Profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto

Perfil de expressão única célula permite a análise detalhada de expressão gênica de células individuais. Descrevemos métodos para o isolamento dos cardiomiócitos, e preparar a lisados ​​resultando tanto para microarray transcriptoma todo ou qPCR de metas específicas.

Os objetivos desta apresentação são primeiro ilustrar o isolamento de cardiomiócitos adultos viáveis de camundongos e, em seguida, demonstrar dois métodos de análise de expressão gênica de célula única. Depois de dissecar o coração de um camundongo, o coração é perfundido com uma solução de digestão de colagenase para obter células únicas. Para PCR quantitativo de células individuais, as células purificadas são submetidas diretamente a ensaios de QPCR.

Os cardiomiócitos isolados também podem ser usados para análise de microarray. A análise de microarray de células únicas envolve extração de mRNA, amplificação de transcriptoma completo por meio de uma biblioteca plex, seguida de amplificação limitada e, finalmente, marcação e hibridização para um chip de micro array. A etapa final de ambos os procedimentos é garantir dados de alta qualidade.

Esses procedimentos demonstram que a análise robusta da expressão gênica é possível a partir de cardiomiócitos adultos isolados individualmente. A vantagem desse método sobre os métodos existentes, como o perfil de expressão gênica de homogeneizado de tecido inteiro, é que a expressão gênica de célula única permite obter informações sobre a expressão dentro de uma única célula, bem como a variabilidade na expressão entre as células. Comece com um sistema de isolamento preparado, incluindo soluções necessárias e tampões terminalmente sedados, um camundongo com uma injeção IP de 0,25 mililitros, solução de pentobarbital sódico e certifique-se de que o camundongo esteja inconsciente e não responda aos estímulos da dor.

Não use dióxido de carbono ou luxação cervical para sacrificar o camundongo antes que ele pare. Respirando cuidadosamente cortado. Abra a cavidade torácica ao longo da margem torácica através do diafragma.

Em seguida, corte superiormente para cima e reflita a caixa torácica anterior. Sugue suavemente o coração para uma pipeta de plástico pré-cortada e excise o coração do tórax. Deixe o coração cair na digestão gelada.

Tampão A e enxágue o sangue após 15 a 45 segundos, faça um segundo enxágue breve, tampão A e, em seguida, transfira o coração para a placa de Petri com tampão A e coloque-o sob um microscópio de dissecação. Isole cuidadosamente a aorta e seus ramos. Apare a aorta para um pouco abaixo do último ramo.

Encaixe a ponta da cânula na aorta acima das artérias coronárias e ligada no lugar com quatro oh ou seis oh sutura. Comece a perfusão usando o tampão de digestão A. O fluxo de saída passará de vermelho para claro à medida que o sangue é liberado do coração. A quantidade de tempo que você leva entre o saco do animal e a conexão do coração ao equipamento de profusão é crítica.

Idealmente, você deseja manter isso em menos de cinco a 10 minutos. Além disso, a temperatura do fluido que passa pela plataforma de profusão precisa ser mantida em 37 graus Celsius. Se estiver muito quente ou muito frio, isso destruirá o tecido.

Depois que o sangue for lavado do coração, passe a usar a digestão. O tampão b perfunde o coração por dois a três minutos até que o coração comece a perder sua forma e comece a parecer arredondado. O miocárdio deve parecer mais leve à medida que a perfusão prossegue, agora corte os ventrículos e pique-os em pedaços menores.

Coloque o tecido ventricular em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 15 mililitros de tampão de coleta quente. Misture o tecido no tampão suavemente com uma pipeta de plástico para fazer uma mistura de cardiomiócitos de célula única. Após um minuto, transfira a mistura para um novo tubo e deixe repousar após a formação do pellet.

Descarte o super nomeado e resus. Suspenda as células peletizadas em cinco mililitros do tampão de lavagem de neutralização. As células agora estão prontas para serem selecionadas para análise de célula única.

Diluir as células numa pequena placa de Petri para que possam ser seleccionadas individualmente. Sob um microscópio, selecione células individuais saudáveis usando uma pipeta puxada conectada a uma câmara de descompressão. Ao escolher células, certifique-se de evitar contaminação e minimizar o volume de captura para menos de dois microlitros.

Coloque as células individuais no fundo dos tubos de PCR individuais e congele-as imediatamente em gelo seco. Em seguida, armazene as células a menos 80 graus Celsius para começar a ressuspender todos os pares de primers para os genes de interesse a 100 micromolares e um tampão de suspensão XDNA, combine e dilua os pares de primers para 20 micromolares. Por fim, diluir todos os pares de primers em uma solução com uma concentração final de 200 nano molares.

Com as soluções de primer preparadas, monte a mistura principal, remova imediatamente as células congeladas do freezer e centrifugue-as com força máxima por 30 segundos. Em seguida, adicione nove microlitros da mistura principal a cada tubo e prossiga com o PCR. Remova os tubos da máquina de PCR e adicione quatro microlitros de exos a cada reação.

Em seguida, execute cada reação por 15 minutos a 37 graus Celsius, seguidos por 15 minutos a 80 graus Celsius. Termine segurando-os a quatro graus Celsius. Em seguida, dilua as amostras de um a cinco com tampão de suspensão de DNA.

As amostras agora estão prontas para análise quantitativa de PCR. Agora usamos este sistema IMS BIOMARK de material e fluido usando as matrizes de expressão gênica de 48 pontos, 48 ou 96 pontos 96. É possível usar formatos QPCR mais tradicionais, como 96 well e 3 84.

Bem, no entanto, isso restringe o número de ensaios que podem ser realizados a partir de uma única célula. Este processo utiliza o kit WTA two da Sigma, que pode amplificar o CDNA de fita dupla de pellets e células únicas. O kit primeiro rompe a membrana das células individuais e depois amplifica as mensagens em duas rodadas.

Depois de realizar a etapa de preparação da biblioteca, adicione um quinto da amostra da biblioteca a 70 microlitros do mix mestre de amplificação de dois WTA e amplifique as amostras por 25 ciclos usando os parâmetros dos kits. Em seguida, purifique as amostras usando o kit de purificação rápida de PCR do caiaque e processe-as no cubo de caiaque de Cain. Quando terminar, concentre as amostras purificadas em cinco microlitros usando um vácuo de velocidade e use o kit WTA two para submeter as amostras a 17 ciclos adicionais de amplificação usando os mesmos parâmetros da amplificação anterior.

Purifique as amostras como feito anteriormente e verifique sua qualidade usando um espectrofotômetro NanoDrop e o kit bioanalyzer DNA 7, 500 da agilent. Agora rotule dois microgramas de CD NA de fita dupla de cada amostra de célula amplificada usando o kit de rotulagem de uma cor da nimble gen, hibridizou cinco microgramas de CY três amostra marcada para uma matriz de expressão gênica NimbleGen, após a hibridização, lave e seque a lâmina para que possam ser visualizadas. Usando o gene de um dispositivo molecular, escolhe 4.200 um scanner com as configurações calibradas para 100 POW e 300 a 350 PMT.

Analise os chips genéticos e, em seguida, gere arquivos de pares para cada matriz usando o software de varredura ágil e prossiga com a análise de dados. Um coração profundido com sucesso produziu uma alta porcentagem de células cardíacas saudáveis que mantiveram sua morfologia retangular típica. Se a profusão não tivesse funcionado bem, muitas células teriam morrido.

As células foram amplificadas pelo método WTA two e a qualidade dos produtos finais foi testada. A amostra mostrou amplificação robusta tanto na leitura do espectômetro nano drop spec, quanto na leitura do eletroferograma do chip bioanalisador. Em resumo, muitos genes foram expressos de forma robusta nos cardiomiócitos.

No entanto, nem todos os ensaios são igualmente confiáveis, como visto neste mapa de calor das temperaturas máximas de fusão de um subconjunto de nano fluido em dados de QPCR. Cada linha deste mapa representa uma única amostra de célula em 43 ensaios de QPCR separados. Alguns ensaios são bastante variáveis e provavelmente menos confiáveis do que aqueles que tiveram maior especificidade de PCR.

Ao concluir este procedimento, é importante lembrar que você precisa obter células de qualidade antecipadamente. Isso garantirá a qualidade do seu perfil de expressão gênica a jusante. Uma vez dominado, o procedimento de isolamento de célula única pode ser concluído em menos de duas horas e meia, e o perfil de expressão gênica dessas células pode ser concluído em menos de dois dias.