Monitoramento da ubiquitina-proteassoma Atividade em células vivas Usando um Degron (dgn) desestabilizado Green Fluorescent Protein Protein Repórter (GFP) com base em

O objetivo geral deste procedimento é medir a atividade do proteassoma em células vivas usando uma proteína de fusão GFP Deron. Primeiro, clone os oligonucleotídeos personalizados para Deron e Deron frameshift. Entre no vetor P-E-G-F-P-C e continue com os protocolos para o sistema gateway no Vitrogen, em seguida, produza vírus para cada construção usando células HEK 2 93 FT. Após determinar o título, transduza as células com o vírus e aplique seleção antibiótica, então expanda as células expressando GFP DRON ou GFP Dron frameshift resultantes.

Esta técnica facilita experimentos que monitoram respostas celulares a determinados tratamentos por meio de medições de sinal de fluorescência. Por exemplo, a atividade do proteassoma pode ser facilmente avaliada usando epifluorescência ou citometria de fluxo. A principal vantagem desta técnica sobre métodos existentes, como ensaios lumino ou fluorogênicos usando células inteiras, é que a atividade do proteassoma é medida em células vivas. Para a transfecção, dilua 36 microlitros de reagente lipo 2000 em 1,5 mililitros de DMEM em outro tubo falcon de 15 mililitros, dilua as construções de DNA em 1,5 mililitros de DMEM.

Após cinco minutos, combine os dois e incube por 20 minutos à temperatura ambiente. Agora, substitua o meio de uma cultura confluente de células HEK 2 93 FT em um frasco T 75 com sete mililitros de DMEM. Em seguida, adicione a mistura de DNA lipo ao frasco e misture balançando para frente e para trás.

Incube o frasco durante a noite a 37 graus Celsius em um incubado em 5% de CO2. No dia seguinte, substitua o meio com 10 mililitros de DMEM. Após 48 horas, colete o sobrenadante. Filtre o sobrenadante contendo o vírus através de um filtro PVDF de 0,45 micrômetro.

Para concentrar o vírus, adicione um volume de solução de PEG a quatro volumes de sobrenadante e incube por duas horas a quatro graus Celsius com mistura periódica por inversão. Colete o vírus por centrifugação após aspirar o SNA do pellet branco. Centrifugue novamente para remover qualquer solução de PEG restante. Ressuspenda o pellet final em PBS por pipetagem, em seguida, vortex vigorosamente por 20 a 30 segundos.

Armazene 100 microlitros de alíquotas de vírus a menos 80 graus centígrados. Sembre células U2 OS em placas de seis poços e incube durante a noite. Para transfecção, substitua o meio de cultura por um mililitro de DMEM contendo oito microgramas por mililitro. Reserve uma poça como controle positivo e teste uma série de concentrações virais nas poças restantes.

Incube durante a noite no dia seguinte. Substitua o meio por dois mililitros de DMEM e incube por 24 horas. Comece a seleção com 10 microgramas por mililitro de blasticine e continue substituindo o meio contendo antibiótico a cada segundo dia.

Aproximadamente seis a sete dias depois, verifique a morte celular das não transduzidas. Em seguida, lave as células três vezes com PBS para corar as células. Cubra com violeta de cristal e incube por cinco a 10 minutos à temperatura ambiente, depois aspire o corante, enxágue a placa duas vezes com água destilada dupla e deixe secar no ar.

Finalmente, conte as colônias para calcular as unidades de transfecção do vírus por mililitro. Sembre fibroblastos diploides humanos em placas de seis poços com oito microgramas por mililitro de poly brain como potencializador de transdução.

Use uma multiplicidade de infecção de dois em um total de um mililitro. Mude o meio. No dia seguinte, quando a cultura estiver 70 a 80% confluente.

Comece a seleção crônica com 10 microgramas por mililitro de blasticina. Afaste-se nos dias seguintes, monitorando a morte celular completa indicando que a seleção está completa. Expanda as células transduzidas de forma estável para gerar uma linhagem celular estável expressando proteínas de fusão GFP DERON ou GFP Deron Frameshift. Comece semeando células que carregam GFP DRON ou GFP DRON frameshift no dia seguinte, três horas antes dos fatos.

Trate as células de controle com um inibidor de protossomo. Lave duas vezes com PBS e colete as células usando 0,5 mililitros de tripsina. Para parar a tripsina.

Use 4,5 mililitros de meio de cultura e transfira as células para um Falcon de 15 mililitros. Colete as células por centrifugação. Após uma lavagem com PBS, ressuspenda o pellet em 400 microlitros de tampão fax. Transfira as células para tubos fax e coloque no gelo.

Agora meça as amostras por citometria de fluxo. A proteína de fusão GFP Deron carrega uma sequência que é direcionada para o proteassoma para degradação imediata. Em contraste, o mutante de mudança de fase GFP Deron FS não é degradado pelos proteassomas.

Portanto, quando transduzidas com GFP Deron, jovens fibroblastos humanos implantados com atividade proteassomal esperada mostram um baixo sinal fluorescente sob epifluorescência. As mesmas células transduzidas com GFP Deron Frameshift exibem 39,7% de células positivas. O tratamento das células com o inibidor de proteassoma ll e L resulta em sinais aumentados para um máximo de aproximadamente 63% em ambas as células GFP dron e GFP Dron frameshift.

Medições semelhantes em fibroblastos dérmicos, isolados de doadores jovens, de meia idade e idosos, revelam um aumento claro no sinal GFP entre indivíduos jovens e doadores de meia idade, indicando uma diminuição na atividade do protossomo em amostras obtidas de doadores idosos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir partículas lentivirais, transfectar células e determinar a atividade do proteassoma em células vivas.