Name: Profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprenda a isolar cardiomiócitos viáveis de camundongo adulto e realizar análise de expressão gênica em célula única por qPCR e microarranjo. Este método permite estudar variabilidade celular na biologia cardiovascular.

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Os autores gostariam de agradecer a assistência técnica da C. Zambataro durante as filmagens do presente protocolo. Agradecemos o apoio da Fundação Glenn de Pesquisa Médica (SM), a Fundação Hillblom, e os Institutos Nacionais de Saúde para um prêmio Centro de Choque Nathan (P30AG025708) e PO1AG025901. JMF foi apoiada por T32AG000266 adjudicado ao Instituto Buck de Pesquisa sobre o Envelhecimento.

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<li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li>
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<li>Ståhlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling%3A+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li>
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<li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li>
<li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+nurture%2C+or+chance%3A+stochastic+gene+expression+and+its+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li>
<li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Acesso livre e produção deste deste artigo é patrocinado Sigma-Aldrich.</p

Este método tem a possibilidade de gerar cardiomiócitos para um número de funcionais, bem como estudos de expressão gênica. O exame de células individuais é uma área crescente na análise de expressão gênica. A vantagem de examinar os níveis de transcrição ao nível da célula é que ela permite o exame de uma população celular pura, que não é possível a partir de preparações de tecido inteiro. Além disso, a análise única célula permite a análise de variação estocástica dos níveis de mRNA em células individuais para definir populações de células que foram previamente pensado para ser 8,9 homogênea. Além de identificar genes que são potencialmente estocásticos em sua expressão genética 10,11,12, o método também permite a identificação de populações de células raras definidos por seus perfis de expressão gênica. Embora este método oferece uma série de emocionantes usos potenciais em análise de expressão gênica, há somressalvas e considerações e na utilização de células individuais. A principal limitação para a análise única célula, é a coleção de células suficientes no experimento para alcançar significância estatística em relação à métrica de interesse, por exemplo variância. Nos casos em que o número de células isoladas do tecido de interesse não é uma limitação, pode-se examinar centenas de células por grupo, utilizando abordagens como a próxima geração de sequenciamento, ou matrizes nanofluidic. No entanto, em alguns casos, pode haver dificuldade na obtenção de células suficientes a partir do tecido de interesse. Isso pode em parte ser causada por procedimentos intensivos tempo idiossincrática para a recolha do tipo de célula-alvo. No entanto, um planejamento cuidadoso e preparação antes de prosseguir com a coleta de células individuais podem ainda permitir a análise de células rigorosa único com erro técnico limitado. Ao examinar os resultados deve-se considerar, que, apesar de este procedimento para isolar células tem sido utilizado em inúmeros Studies (incluindo microscopia, eletrofisiologia, etc), o isolamento em si poderia potencialmente efeito a expressão do gene. Como acontece com qualquer método que manipula as amostras biológicas, os resultados de suas descobertas devem ser cuidadosamente validada para garantir a expressão única célula é representativa do próprio tecido e viés não técnicos. Métodos, tais como a hibridização in situ pode ser útil para verificar esses resultados no tecido intacto. Por último, é fundamental para garantir que os dados gerados é cuidadosamente verificado para controle de qualidade. Os dados mostrados na Figura 8 demonstra que as análises de qPCR pode ser muito robusto em sua especificidade, como o ensaio # 13 (A13) ou ter um alto nível de variabilidade que pode levar a variância técnicas, tais como ensaio # 34 (A34).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido pirúvico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 monobásico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Protease, Tipo XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collaoxigenase, Tipo I </td><td> Worthington </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1x tampão Suspensão DNA (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Pentobarbital sódico </td><td> Henry Schein Vet. * Oferta </td><td> Contactar com fornecedor para encomendar </td><td> * Devem ser adquiridos através de um veterinário ou animais de laboratório profissional </td></tr><tr><td> ExoSAP TI </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect Mix Rxn 2x </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> SuperScript III RT Platinum Taq Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-Mix STA Primer </td><td> IDT </td><td> Personalizado </td><td></td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick kit de purificação de PCR </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> Espectrofotômetro NanoDrop </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> Bioanalyzer DNA kit 7500 </td><td> Agilent </td><td> 7500 kit </td><td></td></tr><tr><td> Um kit Labeling Cor </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus musculus série 12x135k </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Scanner </td><td> Dispositivos moleculares </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex Kit Completo Amplification Whole Transcriptoma (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Enquanto numerosos estudos têm examinado as mudanças de expressão gênica de homogenatos de tecido do coração, isso impede de estudar a variação estocástica inerente entre as células dentro de um tecido. Isolamento de populações puras de cardiomiócitos através de uma perfusão colagenase de corações de camundongos facilita a geração de microarrays única célula para a expressão do gene toda transcriptoma, ou qPCR de metas específicas usando arrays nanofluidic. Descrevemos aqui um procedimento para examinar única célula perfis de expressão gênica dos cardiomiócitos isolados do coração. Este paradigma permite a avaliação das métricas de interesse que não são dependentes da média (por exemplo, entre variância células dentro de um tecido) que não é possível ao usar fluxos de trabalho convencionais tecido inteiro para a avaliação da expressão gênica (Figura 1). Temos conseguido amplificação robusta do microgramas única célula transcriptoma rendendo cDNA de dupla fita que facilita o uso de microarrays na icélulas INDIVIDUAIS. No procedimento que descrevem o uso de matrizes NimbleGen que foram escolhidos devido a sua facilidade de uso e capacidade de personalizar o seu design. Alternativamente, uma transcriptase reversa - amplificação do alvo específico (RT-STA) reação, permite qPCR de centenas de alvos por nanofluidic PCR. Usando um desses enfoques, é possível examinar a variabilidade de expressão entre as células, bem como examinar perfis de expressão de tipos de células raras a partir de um tecido. No geral, o único celular abordagem a expressão do gene permite a geração de dados que podem potencialmente identificar perfis de expressão idiossincrática que normalmente são em média para fora quando examinar expressão de milhões de células de homogenatos típicos gerados a partir de tecidos todo.

Perfil de expressão única célula permite a análise detalhada de expressão gênica de células individuais. Descrevemos métodos para o isolamento dos cardiomiócitos, e preparar a lisados ​​resultando tanto para microarray transcriptoma todo ou qPCR de metas específicas.

Profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto

Embora inúmeros estudos tenham examinado as alterações na expressão gênica a partir de homogenatos de tecido cardíaco, isso impede o estudo da variação estocástica inerente...

Os objetivos desta apresentação são, primeiramente, ilustrar o isolamento de cardiomiócitos viáveis de camundongos adultos e, em seguida, demonstrar dois métodos de análise de expressão gênica em célula única. Após dissecar o coração de um camundongo, o coração é perfundido com uma solução de digestão com colagenase para obter células isoladas. Para a PCR quantitativa de células individuais, as células purificadas são diretamente submetidas a ensaios de QPCR.Os cardiomiócitos isolados também podem ser utilizados para análise por microarranjo. A análise por microarranjo de células individuais envolve a extração de mRNA, amplificação de todo o transcriptoma por meio de uma biblioteca plex, seguida por amplificação limitada e, finalmente, marcação e hibridização em um chip de microarranjo. O passo final de ambos os procedimentos é garantir dados de alta qualidade.Estes procedimentos demonstram que é possível realizar uma análise robusta da expressão gênica a partir de cardiomiócitos adultos isolados individualmente. A vantagem deste método em relação aos métodos existentes, como o perfilamento da expressão gênica de homogeneizado total de tecido, é que a expressão gênica em célula única permite obter informações sobre a expressão dentro de uma única célula, bem como a variabilidade na expressão entre células. Inicie com um sistema de isolamento preparado, incluindo as soluções e tampões necessários, sedando terminalmente um camundongo com uma injeção intraperitoneal de 0,25 mililitros de solução de pentobarbital de sódio, e certifique-se de que o camundongo esteja inconsciente e sem resposta a estímulos dolorosos.Não utilize dióxido de carbono nem dislocação cervical para eutanasiar o camundongo antes de o camundongo parar. Corte cuidadosamente a respiração. Abra a cavidade torácica ao longo da margem torácica através do diafragma.Em seguida, corte superiormente para cima e reflete a caixa torácica anterior. Aspire suavemente o coração para dentro de uma pipeta plástica pré-cortada e excise o coração do tórax. Coloque o coração em digestão gelada.Adicione o tampão A e remova o sangue após 15 a 45 segundos, realize uma segunda lavagem breve em tampão A e, em seguida, transfira o coração para a placa de Petri com tampão A e coloque-o sob um microscópio de dissecação. Isole cuidadosamente a aorta e seus ramos. Corte a aorta logo abaixo do último ramo.Encaixe a ponta da cânula na aorta acima das artérias coronárias e fixe-a com sutura 4-0 ou 6-0. Inicie a perfusão utilizando o tampão de digestão A. O efluente passará de vermelho a transparente à medida que o sangue for removido do coração. O tempo que você leva entre sacrificar o animal e conectar o coração ao equipamento de perfusão é crítico.Idealmente, você deve manter isso abaixo de cinco a 10 minutos. Além disso, a temperatura do fluido que passa pelo equipamento de perfusão precisa ser mantida a 37 graus Celsius. Se estiver muito quente ou muito frio, isso destruirá o tecido.Uma vez que o sangue seja removido do coração, passe a usar o tampão de digestão. B perfunda o coração por dois a três minutos, até que o coração comece a perder sua forma e passe a ter aparência arredondada. O miocárdio deve parecer mais claro à medida que a perfusão prossiga; nesse momento, corte os ventrículos e pique-os em pedaços menores.Coloque o tecido ventricular em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 15 mililitros de tampão de coleta morno. Misture suavemente o tecido no tampão com uma pipeta de plástico para obter uma mistura de cardiomiócitos em suspensão simples. Após um minuto, transfira a mistura para um novo tubo e deixe sedimentar após a formação do pellet.Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em cinco mililitros do tampão de lavagem de neutralização. As células estão agora prontas para serem selecionadas para análise de célula única.Dilua as células em um pequeno recipiente de Petri para que possam ser selecionadas individualmente. Sob um microscópio, selecione células individuais saudáveis usando uma pipeta puxada acoplada a uma câmara de ar. Ao escolher as células, certifique-se de evitar contaminação e minimize o volume de captura para menos de dois microlitros.Coloque as células individuais no fundo de tubos individuais de PCR e congele-as imediatamente em gelo seco. Em seguida, armazene as células a menos 80 graus Celsius para iniciar a ressuspensão de todos os pares de primers para os genes de interesse a 100 micromolar e um tampão de suspensão XDNA, combine e dilua os pares de primers a 20 micromolar. Por fim, dilua todos os pares de primers em uma única solução com concentração final de 200 nanomolar.Com as soluções de *primers* preparadas, monte a mistura-mestra, retire imediatamente as células congeladas do congelador e centrifugue-as com força máxima por 30 segundos. Em seguida, adicione nove microlitros da mistura-mestra a cada tubo e prossiga com a PCR. Retire os tubos da máquina de PCR e adicione quatro microlitros de exos a cada reação.Em seguida, incubar cada reação por 15 minutos a 37 graus Celsius, seguido por 15 minutos a 80 graus Celsius. Finalizar mantendo-os a quatro graus Celsius. A seguir, diluir as amostras de um para cinco com tampão de suspensão de DNA.As amostras estão agora prontas para análise de PCR quantitativa. Agora utilizamos este material e sistema fluido IMS BIOMARK com matrizes de expressão gênica de 48 pontos 48 ou 96 pontos 96. É possível utilizar formatos de QPCR mais tradicionais, como placas de 96 poços e 3 84.O formato em poço, no entanto, limita o número de ensaios que podem ser realizados a partir de uma única célula. Este processo utiliza o kit WTA two da Sigma, que pode amplificar cDNA de fita dupla tanto de pellets quanto de células individuais. O kit primeiramente rompe a membrana das células individuais e, em seguida, amplifica as mensagens em duas rodadas.Após realizar a etapa de preparação da biblioteca, adicione um quinto da amostra da bibli游戏副本 a 70 microlitros do meio mestre de amplificação WTA dois e amplifique as amostras por 25 ciclos utilizando os parâmetros do kit. Em seguida, purifique as amostras utilizando o kit de purificação rápida de PCR Kayak e processe-as no Cain's Kayak Cube. Ao finalizar, concentre as amostras purificadas até cinco microlitros utilizando um vácuo de velocidade e utilize o kit WTA dois para submeter as amostras a 17 ciclos adicionais de amplificação, usando os mesmos parâmetros da amplificação anterior.Realize a purificação das amostras conforme feito anteriormente e verifique sua qualidade utilizando um espectrofotômetro NanoDrop e o kit DNA 7,500 do bioanalisador da Agilent. Agora, marque dois microgramas de DNA de fita dupla de cada amostra de célula amplificada utilizando o kit de marcação monocorante da NimbleGen, hibridize cinco microgramas da amostra marcada com CY3 em um arranjo de expressão gênica NimbleGen, e após a hibridização, lave e seque a lâmina para que possa ser imageada. Utilize um scanner GenePix 4,200 da Molecular Devices com os parâmetros calibrados para 100 POW e 300 a 350 PMT.Analise os chips gênicos, depois gere arquivos pareados para cada arranjo utilizando o software NimbleGen's NimbleScan e prossiga com a análise dos dados. Um coração perfundido com sucesso forneceu uma alta porcentagem de células cardíacas saudáveis que mantiveram sua morfologia retangular típica. Se a perfusão não tivesse funcionado bem, muitas células teriam morrido.As células foram amplificadas pelo método WTA dois e a qualidade dos produtos finais foi testada. A amostra mostrou amplificação robusta tanto na leitura do espectrofotômetro nano drop spec quanto na saída do eletroferograma proveniente do chip do bioanalyzer. Em resumo, muitos genes foram expressos de forma robusta nos cardiomiócitos.No entanto, nem todos os ensaios são igualmente confiáveis, como observado neste mapa térmico das temperaturas de fusão de um subconjunto de fluido nano em dados de QPCR. Cada linha deste mapa representa uma amostra individual de célula única em 43 ensaios QPCR separados. Alguns ensaios são bastante variáveis e provavelmente menos confiáveis do que aqueles que apresentaram maior especificidade de PCR.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que é necessário obter células de qualidade desde o início. Isso garantirá a qualidade do seu perfil de expressão gênica em etapas posteriores. Uma vez dominado, o procedimento de isolamento de célula única pode ser concluído em menos de duas horas e meia, e o perfil de expressão gênica dessas células pode ser finalizado em menos de dois dias.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, descrevem o isolamento de cardiomyoctyes ratinho adulto usando um sistema de perfusão de Langendorff. As células resultantes são Ca2 +-tolerantes, electricamente quiescente e podem ser cultivadas e transfectadas com lentivírus para manipular a expressão de genes ou vírus adeno-. A sua funcionalidade, também pode ser analisada utilizando o sistema de MMSYS e técnicas de fixação de membranas.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

Nós descrevemos um método confiável para isolamento de cardiomiócitos adultos do mouse. Este protocolo produz um resultado consistente para a cultura de cardiomiócitos adultos funcionais a partir de uma variedade de camundongos geneticamente modificados.

Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e<em&gt; In vitro</em&gt; A hipertrofia cardíaca

Este protocolo descreve um método passo a passo para o isolamento reprodutível e cultura de longo prazo de cardiomiócitos de camundongos adultos com alto rendimento, pureza e viabilidade.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

Para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular em cardiomiócitos, apresentamos protocolos usando duas linhagens de camundongos transgênicos: camundongos transgênicos Myh6-H2B-mCh, para a identificação inequívoca de núcleos de cardiomiócitos, e camundongos CAG-eGFP-anilina, para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular.

Visualização de Variações do ciclo celular e Determinação de Nucleação no pós-natais Cardiomyocytes

Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a geração e quantificação de diversos subtipos cardíacos reprogramados usando uma entrega mediada por retrovírus de Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

Um método é descrito para o isolamento simultâneo de miócitos e não miócitos tanto da atria quanto dos ventrículos de um único coração de rato adulto. Este protocolo resulta em rendimentos consistentes de miócitos cardíacos altamente viáveis e não miócitos e detalha condições ideais de cultura específica celular para fenotipagem e análise in vitro.

Isolamento simultâneo e cultura de miócitos atrial, miócitos ventriculares e não-miócitos de um coração de rato adulto

Aqui, descrevemos um protocolo para isolar uma quantidade suficiente de cardiomiócitos únicos não cardiomiócitos com alta viabilidade de um coração de camundongo pós-infarto do miocárdio (IM). Isso pode ser usado para sequenciamento subsequente de célula única, análise de citometria de fluxo e cultura de células primárias.

Preparação de uma Suspensão de Células Não-Cardiomiócitos para Sequenciamento de RNA de Célula Única de um Coração de Camundongo Adulto Pós-Infarto do Miocárdio

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a preparação de núcleos celulares. Após microdissecção e dissociação enzimática do tecido cardíaco em células únicas, as células progenitoras foram congeladas, seguidas pelo isolamento de células viáveis puras, que foram usadas para sequenciamento de RNA de núcleo único e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com análises de sequenciamento de alto rendimento.

Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular

Culturas rato cardiomiócitos primários são uma das ferramentas fundamentais para a investigação da organização e função miofibrilar. O protocolo a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos primários de corações neonatais do mouse. As culturas de cardiomiócitos resultantes podem ser subsequentemente utilizados para uma variedade de biomecânicas, ensaios bioquímicos e celulares biológica.

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Cardiomiócitos individuais de camundongos selvagens e mutantes podem ser isolados do coração para estudar sua contratilidade e transientes de cálcio. Isso permite caracterizar a contribuição da disfunção celular para a disfunção cardíaca por qualquer causa.

Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

Aprenda a isolar cardiomiócitos viáveis de camundongo adulto e realizar análise de expressão gênica em célula única por qPCR e microarranjo. Este método permite estudar variabilidade celular na biologia cardiovascular.

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