Name: Derivação de Enriquecido Culturas oligodendroglial e Neuron / oligodendroglial Myelinating Co-culturas de tecidos pós-natais murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Aprenda a derivar culturas enriquecidas de células precursoras de oligodendrócitos de camundongos neonatos e a estabelecer co-culturas mielinizantes com neurônios de gânglio da raiz dorsal. Este protocolo detalhado permite estudar biologia de oligodendrócitos e processos de mielinização in vitro.

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Este projeto foi financiado por uma doação da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá para RKRWO é um receptor de um Studentship da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá. SDR é um receptor de Bolsas de Pós-Doutorado da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá e Canadian Institutes of Health Research.

<ol><li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+%22oligospheres%22+that+retain+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> Cell. 70, 31-46 (1992).</li>
<li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43, 183-1891 (2004).</li>
<li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).</li>
<li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> Neuron. 49, 823-832 (2006).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li>
<li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+characterization%2C+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> Glia. 56, 1339-1352 (2008).</li>
<li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+%28NGF%29+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> Dev Biol. 58, 106-113 (1977).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este relatório descreve um método para isolar OPCs murino para a diferenciação em culturas OL-enriquecido ou OL / DRGN co-culturas. Quando cultivadas por si só, o OPCs diferenciar em MBP + ve OLS, produzindo mielina como folhas membranosas. Quando adicionado ao DRGN camas neurite, OLS envolver o neurites DRGN com MBP + membrana ve. Este modelo beneficia a investigação dos fundamentos complexos que regem OL-mediada ensheathment axonal. Embora de grande valor, o estabelecimento de tais culturas é um desafio técnico. Em particular, os aspectos exigentes incluem a digestão do tecido eficiente / dissociação, manutenção de pH equilibrado meios de cultura, e as mudanças DRGN mídia. É importante considerar que o comprimento da digestão, a quantidade de tecido a ser digerida e da quantidade de trituração afeta o resultado final da eficácia e da dissociação do tecido. Não é incomum para investigadores experientes para obter baixos rendimentos a partir de celulares dissociados tecidos do sistema nervoso. Além disso, OPCs murino tendem a ser sensíveis às mudanças no pH do meio de cultura, especialmente sob condições alcalinas. A manutenção de culturas em 8,5% CO 2 visa evitar isso, desde OPCs parecem tolerar melhor as condições mais básicas ligeiramente ácido. Com relação ao DRGNs alimentação, alterações de mídia deve ser realizada rapidamente para não desidratar os neurônios, no entanto, deve ser suave para não perturbar a cama neurite em desenvolvimento. Mudanças bruscas de mídia pode desalojar a cama neurite do substrato, e que resultam em sua dissociação completa da lamela. O mérito potencial deste sistema modelo muito ofusca sua natureza tecnicamente exigente. Uma vantagem deste sistema é a utilização de ratos pós-natal para derivação de cultura de células, evitando a necessidade de sacrifício fêmeas reprodutoras para a colheita de tecido embrionário. Outra vantagem é a falta de exigência de fatores de crescimento (GFs) para a expansão da OPCs. Mistas culturas gliais proporcionar um ambiente que suporta a propagação de OPCs, provavelmente devido à presença de fatores de astrócitos derivados trófica. Outros métodos, como a derivação via neurospheres 7,8, invocar as propriedades mitogênica da FG, como fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), fator de crescimento epidérmico (EGF) e das plaquetas fator de crescimento derivado (PDGF) para expansão da OPC. Da mesma forma, usando pós-natal (P5-10) para ratos DRGNs evita a necessidade de complementar os meios de cultura com fator de crescimento neural (NGF), um fator neurotrófico necessários para a sobrevivência in vitro de embriões DRGNs 9, 10. É de interesse para evitar o uso de NGF, uma vez que influencia negativamente a capacidade myelinating de OLS quando cultivadas com DRGNs 4. Evitando o uso de GF-suplementado mídia também tem benefícios econômicos, uma vez que estes reagentes tornar-se caro quando usado em larga escala. Talvez o benefício mais importante deste modelo de cultura é sua derivação do rato-somente tecidos, proporcionando assim as oportunidades para derivar tanto OPCs e DRGNs da grande variedade de linhas de ratinhos transgénicos. Isto permite o estudo de ambos e DRGN / ou OPC propriedades específicas que regem a mielinização. Isto será especialmente importante para a elucidação das interações receptor / ligante regulação OL-mediada mielinização dos axônios. Ao todo, esta técnica é de grande valor com relação à pesquisa em neurociência, devido à suas aplicações para a compreensão dos sinais moleculares subjacentes mielinização.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nome do produto </td><td> Companhia </td><td> Número de produtos </td></tr><tr><td> Modificado Dulbecco Eagle Medium (DMEM) </td><td> Multicélulas </td><td> 319-005-CL </td></tr><tr><td> Solução salina balanceada de Hank (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> Mínimo Essential Media (MEM) </td><td> GIBCO </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td> De soro fetal bovino (FBS) </td><td> GIBCO </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina (Pen / Strep) </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td> Poli-l-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2636 </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Humana merosina proteína purificada (LN2) </td><td> Millipore </td><td> CC085 </td></tr><tr><td> Recombinante rato fator neurotrófico ciliar (CNTF) </td><td> PeproTech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L-tiroxina </td><td> Biochemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td> Holo-transferrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27 suplemento </td><td> GIBCO </td><td> 0080085-SA </td></tr><tr><td> Insulina bovina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiodo-L-thyronine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8783 </td></tr><tr><td> Putrescina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7505 </td></tr><tr><td> Selenito de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5-fluoro-2&#39;-deoxiuridina (FuDR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Solução de papaína </td><td> Worthington </td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> ROCHE </td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24 pratos bem a cultura de tecidos </td><td> Cellstar </td><td> 662-160 </td></tr><tr><td> Frascos T25 tecido-cultura com tampa da abertura </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10 centímetros cultura pratos tecido </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10 centímetros placa de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713 </td></tr><tr><td> A colagenase </td><td> ROCHE </td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50 mm filtro (opcional) </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td> Mielina Básico Protein (MBP) Antibody </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2 anticorpos </td><td> Millipore </td><td> AB5320 </td></tr><tr><td> Mielina Associated Glicoproteína anticorpos (MAG) </td><td> Millipore </td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2 &#39;, 3&#39;-cíclico-fosfodiesterase nucleotídeo 3&#39;-anticorpos (CNP) </td><td> Covance </td><td> SMI-91R-100 </td></tr><tr><td> Actina pan-5 Ab de anticorpos </td><td> Fitzgerald </td><td> 10R-A106AX </td></tr><tr><td> Neurofilamento-200 de anticorpo (NF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N4142 </td></tr><tr><td> Beta-3 tubulina cadeia (Tuj1) de anticorpos </td><td> Millipore </td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho (H + L) anticorpo secundário </td><td> Invitrogen </td><td> A11008 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 cabra anti-camundongo IgG (H + L) anticorpo secundário </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 cabra anti-rato (IgG) (H + L) anticorpo secundário </td><td> Invitrogen </td><td> A21247 </td></tr><tr><td> Cabra anti-camundongo IgG (H + L)-HRP conjugado anticorpo secundário </td><td> BioRad </td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td> Cabra anti-IgG de rato (H + L)-HRP conjugados de anticorpos secundários </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-2065 </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9542 </td></tr></tbody></table> Receitas da mídia OL-100X Suplemento * <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Quantidade para adicionar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1,02 g </td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> 0,6 mg </td></tr><tr><td> Putrescina </td><td> 161 mg </td></tr><tr><td> Selenito de sódio </td><td> 0,05 mg </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiodo-L-thyronine </td><td> 4 mg </td></tr></tbody></table> * Conservar a -80 ° C em 250 mL alíquotas t &quot;&gt; mídias OL <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Quantidade para adicionar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23,75 mL </td></tr><tr><td> Suplemento OL-100X </td><td> 250 L </td></tr><tr><td> Insulina bovina (de um estoque mg / mL) </td><td> 125 mL </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 250 L </td></tr><tr><td> Holo-transferrina (de 33 ações mg / mL) </td><td> 37,5 mL </td></tr><tr><td> B27 Suplemento </td><td> 500 mL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125 mL </td></tr><tr><td> CNTF (de 50 ações ng / mL) </td><td> 25 mL </td></tr></tbody></table> Mista glial meios de cultura (confeccionados em DMEM) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (0,33% do estoque) </td><td> 33 unidades / ml de penicilina e estreptomicina 33 mg / mL </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> DRGN media (confeccionados em DMEM) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (1% do estoque) </td><td> 100 unidades / ml de penicilina e estreptomicina 100 mg / mL </td></tr></tbody></table> Solução Receitas digestão: OPC papaína solução (composta em MEM) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td> Solução de papaína </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> 360 mcg / mL </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60 mcg / mL </td></tr></tbody></table> DRG papaína solução (composta em HBSS) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td> Papaína </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> 360 mcg / mL </td></tr></tbody></table> DRG colagenase solução A (confeccionados em HBSS) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td> A colagenase </td><td> 4 mg / mL </td></tr></tbody></table>

derivação de enriquecido culturas oligodendroglial e neuron / oligodendroglial myelinating co-culturas de tecidos pós-natais murino

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identificar os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento OL não é apenas fundamental para ampliar nosso conhecimento da biologia OL, mas também tem implicações para a compreensão da patogênese de doenças desmielinizantes, como esclerose múltipla (MS). Desenvolvimento celular é comumente estudada com modelos de cultura primária da célula. Cultura de células primárias facilita a avaliação de um tipo de célula dada por fornecer um ambiente controlado, livre das variáveis ​​externas que estão presentes in vivo. Enquanto culturas OL derivados de ratos têm proporcionado uma grande quantidade de insights sobre a biologia OL, esforços semelhantes ao estabelecimento de culturas OL de camundongos, foi recebido com grandes obstáculos. Desenvolvimento de métodos para a cultura murino OLS primário é imperativa, a fim de aproveitar as linhas disponíveis camundongo transgênico. Vários métodos para a extração de OPCs a partir de tecido de roedores têm sido descritos, variando de derivação neurosphere, purificação de adesão diferencial e immunopurification 1-3. Embora muitos métodos oferecer maior sucesso, requerem tempos de cultivo extensivo e / ou equipamentos de alto custo / reagentes. Para contornar isso, purificando OPCs do tecido murino com uma adaptação do método originalmente descrito por McCarthy &amp; de Vellis 2 é o preferido. Este método envolve fisicamente OPCs separação de uma cultura mista glial derivado de córtices roedores neonatal. O resultado é uma população purificada OPC que podem ser diferenciados em uma cultura OL-enriquecido. Esta abordagem é atraente devido ao seu tempo relativamente curto a cultura ea exigência desnecessária para fatores de crescimento ou anticorpos immunopanning. Enquanto explora os mecanismos de desenvolvimento OL em uma cultura purificada é informativo, não proporcionar o ambiente mais fisiologicamente relevantes para a avaliação de mielina formação da bainha. Co-cultura de MQO com os neurônios emprestaria visão sobre as bases moleculares que regulam OL-mediada mielinização dos axônios. Para muitos OL / neurônio co-cultura estudos, os neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRGNs) provaram ser o tipo de neurônio de escolha. Eles são ideais para co-cultura com MQO, devido à sua facilidade de extração, quantidade mínima de células contaminantes, e formação de camas neurite denso. Enquanto estudos usando ratos / mouse myelinating xenocultures foram publicados 4-6, um método para a derivação de tais OL / DRGN myelinating co-culturas de pós-natal do tecido murino não tem sido descrita. Aqui apresentamos métodos detalhados sobre a forma de produzir tais culturas, juntamente com exemplos de resultados esperados. Estes métodos são úteis para tratar de questões relevantes para o desenvolvimento OL / função myelinating, e são ferramentas úteis no campo da neurociência.

Este artigo descreve métodos para derivar populações enriquecidas de células precursoras de oligodendrócitos murino (OPCs) em cultura primária, que se diferenciam para produzir oligodendrócitos maduros (MQO). Além disso, este relatório descreve as técnicas para produzir murino myelinating co-culturas semeando OPCs do mouse sobre uma cama de neurite do mouse neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRGNs).

Derivação de Enriquecido Culturas oligodendroglial e Neuron / oligodendroglial Myelinating Co-culturas de tecidos pós-natais murino

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Olá, sou Ryan O'Mara, aluno de doutorado da Universidade de Ottawa e do Instituto de Pesquisa do Hospital de Ottawa. Este protocolo descreverá métodos para produzir populações enriquecidas de células precursoras de oligodendrócitos a partir de camundongos, que podem ser diferenciadas isoladamente ou em combinação com neurônios do gânglio da raiz dorsal de camundongos para gerar culturas mielinizadas. Vamos começar com uma breve visão geral do procedimento.Os cortes de camundongos neonatos são dissociados e semeados em frascos T 25. Após um período de cultivo de nove dias, forma-se uma monocamada de astrócitos na base do frasco, sobre a qual as células precursoras de oligodendrócitos estão proliferando. As células precursoras de oligodendrócitos são então obtidas e purificadas e podem ser subsequentemente diferenciadas em oligodendrócitos maduros em um cultivo enriquecido.Se forem desejados cultivos co-mielinizantes, neurônios de gânglios da raiz dorsal de camundongos P5 a P10 são cultivados juntamente com culturas mistas de gliócitos. Ao longo de um período de nove dias, esses neurônios formam uma densa rede de neuritos sobre a qual podem ser semeadas células precursoras de oligodendrócitos.Isso permite o envolvimento dos neuritos mediado por oligodendrócitos, resultando assim em uma cultura fria mielinizante. Primeiro, cérebros inteiros de camundongos P zero a P dois são colocados em MEM gelado e transferidos para um microscópio de dissecação; usando um bisturi, corta-se a camada meníngea de cada córtex de maneira longitudinal. Em seguida, desprende-se as meninges do córtex subjacente. A seguir, remova os bulbos olfatórios com o cérebro voltado com a face ventral para cima.Realize incisões longitudinais profundas onde os córtices se encontram com o cefalão ventral. Com o cérebro com o lado dorsal voltado para cima, levante os córtices e, em seguida, corte o cordis em cerca de quatro pedaços cada. Transfira os córtices para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 350 microlitros de MEM gelado por cérebro.Cérebros do mesmo genótipo são agrupados no mesmo tubo, de modo que quatro cérebros exigiriam 1400 microlitros de MEM. Após a conclusão da dissecação, transfira os cérebros agrupados para um banho-maria a 37 graus por três minutos. Em seguida, em uma câmara de cultura de tecidos estéril, passe os fragmentos cerebrais através da ponteira de uma pipeta P1000 para dividi-los em pedaços menores.Adicione 75 microlitros de OPC Pap pain pré-aquecido por cérebro ao tubo cônico. Em seguida, incube em banho-maria a 37 graus por 20 minutos. Inverta o tubo a cada dois minutos para evitar agregação tecidual.Após a conclusão da incubação, adicione dois mililitros de cultura mista de gliócitos por cérebro ao digestivo e deixe repousar por 10 minutos. Após 10 minutos, alíquotas da suspensão tecidual devem ser transferidas para tubos plásticos de cinco mililitros.O número de tubos deve corresponder ao número de cérebros na preparação. Usando uma pipeta de Pasteur de vidro polida na chama, agite suavemente o conteúdo de cada tubo inicialmente, depois com intensidade crescente à medida que os fragmentos começarem a se dissociar. Interrompa a agitação assim que não houver mais pedaços visíveis de tecido na suspensão. Reúna o conteúdo de cada tubo em um tubo cônico de 50 mililitros contendo quatro mililitros de cultura mista de gliócitos.Após inverter suavemente o tubo várias vezes, distribua o meio por cérebro em alíquotas de suspensão celular em tubos cónicos de 15 mililitros. O número de tubos deve corresponder ao número de cérebros na preparação. Centrifugue os tubos a 300 × g durante cinco minutos e ressuspenda os pellets em um mililitro de meio de cultura de gliócitos mistos. Adicione as células ressuspendidas de cada tubo cónico a frascos T25 revestidos com poli-L-lisina que foram previamente equilibrados com cinco mililitros de meio de cultura de gliócitos mistos.O número de frascos deve ser igual ao número de cérebros dissecados; incube os frascos em incubadora a 37 graus e 8,5% de CO₂. Após três a quatro horas, as células devem estar aderidas ao substrato. No entanto, haverá muito debris persistindo no meio, o que pode afetar negativamente a viabilidade celular.Para evitar isso, substitua o meio após três a quatro horas por meio fresco de cultura de gliócitos mistos, conforme possível. Essa troca de meio remove grande parte dos detritos celulares. No dia seguinte.Deve ser evidente a presença de muitas células na base do frasco. No terceiro dia, deve estar se formando uma monocamada de astrócitos na base do frasco. Neste momento, realize uma troca de dois terços do meio, removendo quatro mililitros do meio e adicionando de volta quatro mililitros de meio fresco.Este passo deve ser repetido a cada três dias. No sexto dia, uma monocamada de astrócitos deve estar claramente visível, sobre a qual as células precursoras de oligodendrócitos estão se proliferando. Neste momento, suplemente o meio de cultura com insulina numa concentração final de cinco microgramas por mililitro; no nono dia, as células precursoras de oligodendrócitos estarão prontas para serem separadas da monocamada de astrócitos.Para fazer isso, coloque os frascos em um agitador orbital e em um incubador com 5% de CO2. Deixe o frasco se equilibrar nesse incubador por uma hora. Em seguida, agite as células a 50 rpm por 45 minutos.Esta etapa remove muitas células contaminantes fracamente aderidas. Realize uma troca completa do meio removendo todo o meio e adicionando novamente quatro mililitros de meio de cultura fresco. Devolva o frasco a uma estufa com 5%CO2 e deixe equilibrar por três horas.No terceiro hora, verifique a coloração do meio de cultura. O meio de cultura deve estar vermelho, indicando um pH equilibrado. Se a coloração tender ao laranja ou roxo, ajuste o nível de CO2 do incubador conforme necessário.A manutenção de um pH equilibrado é importante para a sobrevivência das células precursoras de oligodendrócitos durante a agitação noturna. Uma vez atingido um pH equilibrado, agite o frasco a 220 RPM por aproximadamente 16 horas. Na manhã seguinte, remova o frasco do agitador e transfira o meio dos frascos para placas de cultura de tecidos de 10 centímetros.Esses recipientes servirão como meio para purificar ainda mais as células precursoras de oligodendrócitos por adesão diferencial. Cada recipiente deve receber meio de dois frascos; incubar os recipientes a 5% de CO₂ por 30 minutos. No momento de 15 minutos, agite suavemente cada recipiente para impedir que as células precursoras de oligodendrócitos adiram ao plástico.Após a incubação de 30 minutos, examine as placas em contraste de fase. As células precursoras de oligodendrócitos são evidentes como pequenos aglomerados de células. Algumas dessas células podem ter aderido à placa.Solte as células precursoras de oligodendrócitos aderidas à placa por meio de agitação suave. Tenha cuidado. Uma agitação excessiva pode resultar no desprendimento de tipos celulares contaminantes.Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 300 vezes a gravidade durante cinco minutos. Re-suspenda suavemente o pellet com uma ponteira de pipeta P1000. Em seguida, utilizando uma ponteira de pipeta P200, conte as células com um hemocitômetro. Oligodendrócitos purificados podem então ser semeados em lamínulas revestidas para diferenciação em culturas enriquecidas de oligodendrócitos no dia um.Após o semeadura, as células precursoras de oligodendrócitos enriquecidas apresentam morfologia relativamente simples, estendendo apenas alguns prolongamentos. No terceiro dia, os oligodendrócitos em diferenciação estendem numerosos prolongamentos semelhantes aos de oligodendrócitos imaturos. No sexto dia, os oligodendrócitos estendem lâminas membranosas semelhantes à mielina a qualquer momento durante esse período.As lamínulas de cultura podem ser fixadas e processadas para imunocitoquímica. Em vez de semear as células precursoras de oligodendrócitos purificadas em lamínulas revestidas com laminina, elas podem ser semeadas sobre leitos de neuritos de gânglios da raiz dorsal para produzir culturas co-mielinizantes. Esta próxima seção descreverá os métodos para produzir essas culturas.Para começar, isole espinhas inteiras de camundongos P5 a P10 e transfira-as para um microscópio de dissecação com tesoura de dissecação. Corte a região medial ventral da coluna de forma longitudinal. Remova cuidadosamente os gânglios da raiz dorsal ou DRGs com pinças de ponta fina em quatro etapas.Transfira os gânglios para solução salina tamponada de Hank em uma placa de Petri. Apare as raízes excessivamente longas de quaisquer GRDs. Utilizando uma ponteira larga para pipeta P 1000.Transfira os gânglios para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Mantenha o tubo no gelo até que todos os camundongos tenham sido processados. Quando o isolamento dos gânglios da raiz dorsal estiver concluído, centrifugue o tubo a aproximadamente 300 ×g.Transfira o tubo para uma câmara de cultura celular estéril e remova o sobrenadante. Adicione 500 microlitros de papaina DRG pré-aquecida ao tubo e incube em banho-maria a 37 graus por 10 minutos. Quando a digestão com pepina estiver completa, centrifugue e, em seguida, substitua a solução de papaina.Com 500 microlitros de uma solução de colagenase A pré-aquecida, incubar a 37 graus por 10 minutos. Repetir o passo de centrifugação e substituir a solução de colagenase A por um mililitro de meio de cultura DRGN. Após o passo final de centrifugação, adicionar um mililitro de meio DRGN e, com uma pipeta de vidro Pasteur flamejada, tri.Avalie os gânglios lentamente no início, depois com intensidade crescente à medida que o tecido começar a se dissociar. Uma vez que não sejam mais visíveis fragmentos de tecido, transfira a suspensão celular para uma placa de Petri contendo sete mililitros de meio DRGN. Incube a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius e 8,5% de CO₂ por uma hora e um quarto.Após esta incubação, observe a placa de Petri. Em contraste de fase, os neurônios dos gânglios da raiz dorsal são evidenciados como células de corpo grande. Muitas células contaminantes devem estar firmemente aderidas à placa de Petri.Transfira o meio para um tubo cônico de 15 mililitros e enxágue a placa com quatro mililitros de meio DRGN para coletar todos os neurônios remanescentes. Centrifugue o tubo cônico a 300 ×g por cinco minutos. Re-suspenda o pellet resultante em 500 microlitros de meio DRGN.Conte as células utilizando um citômetro HEO. Certifique-se de contar apenas os neurônios de gânglio da raiz dorsal, semeando de 30 a 50.000 neurônios por lamínula revestida de 12 milímetros em um mililitro de meio de cultura de DRGN. Incube as células em um incubador de cultura de tecidos com 8,5% de CO2.Na manhã seguinte, realize uma troca completa do meio substituindo o meio DRGN por meio OL suplementado com 10 micromolar de FUD R a cada dois dias. Após isso, realize uma troca de três quartos do meio com meio OL suplementado com FUD r. Quando examinados ao microscópio de contraste de fase no primeiro dia, os neurônios já começaram a estender alguns prolongamentos. No terceiro dia, os prolongamentos neuronais se alongaram.No sexto dia, formou-se uma rede de neuritos composta por muitos processos entrelaçados. No nono dia, essa rede de neuritos aumentou em densidade e está pronta para receber oligodendrócitos a partir de culturas mistas de cérebro em crescimento. Paralelamente às culturas de neurônios, as células precursoras de oligodendrócitos podem ser purificadas no nono dia das culturas de neurônios.Em seguida, podem ser semeadas sobre leitos de neuritos, adicionando 50.000 células a cada poço de uma placa de 24 poços. No sexto dia de cultivo em co-cultura, células semelhantes a oligodendrócitos podem ser observadas interagindo com os neurônios de gânglios da raiz dorsal.Essas culturas podem agora ser fixadas e processadas para imunocitoquímica. Quando culturas enriquecidas de oligodendrócitos são marcadas com anticorpos contra os marcadores de oligodendrócitos, células imunopositivas para NG2 e MAG são evidenciadas, exibindo morfologias específicas de estágio. Essas culturas originam-se como uma população de precursores de oligodendrócitos positivos para NG2 e, ao longo dos seis dias de diferenciação, produzem oligodendrócitos maduros positivos para MAG.Quando a eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS é realizada em lisados obtidos de culturas enriquecidas em oligodendrócitos, pode-se observar que os oligodendrócitos expressam CNPP e MVP ao longo do período de seis dias. Ao analisar os neurônios do gânglio da raiz dorsal antes da adição de oligodendrócitos, observam-se, no nono dia, leitos densos de neuritos positivos para Taj1 e neurofilamentos. No sexto dia de co-cultivo de oligodendrócitos com neurônios do gânglio da raiz dorsal, muitos oligodendrócitos positivos para MBP podem ser vistos interagindo com os neuritos neuronais em maior aumento.Observa-se que oligodendrócitos envolvem esses neuritos com membrana positiva para MBP, semelhante à mielinização; uma ampliação digital mostra o grau de sobreposição da membrana positiva para MVP sobre o processo positivo para neurofilamento. Olá, sou Scott Ryan, pesquisador pós-doutorando no Instituto de Pesquisa do Hospital de Ottawa. Essas técnicas fornecem um meio de gerar sistemas de co-cultivo de ligamento, endócito e neurônios de gânglio da raiz dorsal a partir de camundongos.Essa técnica é valiosa no estudo de modelos experimentais induzidos e transgênicos de doenças mielinizantes. Também é eficaz para triagem de novos compostos terapêuticos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo descreve a derivação de gliais Precursores restritos a partir de medulas espinais fetais e mantido in vitro, quer para transplantação ou para o estudo da linhagem oligodendrocytic.

Derivação da glia Precursores restritos de camundongos E13

Primário, fetais humanos derivado do cérebro, as células progenitoras multipotenciais...

Progenitor derivado Sistema de Cultura oligodendroglial Cérebro Fetal Humano

Este vídeo demonstra um protocolo detalhado para isolar as paredes laterais do ventrículo do cérebro de camundongo adulto e realizar a dissociação enzimática do tecido para obter células únicas. Essas células são então submetidas a condições específicas de cultura que aumentam seletivamente a proliferação de células-tronco neurais e promovem sua diferenciação em co-culturas de oligodendrócitos e astrócitos.

Obtenção de uma cultura mista de oligodendrócitos e astrócitos a partir de células-tronco neurais de camundongos adultos

Este vídeo demonstra o processo de geração de células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) a partir de células-tronco embrionárias humanas, seguido pela maturação de OPCs em oligodendrócitos. Esse processo de geração de oligodendrócitos abre vários caminhos para melhorar a pesquisa e o tratamento de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer.

Diferenciando células-tronco embrionárias humanas em oligodendrócitos

Este vídeo demonstra o estabelecimento de uma co-cultura de neurônios induzidos humanos (iNs) e células precursoras de oligodendrócitos induzidos (iOPCs). Os iNs são misturados com iOPCs em uma co-cultura e depois incubados para apoiar a maturação de ambos os iNs em neurônios e iOPCs em oligodendrócitos. Os neurônios formam conexões sinápticas com outros neurônios e oligodendrócitos, enquanto os oligodendrócitos desenvolvem bainhas de mielina ao redor dos axônios dos neurônios.

Um método de co-cultura para modelar interações neurônio-oligodendrócitos

O vídeo demonstra um protocolo para diferenciar células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) em oligodendrócitos e induzir mielinização em uma co-cultura com neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG). As OPCs são transduzidas com vetores lentivirais que codificam uma proteína sinalizadora que regula a mielinização. Os OPCs transduzidos são co-cultivados com neurônios DRG para avaliar a diferenciação em oligodendrócitos e a mielinização induzida por proteína de sinalização.

Um ensaio de mielinização induzida por transdução in vitro para células precursoras de oligodendrócitos

Os oligodendrócitos são as células mielinizantes do sistema nervoso central. Este protocolo descreve um método para o isolamento e cultivo de seus precursores, células progenitoras de oligodendrócitos, a partir de córtices de ratos, bem como um método quantitativo rápido e confiável para avaliar a oligodendrogênese in vitro em resposta a fatores experimentais.

Preparação de culturas de Rat Oligodendrocyte progenitoras e quantificação de Oligodendrogenesis Usando Scanning Fluorescência Dual-infravermelho

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Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

Aqui, apresentamos um método eficiente para a purificação de oligodendrocytes e produção de meio condicioso oligodendrocyte que pode ser usado para experimentos de cocultura.

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Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos

Descrevemos a produção de culturas mistas de astrócitos e células precursoras oligodendrocytes derivadas de células-tronco neurais fetais ou adultas se diferenciando em oligodenrócitos maduros, e modelagem in vitro de estímulos nocivos. O acoplamento com uma técnica de triagem de alto conteúdo baseada em células constrói um sistema de triagem de drogas confiável e robusto.

Análise de diferenciação e maturação de rastreamento de alto conteúdo das culturas celulares precursoras do Oligodendrocyte, derivadas de células-tronco-tronco-tronco-de-alto teor

Aprenda a derivar culturas enriquecidas de células precursoras de oligodendrócitos de camundongos neonatos e a estabelecer co-culturas mielinizantes com neurônios de gânglio da raiz dorsal. Este protocolo detalhado permite estudar biologia de oligodendrócitos e processos de mielinização in vitro.

Derivação de Enriquecido Culturas oligodendroglial e Neuron / oligodendroglial Myelinating Co-culturas de tecidos pós-natais murino (Vídeo) | JoVE Journal

Derivação de Enriquecido Culturas oligodendroglial e Neuron / oligodendroglial Myelinating Co-culturas de tecidos pós-natais murino

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