Monitoramento da ubiquitina-proteassoma Atividade em células vivas Usando um Degron (dgn) desestabilizado Green Fluorescent Protein Protein Repórter (GFP) com base em

O objetivo geral deste procedimento é medir a atividade do proteassoma em células vivas utilizando uma proteína de fusão GFP-Deron. Primeiro, clone os oligonucleotídeos personalizados para Deron e para a troca de quadro de leitura de Deron. Insira no vetor P-E-G-F-P-C um e prossiga com os protocolos para o sistema Gateway da Vitrogen, depois produza vírus para cada construto utilizando células HEK 293 FT. Após determinar a titulação, transduza as células com o vírus e aplique a seleção com antibiótico, então expanda as células estáveis resultantes que expressam GFP-Dron ou GFP-Dron com troca de quadro de leitura.

Essa técnica facilita experimentos que monitoram as respostas celulares a tratamentos específicos por meio de medições de sinal de fluorescência. Por exemplo, a atividade do proteassoma pode ser facilmente avaliada utilizando microscopia de epifluorescência ou citometria de fluxo. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como ensaios luminogênicos ou fluorogênicos que utilizam células inteiras em ácidos, é que a atividade do proteassoma é medida em células vivas. Para a transfeção, dilua 36 microlitros do reagente lipo 2000 em 1,5 mililitro de DMEM; em outro tubo cônico de 15 mililitros, dilua as construções de DNA em 1,5 mililitro de DMEM.

Após cinco minutos, combine os dois e incube por 20 minutos à temperatura ambiente. Agora, substitua o meio de um cultivo confluinte de células HEK 293 FT em um frasco T75 por sete mililitros de DMEM. Em seguida, adicione a mistura de DNA-lipossoma ao frasco e misture, agitando suavemente de um lado para o outro.

Incube o frasco durante a noite a 37 graus Celsius em uma estufa com 5% de CO₂. No dia seguinte, substitua o meio por 10 mililitros de DMEM. Após 48 horas, recolha o sobrenadante. Filtre o sobrenadante contendo o vírus através de um filtro PVDF de 0,45 micrômetros.

Para concentrar o vírus, adicione um volume da solução de PEG a quatro volumes do sobrenatante e incube por duas horas a quatro graus Celsius com mistura periódica por inversão. Recolha o vírus por centrifugação após aspirar o SNA do pellet branco e centrifugue novamente para remover qualquer solução remanescente de PEG. Re-suspenda o pellet final em PBS usando Pipeta, depois vortexe vigorosamente por 20 a 30 segundos.

Armazene alíquotas de 100 microlitros do vírus a menos 80 graus centígrados. Semeie células U2 OS em placas de seis poços e incube durante a noite. Para transfeção, substitua o meio de cultura por um mililitro de DMEM contendo oito microgramas por mililitro. Poli cérebro reserve um poço como controle positivo e teste uma série de concentrações virais nos poços restantes.

No dia seguinte, incubar durante a noite. Substituir o meio por dois mililitros de DMEM e incubar por 24 horas. Iniciar a seleção com 10 microgramas por mililitro de blasticina e continuar substituindo o meio contendo o antibiótico a cada dois dias.

Aproximadamente seis a sete dias depois, verifique a morte celular das células não transduzidas. Em seguida, lave as células três vezes com PBS para colorir as células. Cubra com violeta cristal e incube por cinco a 10 minutos à temperatura ambiente; depois, aspire o corante, enxágue a placa duas vezes com água destilada duplamente e seque a placa ao ar.

Por fim, conte as colônias para calcular as unidades de transfeção do vírus por mililitro de semente. Plaqueie fibroblastos diploides humanos em placas de seis poços com oito microgramas por mililitro de polibrena como potencializador da transdução.

Utilize uma multiplicidade de infecção de dois em um total de um mililitro. Troque o meio. No dia seguinte, quando o cultivo estiver com 70 a 80% de confluência.

Inicie a seleção crônica com 10 microgramas por mililitro. Após alguns dias, monitore a morte celular completa, indicando que a seleção está concluída. Expanda as células transduzidas de forma estável para gerar uma linhagem celular estável que expresse as proteínas de fusão GFP DERON ou GFP Deron com quadro de leitura deslocado. Comece semeando as células que carregam GFP DRON ou GFP DRON com quadro de leitura deslocado no dia seguinte, três horas antes dos fatos.

Trate as células-controle com um inibidor de protossoma. Lave duas vezes com PBS e recolha as células usando 0,5 mililitros de tripsina. Para interromper a tripsina.

Utilize 4,5 mililitros de meio de cultura e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Recolha as células por centrifugação. Após uma lavagem com PBS, re-suspenda o pellet em 400 microlitros de buffer fax. Transfira as células para tubos fax e coloque no gelo.

Agora, meça as amostras por citometria de fluxo. A proteína de fusão GFP Deron carrega uma sequência que é direcionada ao proteassoma para degradação imediata. Em contraste, o mutante por quadro de leitura GFP Deron FS não é degradado pelos proteassomas.

Portanto, quando transduzidas com GFP Deron, fibroblastos humanos jovens com atividade proteassomal esperada alta exibem um sinal fluorescente baixo sob fluorescência epiluminescente. As mesmas células transduzidas com GFP Deron Quadro de Leitura Deslocado apresentam 39,7% de células positivas. O tratamento das células com o inibidor de proteassoma ll e L resulta em sinais aumentados, atingindo um máximo de aproximadamente 63% tanto em células GFP dron quanto em células GFP Dron com quadro de leitura deslocado.

Medições semelhantes em fibroblastos dérmicos, isolados de doadores jovens, de meia-idade e idosos, revelam um aumento nítido no sinal GFP entre indivíduos jovens e doadores de meia-idade, indicando uma diminuição na atividade do proteassoma em amostras obtidas de doadores idosos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir partículas lentivirais, transfectar células e determinar a atividade do proteassoma em células vivas.