "Add Track" para rastrear o celular de sua aparência no tecido ao seu desaparecimento em cada quadro e clique em "Track End" para finalizar e salvar os resultados no Microsoft Excel. </li></ol> 4. Análise dos Parâmetros recrutamento de neutrófilos <ol><li> Abra o arquivo de resultados no Microsoft Excel, e analisar os dados (se as mudanças de ponto de referência em análise). </li><li> Rastejando intraluminal <ol><li> Rastreamento de distância: a distância total da célula rasteja no lúmen do site inicial aderente ao site a transmigração ideal (m). </li><li> Crawling velocidade: rastreamento de distância / tempo (mM / min). </li></ol></li><li> Migração transendotelial <ol><li> Transmigração tempo: a partir do momento da célula começa a transmigrar através do endotélio ao tempo em que o corpo da célula toda é apenas fora da vênula e nenhum corpo celular pode ser visto no lúmen (min ou seg.) </li><li> Tempo de descolamento: a partir do momento em que o corpo da célula toda é apenas fora da vênula (imediatamente após a transmigração) para o ponto no tempo quando a célula perde o contato com a vênula (o retrai cauda) (min ou seg.) </li></ol></li><li> Quimiotaxia em tecido <ol><li> Distância de migração: a soma da distância da célula se move a partir do ponto inicial ao ponto final da migração no tecido (mm). </li><li> Velocidade de migração: a distância de migração no tecido / hora (mM / min). </li><li> Quimiotaxia distância: a soma de células a distância migra no eixo-x no tecido (mm). </li><li> Velocidade de quimiotaxia: quimiotaxia distância / tempo (mM / min). </li><li> Quimiotaxia índice: a taxa de dividir a distância quimiotaxia pela distância de migração no tecido. </li></ol></li></ol> 5. Resultados representativos: Embora bightfield microscopia intravital é utilizado para o estudo das interações leucócito-endotélio celular e não podem ser necessariamente para os neutrófilos, que confirmou que, por nossos estudos de histologia, mais de 95% das células recrutadas em neutrófilos tratados com músculos chemoattractant cremaster foram de fato neutrófilos . Neste relatório, usando neutrófilos seletivo quimioatrativos, apresentamos os procedimentos de monitoramento do recrutamento de neutrófilos in vivo. Especificamente, nós descrevemos um protocolo de rastreamento rastreamento de neutrófilos intraluminal, a migração transendotelial, e quimiotaxia em cremaster tecido muscular em ratos anestesiados com lapso de tempo de microscopia intravital de vídeo e ImageJ. O chemoattractant contendo gel agarose no músculo cremaster libera lentamente chemoattractant e permite um gradiente chemoattractant a ser estabelecida no tecido. Chemoattractant neutrófilos induz interações neutrófilos-célula endotelial em cremastérico vênulas pós-capilares em camundongos. Todo o experimento é visualizado sob um microscópio de campo claro vertical intravital com imagens de vídeo projetadas por uma câmera de vídeo de cor para um monitor de TV e gravado por um gravador de vídeo. Nós determinamos os neutrófilosrastejando intraluminal, a migração transendotelial e migração e quimiotaxia em tecido muscular em resposta à neutrófilos chemoattractant MIP-2 e WKYMVm preparada em gel de agarose (Figura 2). Descobrimos que MIP-2 (0,5 mM) e WKYMVm (0,1 mM) provocou rastejando intraluminal de neutrófilos em velocidade similar, a migração de neutrófilos transendotelial e desprendimento da vênula de comprimento comparável de tempo, a migração de neutrófilos e quimiotaxia no tecido muscular em quase a mesma velocidade e com índices similares quimiotaxia de neutrófilos (P&gt; 0,05, teste t de Student). <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A ilustração esquemática de um sistema de microscópio intravital. O mouse músculo cremaster é exteriorizado no pedestal visualização clara de cremaster bordo muscular no palco microscópio e superfused com 37 ° C-aquecido bicarbonato tampão salina. O microscópio na posição vertical é conectado com uma câmera de vídeo CCD de cor para brightfield microscopia intravital. A profunda monocromática CCD refrigerado a câmera digital também é conectado à porta microscópio de fluorescência para microscopia intravital, as imagens a partir do qual são diretamente processados ​​por um computador. <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Neutrófilos parâmetros recrutamento de brightfield microscopia intravital. Recrutamento de neutrófilos foi induzida pela liberação gradual de chemoattractant neutrófilos MIP-2 ou WKYMVm na preparação gel agarose colocados 350 mM adjacente à vênula postcapillary. Tempo decorrido dados de vídeo foram analisadas pelo ImageJ após o processamento da gravação de vídeo em tempo real do experimento. Neutrófilos rastejando intraluminal (A), o tempo de transmigração e tempo de descolamento (B), velocidade de migração e velocidade de quimiotaxia em tecido (C), e índice de quimiotaxia em cremaster muscular (D) foram determinados após a administração de MIP-2 ou agarose gel em WKYMVm cremaster muscular em camundongos C57BL / 6 (n = 3, # de células rastreado = 22 (em A e B) e 27 (em C e D), respectivamente, para MIP-2, e = 26 (em A e B) e 44 ( em C e D), respectivamente, para WKYMVm).

<ol><li>Liu, L., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+leukocyte+recruitment%3A+organ-specific+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action.</a> Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).</li>
<li>Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+leukocyte+recruitment%3A+an+in+vivo+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective.</a> J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).</li>
<li>Phillipson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+crawling+of+neutrophils+to+emigration+sites%3A+a+molecularly+distinct+process+from+adhesion+in+the+recruitment+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade.</a> J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).</li>
<li>Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulators+of+leucocyte+chemotaxis+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation.</a> Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li>
<li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entering+the+Portal%3A+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Imaging+Cellular+and+Molecular+Biological+Functions%22%5BJournal%5D)">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li>
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<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li>
<li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+accelerates%2C+but+is+not+required+for%2C+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Microscopia intravital é a ferramenta essencial para revelar os mecanismos celulares e moleculares do recrutamento de leucócitos durante a inflamação. Visualização quantitativa para a determinação das interações leucócito-endotélio celular na microvasculatura de tecidos translúcido como o músculo cremaster e mesentério continua sendo o padrão ouro para a aplicação da técnica 1,5. A microscopia intravital convencionais brightfield tem muitas características únicas técnicas e os mecanismos de recrutamento revel...

Tabela: materiais, reagentes e equipamentos específicos <table border="1"><tr><td> Nome do reagente / equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Tubos de polietileno, PI10 </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427401 </td><td> ID 0,28 milímetros × 0,61 milímetros OD </td></tr><tr><td> Nanquim </td><td> Speedball Art </td><td> Super Preto </td><td> Pigmentos de carbono não 100% preto corantes </td></tr><tr><td> Cautério </td><td> Aaron Medical </td><td> AA03 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Bayer HealthCare, Bayer Inc. </td><td> DIN 02169592 </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de cetamina </td><td> Bioniche Animal Health Canada, Inc. </td><td> DIN 01989529 </td><td></td></tr><tr><td> MIP-2 recombinante murino </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 452-M2 </td><td></td></tr><tr><td> WKYMVm </td><td> Phoenix Pharmaceuticals, Inc. </td><td> 072-12 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td> Ultrapura </td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Sigma </td><td> H-3393 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio vertical </td><td> Olimpo </td><td> BX61WI </td><td></td></tr><tr><td> Câmera de vídeo 3CCD cor </td><td> SONY </td><td> DXC-990 </td><td></td></tr><tr><td> HD-DVD gravador de vídeo </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> RH398H-M </td><td></td></tr><tr><td> Monitor de TV </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> 22LG30 </td><td></td></tr><tr><td> Circulador de água </td><td> Thermo Scientific </td><td> DC10 HAAKE </td><td></td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Gilson; Pharmacia </td><td> Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 </td><td></td></tr><tr><td> Cremaster bordo muscular </td><td> Universidade de Saskatchewan </td><td></td><td> Home-made </td></tr></table>

rastreamento crawling neutrófilos intraluminal, migração transendotelial e quimiotaxia em tecido por microscopia intravital vídeo

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

O recrutamento de leucócitos circulantes do fluxo de sangue para o tecido inflamado é um processo crucial e complexa de 1,2 inflamação. No vênulas pós-capilares do tecido inflamado, leucócitos inicialmente tether and roll na superfície luminal da parede venular. Rolando prisão leucócitos no endotélio e passam por adesão firme em resposta a quimiocina ou quimioatrativos outros na superfície venular. Muitos leucócitos aderentes mudar a partir do site inicial de adesão ao site extravasamento juncional no endotélio, um processo denominado intraluminal rastejando 3. Após rastreamento, os leucócitos movem-se através do endotélio (transmigração) e migrar no tecido extravascular em direção à fonte de chemoattractant (quimiotaxia) 4. Microscopia intravital é uma ferramenta poderosa para a visualização de interações leucócito-endotélio celular in vivo e revelando os mecanismos celulares e moleculares do recrutamento de leucócitos 2,5. Neste relatório, nós fornecemos uma descrição completa do uso de microscopia intravital brightfield de visualizar e determinar os processos detalhados de recrutamento de neutrófilos em camundongos músculo cremaster em resposta ao gradiente de uma chemoattractant neutrófilos. Para induzir o recrutamento de neutrófilos, um pequeno pedaço de gel de agarose (~ 1-3 mm de tamanho) contendo chemoattractant neutrófilos MIP-2 (CXCL2, uma quimiocina CXC) ou WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-Met-D, um análogo sintético de peptídeo bacteriana) é colocado no tecido muscular adjacente à vênula observado postcapillary. Com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e computador software ImageJ, neutrófilos no endotélio rastejando intraluminal, a migração de neutrófilos e transendotelial a migração e quimiotaxia em tecido são visualizados e monitorados. Este protocolo permite a análise quantitativa confiável e de muitos parâmetros, tais como o recrutamento de neutrófilos velocidade rastejando intraluminal, o tempo de transmigração, tempo de descolamento, a velocidade de migração, a velocidade de quimiotaxia e índice de quimiotaxia em tecido. Nós demonstramos que a utilização deste protocolo, estes parâmetros recrutamento de neutrófilos pode ser determinado e de forma estável a locomoção única célula convenientemente monitorados in vivo.

Nós descrevemos um protocolo de brightfield microscopia intravital para medir a dinâmica interações neutrófilos-célula endotelial durante o recrutamento de neutrófilos em resposta à fonte de um chemoattractant neutrófilos in vivo. Neutrófilos rastejando intraluminal, a migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular do rato cremaster são visualizados com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e rastreados com ImageJ.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

O recrutamento de leucócitos circulantes da corrente sanguínea para o tecido inflamado é um processo crucial e complexo da inflamação1,2. No...

O objetivo geral deste protocolo é utilizar microscopia de campo claro, microscopia intravital e fotografia de vídeo com lapso de tempo para estudar as interações dinâmicas entre neutrófilos e células endoteliais durante o recrutamento de neutrófilos em resposta a um quimioatraente de neutrófilos in vivo. Neste vídeo, demonstramos os procedimentos para utilizar a microscopia de vídeo intravital em campo claro a fim de visualizar e determinar a migração intraluminal de neutrófilos, a migração transendotelial e a quimiotaxia no tecido muscular esquelético do camundongo. O recrutamento de leucócitos é a característica marcante da inflamação.Esse processo de recrutamento inicia-se quando os leucócitos na corrente sanguínea começam a rolar sobre o endotélio dos vênulas pós-capilares no local da inflamação. Em resposta a quimiocinas ou outros quimioatraentes na superfície endotelial, esses leucócitos em rolamento param e aderem firmemente ao endotélio. Após a adesão, muitos leucócitos migram sobre a superfície luminal e parecem procurar um sítio ideal para transmigração.Após a migração dos leucócitos rastejantes através do endotélio, um processo denominado migração transendotelial. Poste

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, descrevemos um método não invasivo de dois fótons abordagem microscopia (2P) para estudo de leucócitos homing na pata do rato. Discutimos os aspectos técnicos de nossa preparação tissular e andar o leitor através de um experimento típico de configuração inicial para coleta de execução e de dados.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Este artigo primeiro descreve um procedimento para isolar células endoteliais humanas a partir de veias umbilicais e, em seguida, mostra como usar estas células para examinar transmigração de neutrófilos em condições de escoamento. Ao utilizar uma câmara de fluxo de baixo volume feita a partir de um polímero com as características ópticas do vidro, ao vivo de células imagem fluorescente de populações de células raras é também possível.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Os leucócitos atravessam a monocamada endotelial utilizando o paracelular ou o percurso intracelular. Foi desenvolvido um ensaio simples para seguir a distribuição de juncional endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de leucócitos sob fluxo fisiológico para discriminar entre as duas vias de transmigração.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Este protocolo atual emprega repórteres fluorescentes, marcação in vivo e técnicas de imagem intravital para permitir o monitoramento do processo dinâmico de priming de neutrófilos em animais vivos.

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

Aqui, mostramos como realizar microscopia intravital em venulos pós-capilar esfarelados do músculo cremaster do rato. Comumente aplicada a diferentes modelos de inflamação e sepse, particularmente aqueles induzidos por quimiocinas e citocinas, destacamos sua relevância no estudo de muscolopatias envolvendo infiltração exagerada de leucócitos musculares.

Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital

Aqui descrevemos métodos usando microscopia de tempo-lapso, contraste de fase para macrófagos peritoneal residentes em camundongos em um gradiente c5a complementar quimático. Os protocolos podem ser estendidos a outras células imunes.

Imagem em lapso de tempo de Quimioterapia de Macrophage mouse

A migração de neutrófilos depende da remodelação rápida e contínua da membrana plasmática em resposta ao quimioatraente e suas interações com o microambiente extracelular. Descrito aqui é um procedimento baseado em Microscopia Subcelular Intravital para investigar a dinâmica de remodelação da membrana em neutrófilos injetados na orelha de camundongos anestesiados.

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Este protocolo fornece um método de isolamento primário de células T murinas e microscopia de lapso de tempo da migração de células T sob condições ambientais específicas com análise quantitativa.

Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias

A imagem in vivo das articulações é uma técnica valiosa para descobrir o comportamento migratório dos leucócitos e a dinâmica molecular dentro das articulações inflamadas. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para imagens in vivo das articulações usando um modelo murino da artrite induzida por colágeno tipo II (CIA).

In vivo Imagens revelam o comportamento migratório dos leucócitos dentro das articulações

Aprenda a visualizar crawling intraluminal de neutrófilos, migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular cremaster de camundongo usando microscopia intravital em campo claro. Este protocolo permite estudar interações dinâmicas entre neutrófilos e células endoteliais durante o recrutamento in vivo.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo (Vídeo) | JoVE Journal

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

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