Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

O objetivo geral deste protocolo é utilizar microscopia de campo claro, microscopia intravital e fotografia de vídeo com lapso de tempo para estudar as interações dinâmicas entre neutrófilos e células endoteliais durante o recrutamento de neutrófilos em resposta a um quimioatraente de neutrófilos in vivo. Neste vídeo, demonstramos os procedimentos para utilizar a microscopia de vídeo intravital em campo claro a fim de visualizar e determinar a migração intraluminal de neutrófilos, a migração transendotelial e a quimiotaxia no tecido muscular esquelético do camundongo. O recrutamento de leucócitos é a característica marcante da inflamação.

Esse processo de recrutamento inicia-se quando os leucócitos na corrente sanguínea começam a rolar sobre o endotélio dos vênulas pós-capilares no local da inflamação. Em resposta a quimiocinas ou outros quimioatraentes na superfície endotelial, esses leucócitos em rolamento param e aderem firmemente ao endotélio. Após a adesão, muitos leucócitos migram sobre a superfície luminal e parecem procurar um sítio ideal para transmigração.

Após a migração dos leucócitos rastejantes através do endotélio, um processo denominado migração transendotelial. Posteriormente, os neutrófilos migram pelo tecido extravascular em direção à fonte do quimioatraente no local inflamatório, um processo chamado quimiotaxia MOIs. Este vídeo mostra o experimento de como utilizar a vídeo microscopia intra-vital em campo claro, fotografia microscópica com lapso de tempo e o ImageJ para visualizar, rastrear e determinar o rastejamento intraluminal de neutrófilos, a migração transendotelial e a migração em quimiotaxia no tecido muscular Oma, bem como a resposta à fonte de um quimioatraente para neutrófilos.

Olá, sou Lis Liu do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade de Saskatchewan. Hoje vamos mostrar como preparar o quimiotrante de neutrófilos em gel de agarose. Como preparar o músculo retractor do camundongo para microscopia intravital.

Como rastrear o movimento celular utilizando MEGJ. E, finalmente, como analisar os parâmetros de recrutamento de neutrófilos, dois estudantes de pós-graduação em nosso laboratório, ngel Naja, sh, e Chile mostrarão a vocês os procedimentos experimentais detalhados. Olá, sou Naja Sh. Olá, sou Chile.

Para iniciar este experimento, prepare o quimiotático para neutrófilos em gel de agarose primeiro pipetando 10 mililitros de PBS duas vezes em um tubo cônico de 50 mililitros. Aqueça o tubo colocando-o em um béquer contendo água quente. Pipete 10 mililitros de água destilada.

Adicione 0,4 gramas de pó de aros e outros 50 mililitros em um tubo cônico. Aqueça a mistura até a ebulição em um forno de micro-ondas para obter 2% de agros em PBS. Adicione duas vezes o PBS morno ao tubo com a solução de agro.

Agite a solução mista e mantenha-a aquecida no béquer com água quente. Misture bem a solução de quimioatraente com três microlitros de tinta nanquim na tampa de um tubo eppendorf de 1,5 mililitro. Evite formar uma bolha de ar durante a mistura.

Corte a extremidade de uma ponteira de pipeta de 200 microlitros e pipete 110 microlitros de solução agro a 42 graus Celsius na tampa, misturando bem imediatamente. Usando outra ponteira de pipeta, armazene este gel contendo o quimioatraente na geladeira até o uso. Anestesie um camundongo macho adulto por injeção intraperitoneal de uma mistura de xilazina e cetamina.

Depile a área sobre a veia jugular externa direita e a face anterior do escroto com uma lâmina elétrica após a anestesia. É importante ter atenção e cuidado especiais com o camundongo anestesiado. Uma lâmpada de aquecimento pode ser usada para evitar que o camundongo entre em hipotermia.

O camundongo deve estar livre de reflexo de dor. Faça uma incisão horizontal, localize e canule a veia jugular usando um tubo PE 10 preenchido com solução salina heparinizada a 100 unidades por mililitro. Conecte a placa a um circulador de água a 37 graus Celsius para manter o músculo cremaster e a maior parte do corpo aquecidos.

Fixe as patas traseiras do camundongo com tiras de umbilical, mantendo a face mais voltada para cima sobre a placa do músculo cremaster. Faça uma incisão na pele escrotal para expor o músculo cremaster esquerdo. Disseque cuidadosamente o músculo da fáscia associada.

Superfuse o músculo cremaster com solução salina tampão bicarbonato aquecida a 37 graus Celsius. Amarre uma sutura 4.0 na extremidade distal do músculo cremaster para mantê-lo fixado sobre o pedestal de vidro transparente da placa do músculo cremaster. Cauterize o músculo cremaster longitudinalmente com um bisturi elétrico e uma sutura 4-0.

Mantenha o músculo plano e fixe-o pelas bordas no suporte. Separe o testículo e o epidídimo do músculo subjacente e mova-os para a cavidade abdominal. Adicione uma fina camada de graxa a vácuo nas bordas opostas de uma lamínula de vidro de 22 por 22 milímetros.

Em seguida, cubra o músculo exposto com a lamínula de vidro. Coloque a placa-mestre do músculo na platina do microscópio. Examine o músculo ao microscópio e localize uma vênula pós-capilar adequada.

Selecione o vaso que apresenta uma taxa de cisalhamento normal e um diâmetro entre 25 e 40 micrômetros. Ajuste a câmera de vídeo para permitir que o vaso seja visualizado em posição vertical em qualquer uma das extremidades, direita ou esquerda, do monitor de TV. Após 30 minutos, grave as imagens de vídeo do vaso pós-capilar selecionado como dados de controle basais utilizando um dispositivo gravador de vídeo, como um gravador de DVD.

Esta é a imagem de vídeo controle de linha de base do vaso pós-capilar. Antes de posicionar o gel contendo o quimiotático sobre a superfície do músculo cremaster, interrompa a superfusão e remova a lamínula de vidro sobre o músculo. Fure um gel contendo quimiotático de tamanho um milímetro cúbico da tampa do tubo eppendorf. Utilizando a extremidade cortada de uma ponteira de pipeta de 200 microlitros, posicione o gel contendo quimiotático, previamente furado, sobre a superfície do músculo cremaster em uma área previamente selecionada, a 350 micrômetros do vaso pós-capilar observado.

Adicione uma lamínula para manter o gel no lugar e superfuse o tecido muscular em uma taxa muito lenta, menor ou igual a 10 microlitros por minuto, para permitir o estabelecimento de um gradiente de quimioatraente que é lentamente liberado e formado a partir do gel. Grave a imagem em vídeo por 90 minutos após a adição do gel contendo o quimioatraente. Durante a gravação, ajuste e mantenha o foco do microscópio sobre os leucócitos aderidos, rastejantes, transmigrando e quimiotaxando dentro da vênula e no tecido muscular.

Após o experimento, importe o arquivo de vídeo para um computador. Para análise no computador, extraia e converta o vídeo para o formato VI. Por exemplo, utilize um software gratuito de computador, como o bit ripper, para converter o vídeo de DVD para um arquivo A VI.

Utilize um software de edição de vídeo, por exemplo, o Windows Movie Maker, para criar um filme em lapso de tempo a partir do vídeo original em tempo real, converta e salve o filme em lapso de tempo no formato DV AVI. Registre as imagens do micrômetro de calibração com as mesmas configurações do microscópio. Importe as imagens para o computador.

Abra as imagens com o ImageJ. Meça o tamanho da tela nos eixos x e y e calcule o número de pixels por micrômetro. Para importar o vídeo, abra o ImageJ novamente. Clique em Arquivo, depois em Importar usando o plugin QuickTime Movies, selecione o vídeo a ser analisado e clique em OK na interface do QT Movie Opener. Em seguida, clique em Plugins. Rastreamento Manual para rastrear células: preencha as informações relevantes nos campos na parte inferior da tela antes de iniciar o rastreamento. Os seguintes parâmetros devem ser determinados antes do rastreamento temporal.

O intervalo em segundos é o tempo total dividido por 30. A calibração xy é a medida em micrômetros por pixel obtida a partir da calibração da imagem do micrômetro. A calibração z é definida como zero. O tamanho do quadrado de busca para centralização é igual a um. É necessário selecionar no vídeo gravado um ponto estável e nítido como ponto de referência. Esse ponto de referência pode ser qualquer ponto estrutural pequeno e bem definido que permaneça inalterado e estável durante todo o experimento.

Clique em adicionar trajetória para rastrear o ponto de referência do primeiro ao último quadro. Em seguida, clique e rastreie os neutrófilos rastejantes e migratórios um por um. Clique em adicionar trajetória para rastrear a célula desde sua aparência no tecido até seu desaparecimento em cada quadro.

Em seguida, clique e rastreie para concluir e salvar os resultados no Microsoft Excel. Abra o arquivo de resultados no Microsoft Excel. Inicie a análise dos dados.

É importante considerar os movimentos do ponto de referência na análise. Ao rastrear neutrófilos e o rastejamento luminar, determinamos a distância percorrida pelos neutrófilos e o rastejamento luminar, bem como a velocidade de rastejamento. Ao analisar a transmigração transendotelial de neutrófilos, medimos o tempo de transmigração dos neutrófilos e o tempo de desprendimento.

Ao determinar a quimiotaxia de neutrófilos no tecido muscular principal, medimos a distância e a velocidade da migração de neutrófilos e da quimiotaxia no músculo, e também determinamos o índice de quimiotaxia durante a quimiotaxia de neutrófilos no tecido muscular. As definições desses parâmetros mostradas na tela são fornecidas em detalhes em nosso protocolo escrito. Neste experimento, demonstramos os procedimentos de como usar microscopia intravital de campo claro para visualizar e determinar a migração intraluminal de neutrófilos, o rastejo endotelial e a migração em quimiotaxia.

Em resposta ao quimioatraente de neutrófilos in vivo, utilizamos MIP-2 (CXCL2) ou o peptídeo sintético W-K-Y-M-V-M, preparado em gel de agarose, para induzir o recrutamento de neutrófilos no tecido muscular CMA de camundongo. Como podemos observar neste gráfico, o MIP-2 em 0,5 MICROMOLAR e o W-K-Y-M-V-M em 0,1 milimolar induziram o rastejamento intraluminal de neutrófilos com velocidades semelhantes. A migração transendotelial dos neutrófilos e sua dissociação do vênulo foram comparáveis em duração.

Esses dois quimioatraentes também induziram migração de neutrófilos e quimiotaxia no tecido muscular em velocidades quase idênticas e com índices de quimiotaxia de neutrófilos semelhantes. O microscópio intravital é uma ferramenta valiosa para a observação direta do processo de recrutamento de neutrófilos e para a determinação quantitativa das funções de células e moléculas em cada etapa do recrutamento. Utilizando fotografia de vídeo com lapso de tempo e o ImageJ, a migração intraluminal, o rastejamento endotelial e a migração em quimiotaxia de leucócitos e tecidos podem ser mensuradas em contraste de campo claro, por microscopia intravital, com inibidores seletivos, camundongos transgênicos e quimioatraentes seletivos.

O sistema de ensaio pode nos ajudar a revelar as funções de proteínas específicas no recrutamento de leucócitos.