Estabelecimento de Epstein-Barr Virus Crescimento transformada linhagens de células linfoblastóides

O objetivo geral deste procedimento é gerar eps. Linhagens celulares de linfoblastos transformadas pelo vírus Epstein-Barr ou LCL a partir de linfócitos B humanos. Isso é realizado primeiramente isolando células mononucleares do sangue periférico do sangue humano.

Em seguida, as células são infectadas com o vírus Epstein-Barr eps na presença de FK 5 0 6 e agentes imunossupressores; três a quatro dias após a infecção com o vírus Epstein-Barr EP, surge uma subpopulação de células marcada como CD 23 alto, positiva para CD 58, e que se prevê sofrer proliferação CD 23 alto. Células positivas para CD 58 podem ser enumeradas por citometria de fluxo como preditoras de resultado bem-sucedido. Células em proliferação podem ser ainda identificadas, microscopicamente e macroscopicamente, pelos aglomerados de linfoblastos que se formam em culturas celulares transformadas com sucesso.

O passo final é expandir linhagens celulares de linfoblastos para criopreservação. Em meu laboratório, geramos linhagens celulares de linfoblastos ou LCLs para compreender as interações entre o hospedeiro e o vírus Epstein-Barr. As linhagens celulares de linfoblastos também são de amplo interesse geral para a comunidade científica, particularmente para virologistas, imunologistas e biólogos do câncer.

Como pesquisador pós-doutorando O em um laboratório du Macintosh, demonstrarei o procedimento para gerar linhagens celulares de linfoblastos. Após coletar 10 mililitros de sangue de um doador, adicione o sangue heparinizado a um tubo cônico de 50 mililitros e, em seguida, dilua-o na proporção de um para dois. Adicionando 20 mililitros de PBS à temperatura ambiente ao tubo, sobrepõe-se o sangue diluído com 15 mililitros de meio de separação de linfócitos FICO HIA e, então, centrifuga-se o sangue a 225 vezes G sem freio, à temperatura ambiente, durante 30 minutos para estabelecer um gradiente.

Em seguida, remova o coágulo leucocitário (buffy coat) e transfira-o para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Complete o volume para 50 mililitros com PBS e, então, pelotize as células a 600 × g por 10 minutos. Descarte o sobrenadante, re-suspenda o pellet em 50 mililitros de PBS e lave as células mais duas vezes nas mesmas condições.

Agora, ressuspenda as células em um mililitro de RPMI completo. Utilizo cinco microlitros de células para preparar uma diluição de um para 10 em azul de tripano e contar as células viáveis usando um hemocitômetro, em seguida, uso RPMI completo para ajustar o volume e obter uma concentração celular de duas vezes. Centralize as seis células por mililitro e transfira as células para um frasco de cultura de tecidos de 25 centímetros quadrados.

Para preparar as células para infecção com o vírus de Epstein-Barr, adicione FK 5 0 6 ao frasco de cultura de tecidos até uma concentração final de 20 M. Em seguida, coloque o frasco em uma estufa com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora. Quando as células estiverem quase terminando a incubação, descongele rapidamente uma alíquota do vírus de Epstein-Barr, colhida de células B 95 8. Em seguida, remova o frasco da estufa e adicione o vírus de Epstein-Barr às células em uma diluição de um para 10. Agite suavemente o frasco para misturar o vírus de Epstein-Barr na solução e, então, coloque o frasco na posição vertical na estufa com a tampa rosqueada, mas levemente solta, caso esteja utilizando um frasco não ventilado, por duas a três semanas antes da expansão da cultura para criopreservação.

Uma semana após eps, infecção pelo vírus Epstein-Barr, agrupamentos de células são visíveis por microscopia de luz, conforme visto nesta figura representativa de agrupamentos microscópicos iniciais. Conforme o tempo avança, os agrupamentos microscópicos tornam-se maiores, de modo que aglomerados são visíveis macroscopicamente no frasco, como observado nesta figura, onde agrupamentos maiores de LCL podem ser observados. Para alimentar as células, duplique o volume do meio de suporte no frasco de cultura no dia 12. Quando o meio de cultura ficar amarelo, geralmente cerca de uma vez por semana, é normalmente hora de alimentar as células; para expandir as células, aumente o volume da cultura em duas a três vezes.

Usando RPMI completo, expanda o cultivo para 70 a 100 mililitros em um frasco de 75 centímetros quadrados nas próximas semanas para gerar células para criopreservação. Um resultado bem-sucedido é predito pela presença de CD23, com alta porcentagem de células CD58 positivas, conforme observado neste gráfico de dispersão. Aproximadamente de 2 a 3% das células viáveis no terceiro ao quarto dia após exposição ao vírus Epstein-Barr apresentam esse perfil. Outras subpopulações de células CD23 positivas, CD23 negativas, CD58 positivas e CD58 negativas observadas após exposição ao vírus Epstein-Barr mostram proliferação mínima, e células não infectadas ou infectadas com uma cepa não imortalizante do vírus Epstein-Barr não demonstram expressão elevada de CD23.

Células positivas para CD58. As células também podem ser visualizadas por microscopia de luz. Como mencionado, dentro de uma semana após a infecção pelo vírus Epstein-Barr, pequenos aglomerados de células são visíveis no frasco por microscopia de luz.

À medida que o tempo passa e as células se desenvolvem em LCL, os agregados microscópicos tornam-se maiores, de modo que os aglomerados tornam-se visíveis macroscopicamente no frasco. Muito bem. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células mononucleares do sangue periférico a partir de sangue humano e como gerar linhagens celulares de linfoblastos transformados pelo vírus Epstein-Barr a partir de linfócitos B humanos, embora a geração de linhagens celulares de linfoblastos já tenha sido descrita por outros laboratórios.

A vantagem do nosso protocolo é que ele fornece aos pesquisadores um método para prever um resultado bem-sucedido já entre três e quatro dias após a infecção de linfócitos B com o vírus Epstein-Barr.