Name: Estabelecimento de Epstein-Barr Virus Crescimento transformada linhagens de células linfoblastóides (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprenda a gerar linhagens de células linfoblastóides transformadas pelo vírus Epstein-Barr a partir de células B humanas. Este método permite prever o sucesso da transformação em três a quatro dias após a infecção.

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Esta pesquisa foi financiada pelo NIH concede AI062732 K08, K12 HD001401 e 1UL1RR024139-02 e uma criança Grant Pesquisa em Saúde da Fundação Charles H. capa para SB-M. e pela Fundação de Pesquisa da Universidade Estadual de Nova York em Stony Brook.

1. EBV preparação de <ol><li> Subcultura crescimento exponencial B95-8 células (ATCC # CRL 1612, 13) a 3 x 10 5 células / ml em um frasco de 75 centímetros de cultura de tecido usando a técnica de dois estéril. As células são cultivadas em RPMI 1640 completo contendo inativado pelo calor 10% de soro fetal bovino (FBS), Penicilina / Estreptomicina em 100U/ml e 100 mg / ml, respectivamente, e anfotericina B, 0,5 mg / ml a 37 ° C na presença de 5% de CO 2. </li><li> Quarenta e oito horas depois, as células ressuspender em fresco RPMI completo 1640 em 1 x 10 6 células / ml. Para induzir a produção de vírus, estimulam as células com acetato de forbol tetradecanoyl 20ng/mL (TPA) por 1 hora em um padrão de incubadora de CO 2. Lave as células três vezes com RPMI 1640 para remover TPA. </li><li> Ressuspender as células do volume original de RPMI completo 1640 (de 1,2) e colocar o balão na incubadora de CO 2 por 96 horas. Este método tem sido mostrado para produzir títulos elevados de vírus infeccioso partigos 6. </li><li> Centrifugar a 600 x g por 10 min a 4 ° C para separar EBV contendo sobrenadante de cultura de células. Sobrenadante do filtro através de um filtro de 0,45 micron, alíquota, e armazenar a -70 ° C por mais de um ano. Uma alternativa é obter o sobrenadante de B95-8 células contendo EBV da ATCC (VR-1492) e uso na diluição recomendada pelo ATCC. </li></ol> 2. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) <ol><li> Draw 10 ml de sangue do dador para uma seringa heparinizada ou um tubo de sangue heparinizado. Diluir 20 ml de sangue com PBS em temperatura ambiente em um tubo de 50 ml. </li><li> Underlay sangue diluído com 15 Ficoll Hypaque ml de meio de separação de linfócitos. Centrifugar a 225 x g sem freio em temperatura ambiente por 30 minutos. </li><li> Remover buffy coat e transferência para um novo tubo cônico de 50 ml. Aumentar o volume para 50 ml com PBS e girar a 600 xg à temperatura ambiente por 10 minutos. </li><li> Pour fora o sobrenadante. Lave as células pela ressuspensão pellet em 50 ml de PBS e centrifugação a 600 x g à temperatura ambiente por 10 minutos. Lavar duas vezes mais de uma maneira similar. </li><li> Ressuspender as células lavadas em 1 ml de RPMI completo. Use 5 mL de células para preparar uma diluição 1 / 10 em Trypan azul. Contagem de células vivas usando um hemocitômetro. </li><li> Ajustar o volume usando RPMI completo em um frasco de 25 centímetros de cultura de tecido 2 para obter uma concentração de células de 2 x 10 6 / ml. </li></ol> 3. Infecção com EBV <ol><li> Adicionar FK506 (AG Scientific) para a suspensão de células de 2,6 para uma concentração final de 20 nM. Frasco lugar na incubadora de CO 2 a 37 ° C durante uma hora. </li><li> Descongelar rapidamente uma alíquota de EBV. Remover balão de incubadora e adicione EBV para as células em 10/01 diluição. Tipicamente, esta diluição oferece uma MOI de 50-100. Frasco para misturar e coloque-o na posição vertical em incubadora de CO 2 a 37 ° C. </li></ol> ª notana Etapa 4, realizada para prever o resultado bem-sucedido, é uma etapa opcional. Passo 4 Se é para ser realizado, você vai precisar para incubar um frasco adicional de não-infectados PBMC de 2 x 10 6 células / ml como controle. 4. Identificação da população de células em proliferação (etapa opcional) <ol><li> Prepare FACS buffer: PBS + 5% de SFB. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Tornar o anticorpo seguinte mistura em 50 mL de volume para cada coloração de células no Passo 4.6. Diluições devem ser feitas na FACS tampão contendo 1mg/ml de rato IgG (Sigma) para inibir a ligação não específica de anticorpos. <ol class="lroman"><li> single-coradas com PE de anticorpos anti-CD23 conjugado (1 / 50 de diluição) </li><li> single-coradas com FITC anticorpo anti-CD58 conjugado (1 / 50 de diluição) </li><li> single-coradas com PE-Cy5 anticorpo anti-CD19 conjugado (1 / 50 de diluição) </li><li> triple-coloração para CD23, CD58, e CD19 (1 / 50 cada diluição) </li><li> single-coradas com conjugado PE controle isotipoanticorpos combinados para CD23-PE (na mesma concentração de anticorpos anti-CD23) </li><li> single-coradas com anticorpo controle conjugado FITC isotipo combinados para CD58-FITC (na mesma concentração de anticorpos anti-CD58) </li><li> single-coradas com PE-Cy5 anticorpo controle isotipo conjugados combinados para CD19-PE-Cy5 (na mesma concentração de anticorpos anti-CD19) </li><li> triple-coradas com os três anticorpos isotipo controle. </li></ol> Armazenar temporariamente as misturas a 4 ° C no escuro. </li><li> Em três dias pós-exposição ao EBV, gentilmente frasco agite para obter uma suspensão celular mais uniforme. Remover 2ml de balão para um tubo Eppendorf de 2ml. Tubo giratório em uma microcentrífuga a 3000 rpm em temperatura ambiente por 3 minutos. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão FACS, 5 x 10 6 a 1 x 10 7 células / ml. </li><li> Remover oito alíquotas 50μl em tubos Eppendorf individuais ou uma placa de 96 poços V-fundo. Tubos de rotação ou a placa a 1500 x gpor 3 minutos. </li><li> Descartar o sobrenadante e os tubos vortex / placa. Ressuspender as células em cada tubo / poço em 50 mL de tampão FACS contendo diluições apropriadas preparadas em 4.2. </li><li> Incubar os tubos / placa de gelo no escuro por 30 minutos. Células Centrifugar a 3000 rpm por 3 minutos, retire o sobrenadante e adicionar 200 mL de tampão FACS. Centrifugar as células novamente e remover o sobrenadante para completar a lavagem. Repita mais duas lavagens. </li><li> Ressuspender as células em 200 mL de buffer FACS e aquisição de dados usando um citômetro de fluxo, a aquisição de 20 mil eventos / tubo. </li><li> Analisar os dados usando WinMDI (freeware para FACS análise de dados no PC). Portão em células vivas usando perfis de dispersão para a frente e lateral. Então, as células portão ao vivo para a expressão de CD19 + (marcador de células B) depois de comparar com as células coradas com anticorpos isotipo controle pareado para anticorpos anti-CD19. Plot CD19 + B ao vivo células com intensidade de fluorescência de CD23 em eixo-x e intensidade de fluorescência de CD58 em eixo y. Determine CD23 + e CD58 + células, comparando a EBV-expostos de células marcadas com anticorpos isotipo controle pareado. Presença de CD23 + CD58 oi células EBV-expostos cultura (Figura 2C) prevê crescimento bem sucedida de EBV-infectados crescimento das células transformadas. Em contraste, CD23 + células CD58 oi não surgem quando as células não estão expostos a EBV (Figura 2A) ou exposto a uma cepa não imortalizando de EBV (Figura 2B). CD23 + células CD58 oi têm sido experimentalmente demonstrado submeter-se a proliferação e, posteriormente, estabelecer LCL (14). </li></ol> 5. Expansão e criopreservação de LCL <ol><li> Visualização de células por microscopia de luz: Por uma semana após a infecção EBV, grupos de células são visíveis por microscopia de luz. A Figura 3 mostra um exemplo dos primeiros aglomerados microscópicos (Figura 3B) num balão. </li><li> Como o tempo passa, tornam-se maiores aglomerados microscópicos de tal forma que aglomerados são visíveismacroscopicamente no frasco. Figura 3C mostra os clusters maior de células em LCL estabelecidos pela microscopia de luz. </li><li> Alimentando células: o dobro do volume de meio de cultura no frasco de cultura no dia 12. Posteriormente, expandir a cultura, aumentando seu volume de 2-3 vezes usando RPMI completo. </li><li> Periodicidade das células de alimentação deve ser determinado com base na taxa de crescimento celular. Quando o meio de cultura torna-se amarelo, geralmente é hora de substituir a mídia como acima. Normalmente, isso ocorre uma vez por semana. No entanto, algumas linhagens de células podem precisar ser alimentados mais ou menos freqüência. Expandir a cultura de 75-100 ml ao longo das próximas semanas. </li><li> Criopreservação: Quando o congelamento até as células, as células de centrifugação a 600 x g por 10 minutos em temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet celular em meio de muito frio contendo 90% FBS e dimetilsulfóxido 10% no 1 x 10 7 células / ml. Coloque o tubo em nitrogênio líquido. </li></ol> 6. Resultados representativos: Resultado bem-sucedido é previsto pela presença de CD23 + CD58 oi células. Cerca de 2-3% de células vivas no dia 04/03 após a exposição ao EBV deve ter este perfil (Figura 2C). Outras sub-populações de CD23 +, CD23 -, CD58 +, e CD58 - células observadas após a exposição ao EBV mostram proliferação mínima 14. Un células infectadas (Figura 2A) e células expostas a EBV de HH514-16 células (Figura 2B), abrigando uma cepa não imortalizando de EBV, não demonstram CD23 CD58 + células oi. Você também pode visualizar as células por microscopia óptica para monitorar êxito: Como mencionado anteriormente, dentro de uma semana após a infecção EBV, pequenos aglomerados de células no frasco são visíveis por microscopia de luz (Figura 3B). Enquanto o tempo progride e as células se desenvolvem em LCL, clusters microscópicas tornam-se maiores (Figura 3C) de tal forma que aglomerados são visíveis macroscopicamente no frasco. Figura 1. Fluxo de Trabalho para a geração e criopreservação de linhagens de células linfoblastóides. Sangue periférico é centrifugada por um gradiente de Ficoll. PBMC presentes no revestimento buffy de um gradiente estabelecidas estão expostos a FK506 seguido por adição de EBV. EBV-expuseram as células são cultivadas a 37 ° C na presença de 5% de CO 2 para estabelecer e, posteriormente, expandir LCL para criopreservação. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig2.jpg"> Figura 2. Identificação de um sub-população de células B deverá submeter-se a proliferação após a exposição ao EBV. Un-infectados PBMC (A) ou PBMC expostos a EBV derivadas de células HH514-16 (B) ou de células B95-8 (C) na presença de FK506 foram colhidas no dia 3. Células foram marcadas com fluorocromo-anticorpos dirigidos contra CD19, CD23, CD58 e. Depois de chaveamento em células vivass, un-infectados (A) e EBV-exposed (B e C) CD19 + células B foram examinados para a expressão de CD23 e CD58. A sub-população de células B expressando níveis de CD58 e alta de CD23 (CD23 oi CD58 +), observada apenas nas células expostas à transformação competentes EBV (derivado de B95-8 células), é descrito. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig3.jpg"> Figura 3. Visualization dos ninhos de células em células infectadas pelo EBV-. PBMC foram tratados com FK506 e infectados com EBV. Un-infectados (A) e EBV-exposed (B) as células foram examinados uma semana após a infecção por microscopia de contraste de fase (aumento de 10x). Cinco semanas de idade linfoblastóides linha celular é mostrado na C.

<ol><li>Thorley-Lawson, D. A., Gross, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+the+Epstein-Barr+virus+and+the+origins+of+associated+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Persistence of the Epstein-Barr virus and the origins of associated lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 350, 1328-1337 (2004).</li>
<li>Kubuschok, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+spontaneous+Epstein-Barr+virus+lymphoblastoid+cell+lines+genetically+modified+to+express+tumor+antigen+as+cancer+vaccines%3A+mutated+p21+ras+oncogene+in+pancreatic+carcinoma+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Use of spontaneous Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell lines genetically modified to express tumor antigen as cancer vaccines: mutated p21 ras oncogene in pancreatic carcinoma as a model.</a> Hum. Gene Ther. 13, 815-827 (2002).</li>
<li>Kuppers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+under+influence%3A+transformation+of+B+cells+by+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 801-812 (2003).</li>
<li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat. Med. 10, 871-875 (2004).</li>
<li>Bernasconi, N., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+serological+memory+by+polyclonal+activation+of+human+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells.</a> Science. 298, 2199-2202 (2002).</li>
<li>Oh, H. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+rapid+establishment+of+Epstein-Barr+virus+immortalization+of+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes.</a> Cell Prolif. 36, 191-197 (2003).</li>
<li>Ventura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+simple+method+for+the+Epstein-Barr+virus+transformation+of+lymphocytes+from+members+of+large+families+of+Reunion+Island%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Hered%22%5BJournal%5D)">Use of a simple method for the Epstein-Barr virus transformation of lymphocytes from members of large families of Reunion Island.</a> Hum. Hered. 38, 36-43 (1988).</li>
<li>Henderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+transformation+of+lymphocytes+by+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Efficiency of transformation of lymphocytes by Epstein-Barr virus.</a> Virology. 76, 152-163 (1977).</li>
<li>Bird, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Epstein-Barr+virus+activation+of+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Epstein-Barr virus activation of human B lymphocytes.</a> J. Exp. Med. 154, 832-839 (1981).</li>
<li>Neitzel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+routine+method+for+the+establishment+of+permanent+growing+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">A routine method for the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines.</a> Hum. Genet. 73, 320-326 (1986).</li>
<li>Pelloquin, F., Lamelin, J. P., Lenoir, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+lymphocytes+immortalization+by+Epstein-Barr+virus+in+the+presence+of+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B lymphocytes immortalization by Epstein-Barr virus in the presence of cyclosporin A.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. 22, 689-694 (1986).</li>
<li>Pressman, S., Rotter, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes%3A+prolonged+experience+with+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes: prolonged experience with technique.</a> Am. J. Hum. Genet. 49, 467-467 (1991).</li>
<li>Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus%3A+Transformation%2C+cytopathic+changes%2C+and+viral+antigens+in+squirrel+monkey+and+marmoset+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus: Transformation, cytopathic changes, and viral antigens in squirrel monkey and marmoset leukocytes.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 383-387 (1972).</li>
<li>Megyola, C., Ye, J., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+sub-population+of+B+cells+that+proliferates+after+infection+with+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a sub-population of B cells that proliferates after infection with Epstein-Barr virus.</a> Virol. J. 8, 84-84 (2011).</li>
<li>Tosato, G., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-immortalized+B+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized B cell lines.</a> Current Protocols of Immunology. Chapter 7, 22-22 (1991).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método descrito neste trabalho gera LCL de doadores de sangue periférico com imortalização rápida e os tempos de criopreservação. Através do uso de FK506, uma célula T imunossupressoras, e altos títulos de vírus infecciosos que somos capazes de promover a proliferação de células infectadas pelo EBV B a partir de células mononucleares do sangue periférico. Estas intervenções fazem o método descrito mais eficiente, resultando em rápida expansão das células para os experimentos subseqüentes. Tradicionalmente, a transformação de crescimento tem sido monitorado através da visualização de aglomerados de células por microscopia de luz cerca de uma semana após a exposição ao EBV 6, 15. No entanto, o agrupamento de células não é um indicador específico de EBV-mediada transformação de crescimento. Temos demonstrado anteriormente identificação consistente da população de proliferação celular através de citometria de fluxo 14, fornecendo um método preciso e específico para determinar sucesso tão cedo quanto três dias à réer a exposição de células B para EBV.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Anfotericina B </td><td> Fisher Bioreagents </td><td> BP 928-250 </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Sigma </td><td> D 2650 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino, inativado pelo calor </td><td> Sigma </td><td> F 4135 </td></tr><tr><td> Ficoll Hypaque media separação de linfócitos </td><td> Mediatech </td><td> 25-072 </td></tr><tr><td> FK506 </td><td> AG Scientific </td><td> F 1030 </td></tr><tr><td> IgG de soro de rato </td><td> Sigma </td><td> I 8765 </td></tr><tr><td> Rato anti-CD23 humano conjugado com PE </td><td> BD PharMingen </td><td> 555711 </td></tr><tr><td> Isotipo IgG1 rato conjugado com PE </td><td> BD PharMingen </td><td> 554680 </td></tr><tr><td> Rato anti-CD58 humano conjugado com FITC </td><td> Pierce Thermo Scientific </td><td> MA1-82159 </td></tr><tr><td> Isotipo IgG1 rato conjugado com FITC </td><td> BD PharMingen </td><td> 550616 </td></tr><tr><td> Rato anti-CD19 humano conjugado com PE-Cy5 </td><td> BD PharMingen </td><td> 555414 </td></tr><tr><td> Isotipo IgG1 rato conjugado com PE-Cy5 </td><td> Dako </td><td> X 0955 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 media </td><td> Sigma </td><td> R 8758 </td></tr><tr><td> Acetato de forbol Tetradecanoyl (TPA) </td><td> Calbiochem </td><td> 407952 </td></tr><tr><td> FACS Buffer (Phosphate Buffered Saline 1X + 5% de soro fetal bovino) </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estabelecimento de epstein-barr virus crescimento transformada linhagens de células linfoblastóides

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Infecção de células B com vírus Epstein-Barr (EBV) leva à imortalização proliferação e subseqüentes, resultando no estabelecimento de linhas de células linfoblastóides (LCL) in vitro. Desde LCL estão latentes infectadas com EBV, eles fornecem um sistema modelo para investigar a latência e EBV-vírus impulsionado a proliferação de células B e tumorigênese 1. LCL têm sido utilizados para apresentar antígenos em uma variedade de testes imunológicos 2, 3. Além disso, LCL pode ser usado para gerar anticorpos monoclonais humanos 4, 5 e fornecer uma fonte potencialmente ilimitada quando o acesso a materiais biológicos primária é limitada 6, 7. Uma variedade de métodos têm sido descritos para gerar LCL. Métodos anteriores incluíram o uso de mitógenos, como fitohemaglutinina, lipopolissacarídeo 8 e 9 pokeweed mitógeno para aumentar a eficiência da EBV-mediada imortalização. Mais recentemente, outros autores utilizaram o immunosuppragentes essive como a ciclosporina A para inibir a morte celular mediada de células T infectadas B 7, 10-12. O período de tempo considerável da infecção EBV para o estabelecimento de linhas celulares impulsiona a necessidade de métodos mais rápidos e mais confiáveis ​​para EBV-driven de transformação do crescimento de células B. Usando uma combinação de alta título EBV e um agente imunossupressor, somos capazes de infectar consistentemente, transformar e gerar a partir de células LCL B no sangue periférico. Este método utiliza uma pequena quantidade de células mononucleares do sangue periférico, que são infectados em clusters in vitro de células pode ser demonstrada. A presença de CD23 com EBV, na presença de FK506, uma célula T imunossupressoras. Tradicionalmente, o crescimento de células B proliferam é monitorado através da visualização de aglomerados de células microscópicas cerca de uma semana após a infecção com EBV. Aglomerados de LCL pode ser visto a olho nu depois de várias semanas. Nós descrevemos um ensaio para determinar cedo se EBV mediada gCRESCIMENTO transformação for bem sucedida, mesmo antes aglomerados microscópico das células pode ser demonstrada. A presença de CD23 + células CD58 oi observados logo aos três dias pós-infecção indica um resultado positivo.

Nós descrevemos um método para gerar linhas B transformada célula usando vírus Epstein-Barr. Nós também ilustrar um ensaio de romance que pode identificar as células B destinados a sofrer transformações logo aos três dias após a infecção.

Estabelecimento de Epstein-Barr Virus Crescimento transformada linhagens de células linfoblastóides

A infecção de células B pelo vírus Epstein-Barr (EBV) leva à proliferação e subsequente imortalização, resultando no estabelecimento de linhagens linfoblastoides...

O objetivo geral deste procedimento é gerar eps. Linhagens celulares de linfoblastos transformadas pelo vírus Epstein-Barr ou LCL a partir de linfócitos B humanos. Isso é realizado primeiramente isolando células mononucleares do sangue periférico do sangue humano.Em seguida, as células são infectadas com o vírus Epstein-Barr eps na presença de FK 5 0 6 e agentes imunossupressores; três a quatro dias após a infecção com o vírus Epstein-Barr EP, surge uma subpopulação de células marcada como CD 23 alto, positiva para CD 58, e que se prevê sofrer proliferação CD 23 alto. Células positivas para CD 58 podem ser enumeradas por citometria de fluxo como preditoras de resultado bem-sucedido. Células em proliferação podem ser ainda identificadas, microscopicamente e macroscopicamente, pelos aglomerados de linfoblastos que se formam em culturas celulares transformadas com sucesso.O passo final é expandir linhagens celulares de linfoblastos para criopreservação. Em meu laboratório, geramos linhagens celulares de linfoblastos ou LCLs para compreender as interações entre o hospedeiro e o vírus Epstein-Barr. As linhagens celulares de linfoblastos também são de amplo interesse geral para a comunidade científica, particularmente para virologistas, imunologistas e biólogos do câncer.Como pesquisador pós-doutorando O em um laboratório du Macintosh, demonstrarei o procedimento para gerar linhagens celulares de linfoblastos. Após coletar 10 mililitros de sangue de um doador, adicione o sangue heparinizado a um tubo cônico de 50 mililitros e, em seguida, dilua-o na proporção de um para dois. Adicionando 20 mililitros de PBS à temperatura ambiente ao tubo, sobrepõe-se o sangue diluído com 15 mililitros de meio de separação de linfócitos FICO HIA e, então, centrifuga-se o sangue a 225 vezes G sem freio, à temperatura ambiente, durante 30 minutos para estabelecer um gradiente.Em seguida, remova o coágulo leucocitário (buffy coat) e transfira-o para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Complete o volume para 50 mililitros com PBS e, então, pelotize as células a 600 × g por 10 minutos. Descarte o sobrenadante, re-suspenda o pellet em 50 mililitros de PBS e lave as células mais duas vezes nas mesmas condições.Agora, ressuspenda as células em um mililitro de RPMI completo. Utilizo cinco microlitros de células para preparar uma diluição de um para 10 em azul de tripano e contar as células viáveis usando um hemocitômetro, em seguida, uso RPMI completo para ajustar o volume e obter uma concentração celular de duas vezes. Centralize as seis células por mililitro e transfira as células para um frasco de cultura de tecidos de 25 centímetros quadrados.Para preparar as células para infecção com o vírus de Epstein-Barr, adicione FK 5 0 6 ao frasco de cultura de tecidos até uma concentração final de 20 M. Em seguida, coloque o frasco em uma estufa com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora. Quando as células estiverem quase terminando a incubação, descongele rapidamente uma alíquota do vírus de Epstein-Barr, colhida de células B 95 8. Em seguida, remova o frasco da estufa e adicione o vírus de Epstein-Barr às células em uma diluição de um para 10. Agite suavemente o frasco para misturar o vírus de Epstein-Barr na solução e, então, coloque o frasco na posição vertical na estufa com a tampa rosqueada, mas levemente solta, caso esteja utilizando um frasco não ventilado, por duas a três semanas antes da expansão da cultura para criopreservação.Uma semana após eps, infecção pelo vírus Epstein-Barr, agrupamentos de células são visíveis por microscopia de luz, conforme visto nesta figura representativa de agrupamentos microscópicos iniciais. Conforme o tempo avança, os agrupamentos microscópicos tornam-se maiores, de modo que aglomerados são visíveis macroscopicamente no frasco, como observado nesta figura, onde agrupamentos maiores de LCL podem ser observados. Para alimentar as células, duplique o volume do meio de suporte no frasco de cultura no dia 12. Quando o meio de cultura ficar amarelo, geralmente cerca de uma vez por semana, é normalmente hora de alimentar as células; para expandir as células, aumente o volume da cultura em duas a três vezes.Usando RPMI completo, expanda o cultivo para 70 a 100 mililitros em um frasco de 75 centímetros quadrados nas próximas semanas para gerar células para criopreservação. Um resultado bem-sucedido é predito pela presença de CD23, com alta porcentagem de células CD58 positivas, conforme observado neste gráfico de dispersão. Aproximadamente de 2 a 3% das células viáveis no terceiro ao quarto dia após exposição ao vírus Epstein-Barr apresentam esse perfil. Outras subpopulações de células CD23 positivas, CD23 negativas, CD58 positivas e CD58 negativas observadas após exposição ao vírus Epstein-Barr mostram proliferação mínima, e células não infectadas ou infectadas com uma cepa não imortalizante do vírus Epstein-Barr não demonstram expressão elevada de CD23.Células positivas para CD58. As células também podem ser visualizadas por microscopia de luz. Como mencionado, dentro de uma semana após a infecção pelo vírus Epstein-Barr, pequenos aglomerados de células são visíveis no frasco por microscopia de luz.À medida que o tempo passa e as células se desenvolvem em LCL, os agregados microscópicos tornam-se maiores, de modo que os aglomerados tornam-se visíveis macroscopicamente no frasco. Muito bem. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células mononucleares do sangue periférico a partir de sangue humano e como gerar linhagens celulares de linfoblastos transformados pelo vírus Epstein-Barr a partir de linfócitos B humanos, embora a geração de linhagens celulares de linfoblastos já tenha sido descrita por outros laboratórios.A vantagem do nosso protocolo é que ele fornece aos pesquisadores um método para prever um resultado bem-sucedido já entre três e quatro dias após a infecção de linfócitos B com o vírus Epstein-Barr.

establishment-epstein-barr-virus-growth-transformed-lymphoblastoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um protocolo rápido, simples e de baixo custo para a geração de doador-derivado multivirus específico CTLs (rctl) para infusão de células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH) destinatários em risco de desenvolver infecções CMV, EBV ou Adv. Este processo de fabricação é compatível com GMP e deve garantir a mais ampla implementação de T-cell imunoterapia além de centros especializados.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Aqui descrevemos a prática de fabricação primeiro (BPF) compatível com método de produção de vírus específicos linfócitos T citotóxicos (CTL) de sangue de cordão umbilical, fonte de células T predominantemente ingênua.

Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor induzido por infecção pelo herpesvírus oncogênicos vírus humano herpesvírus-8/KS (HHV-8/KSHV). O modelo de cultura de células endoteliais descrito aqui é especialmente adequado para estudar os mecanismos pelos quais KSHV transforma células hospedeiras.

Um modelo In Vitro para o estudo transformação celular por Herpesvirus Sarcoma de Kaposi

Um método simples de lise de glóbulos vermelhos para o estabelecimento de B-LCLS foi desenvolvido com alta eficiência de imortalização, requerendo uma pequena quantidade de sangue e de economia de tempo desde a iniciação à criopreservação.

Um glóbulo vermelho simples método de lise para o estabelecimento de linhas celulares linfoblastóides B

Um método simples para a obtenção de clones NK e células T de pacientes CAEBV foi desenvolvido com alta eficiência, uma pequena quantidade de sangue periférico e uma baixa dose de Il-2.

Um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células T de pacientes com infecção crônica ativa vírus Epstein - Barr e NK

Aqui são descritos métodos usados para estudar o efeito funcional das mutações RYR1 expressas endógenamente no Vírus Epstein Barr, linfócitos B humanos e células de satélite derivadas da biópsia muscular diferenciadas em miótubos.

Caracterização funcional de variantes ryr1 humanas expressas e endógenas

Descrevemos um método que combina contas imunomagnéticas e classificação de células ativadas por fluorescência para isolar e analisar subpopulações de células imunes definidas de células mononucleares do sangue periférico (monócitos, células T CD4 + , células T CD8 + , células B e células natural killer). Usando este método, as células magnéticas e fluorescentemente marcadas podem ser purificadas e analisadas.

Separação de subpopulações de células imunes em amostras de sangue periférico de crianças com mononucleose infecciosa

Este protocolo permite o isolamento de partículas do vírus Epstein-Barr da linhagem celular humana P3HR1 ao induzir o ciclo lítico viral com 12-miristato de forbol 13-acetato. O DNA é subsequentemente extraído da preparação viral e submetido a PCR em tempo real para quantificar a concentração de partículas virais.

Isolamento e quantificação do vírus Epstein-Barr a partir da linhagem celular P3HR1

Neste vídeo mostramos um protocolo para estabelecer linhagens de células do timo de rato linfoma. Ao seguir este protocolo, conseguimos estabelecer várias células T linhas de Atm-/ - e p53-/ - ratos com linfoma tímico.

Derivação de Tímico linfoma de células T Linhas de Atm - / -</sup E<emP53> - / -</sup Ratos

Aprenda a gerar linhagens de células linfoblastóides transformadas pelo vírus Epstein-Barr a partir de células B humanas. Este método permite prever o sucesso da transformação em três a quatro dias após a infecção.

Estabelecimento de Epstein-Barr Virus Crescimento transformada linhagens de células linfoblastóides

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