Name: Construção de um baixo orçamento Laser Sistema axotomia para estudar a regeneração do axônio em C. elegans /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a montar e alinhar um sistema de axotomia a laser de baixo custo para estudar regeneração axonal em C. elegans. Este método permite cortes precisos com mínimo dano colateral.

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Esta pesquisa foi apoiada pela National Science Foundation, o McKnight Endowment Fund for Neuroscience, o Christopher Reeve e Dana Foundation e Fundação Amerisure Charitable.

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<li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Existem várias boas discussões de microcirurgia laser com sistemas de laser diferentes 3,5-11. Lasers de femtossegundos IR são o &quot;padrão ouro&quot; para ablação a laser subcelulares 12 e conveniente se associado a um mecanismo de imagem, mas são muitas vezes demasiado caros para usuários individuais. Se você precisar de um laser de femtossegundos IR para imagens de sua amostra por causa da profundidade da imagem, então você provavelmente precisará de um para o laser axotomia. Tecidos transparentes com axônios alvo dentro de 30-50 hum da superfície são provavelmente viável com lasers de pulso azul e verde na faixa de 20 UJ / pulso direcionados através de uma lente de alta imersão na. Haverá mais danos colaterais com o nano e pico lasers segundo em comparação com o laser de femtossegundos, especialmente como a profundidade dos aumentos axônio alvo. C. elegans é transparente e todos os axônios estão dentro de 20-30 hum da superfície. Rotineiramente corte axônios motores que são dentro de 5 hum da superfície. Temos também facilmente cortar machadoons dentro do anel nervosas que são cerca de 20 hm a partir da superfície da cutícula. Encontramos o limite para o corte de axônios em cerca de 30-50 hum através do diâmetro de um verme adulto. É provável que o sistema de ablação a laser descrita aqui seria muito bem com muitas preparações diferentes que se ajustam aos critérios de transparência e profundidade de axônios alvo. Ainda assim, é um pouco surpreendente, dadas as vantagens teóricas dos lasers de femtossegundos IR, que nano e picosegundo 355 nm e 532 nm lasers executar tão bem para o laser axotomia em C. elegans 6,13. Não vemos diferenças na regeneração do axônio em resposta ao laser axotomia com nanossegundo 440 nm, 532 nm nanossegundo, e lasers de femtossegundos IR. Lasers de estado sólido 355 nm UV são sobre o mesmo custo que o diodo de 532 nm bombeado passivamente Q-Switched laser de estado sólido, mas exigem poderes para mais ou ótica que passam de forma eficiente estes comprimentos de onda mais curto. A maioria das ópticas são projetados para um bom desempenho com 400 visível -700 nm de luz. 355 nm lasers ofereceria algumas vantagens, tais como limiar 6 plasma reduzido, menor tamanho do local, e um passe longo dichroic seria eficiente direta de 100% do laser ablação para o alvo e permitir gravação simultânea de GFP sem perda de sinal da amostra. 440 nm lasers azuis manteria as vantagens de trabalhar com um laser de luz visível (o bom desempenho com a óptica padrão e de segurança). Infelizmente, o custo de um DPP Q-switched de estado sólido de 440 nm do laser é 3 vezes o custo de um laser de 355nm ou 532 nm de poder similar neste momento. Se nós estivéssemos projetando um novo sistema para C. elegans, onde a profundidade-alvo é mínima, poderíamos optar por uma lente UV transparente (custou cerca de US $ 3.000 para uma lente de óleo 40X 1.3na com 50-70% de transmitância em 355nm) e um laser de 355 nm produzindo UJ 10/05 / pulso a 1 kHz -20. Ablação axônio é pensado para ser devido à formação de plasma. Pulsos curtos produzirá limiares plasma em baixa potência e os volumes de plasma w<html> doente ser menor 6. O objetivo é produzir o plasma menor e mais curto de vida, ajustando a energia de pulso para o menor poder. Maiores de longa duração plasmas irá gerar bolhas de cavitação que os danos que envolve as células. Temos encontrado geralmente que a ablação utilizando cerca de 50-100 pulsos na freqüência mais alta (isto é, 2,5 kHz) dá os melhores resultados. Isto sugere que os danos podem ser gradualmente integrada sobre uma série de pulsos para controlar melhor a extensão dos danos. O sistema de ablação a laser descrita aqui é muito perdoar se o feixe esteja alinhado e expandido com precisão. Começamos corte axônios em vermes adultos em potência do laser de 10% (média de 0,3 mW medido em 2500 Hz e cerca de 1 UJ / pulso) e pode cortar com danos localizados limitada pelo poder de 14%. Você pode observar áreas maiores de dano 15-39% de potência do laser, mas só acima do poder de 40% (cerca de 1 MW médios medidos em 2500 Hz) fazer o worms explodir devido a bolhas de cavitação e grandes danos à cutícula do verme. e_content &quot;&gt; O Steinmeyer et al. 2010 de papel 2 é um excelente recurso para a construção de um sistema de ablação por laser. Leon Avery também tem uma boa descrição prática de um sistema de ablação a laser baseado em um laser de gás N2 barato nm 337 e ele fornece algumas práticas grande conselho (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). Ao projetar seu próprio sistema você deve primeiro conversar com o seu representante microscópio para determinar como alvo o laser ablação para a objetiva do microscópio. Seu microscópio deve ser montado sobre uma mesa de isolamento de vibração (Newport, TMI, Thor). A top breadboard é o ideal, mas uma parte superior de aço sólido ainda pode ser usado com posicionadores magnético. Um módulo dedicado intermediário em um escopo de pé é bom porque todos os elementos ópticos podem ser deixados no local. No entanto, ele pode ser menos caro e mais conveniente usar uma porta da câmera (invertido) ou um &quot;combinador&quot; ligado a uma porta de epi-fluorescente. Você precisa saber o tamanho da abertura para trás e para a transmissão (ao um<html> blation laser de comprimento de onda) da lente objetiva que você pretende usar. Depois de decidir sobre um laser (por exemplo, Crylas, TEEM, Crystal, ou CRC), você deve entrar em contato Thor ou Newport para ajudar com a seleção correta dos elementos ópticos, equipamentos de hardware e segurança. Decidimos em um expansor de feixe duplo de Galileu para economizar espaço, mas uma simples expansão de Kepler é uma opção (f2/f1 = fator de expansão). Um expansor de feixe personalizado será menos caro, mas Newport, Thor, e vários dos fabricantes de laser oferecem uma excelente qualidade comercial feixe de expansores. Alguns fabricantes também oferecem a laser atenuadores manual e eletronicamente controlado, que pode ser rentável e economia de espaço, mas não tão versátil como o polarizador Glan-Thompson e placa de meia onda. Você também precisa decidir como controlar a laser. Você pode projetar um controlador baseado em LabView, use um gerador de TTL comercial, ou software fornecido pela empresa laser. Discutir as opções com o fabricante de laser específico. tenda &quot;&gt; Nós fornecemos uma lista de hardware que temos usado apenas como um guia geral. O sistema descrito aqui custa cerca de $ 15.000, quando adicionado em nosso sistema de imagem existente. O departamento de Física locais, muitas vezes, tem alguém disposto a oferecer uma introdução prática ao com segurança trabalhando com lasers de feixe livre. Métodos alternativos para imobilização e lapso de tempo de imagem de C. elegans foram recentemente descritos. 14 Solução de problemas O passo mais difícil e crítica é o alinhamento do feixe centrado expandiu-se para o eixo óptico do microscópio. Depois de ter o feixe centrado e expandido através das lentes de Galileu que você deve trabalhar duro para obtê-lo alinhado dentro de 5 de hum eixo óptico do microscópio ANTES de usar os espelhos de direcção para o alinhamento final para o centro. Uso excessivo dos espelhos de direção para alinhar o feixe para o microscópio vai movê-lo fora do eixo através do feixeexpansor. USANDO EXTREMO CUIDADO você pode atenuar o feixe de laser com o filtro ND apropriado e visualizar diretamente o perfil de feixe de laser sobre um alvo refletivo (espelho de superfície frontal). Você pode gentilmente empurrar o microscópio com precisão centro do feixe no campo objetivo 60X de vista (se ele não pode ser centrada para cima / para baixo faixa que você precisa para ajustar a altura do trilho). O perfil do feixe pode ser usado para alinhar precisamente o eixo microscópio óptico para dar um feixe centrado que é circular e &quot;flares&quot; simetricamente. Um alargamento assimétrico é uma indicação de que o eixo do microscópio não está perfeitamente alinhado (ou o trilho não é nível). Finalmente, você deve ajustar L3 e ver uma expansão ainda e simétrica e contração do feixe. O foco do microscópio precisamente sobre a superfície do alvo e depois ajustar L3 para focar o feixe de laser para o menor ponto. Agora você deve achar que o feixe de laser é dentro de 5 hum do centro quando fotografada através LSCM ou sistema CCD eo local está dentro de ablação1um de foco Z. Se você achar que você está &quot;explodindo&quot; worms ou consistentemente gerar bolhas de cavitação grande para cortar axônios seu problema é mais provável que o alinhamento fino do laser de ablação. Certifique-se que o mínimo (&lt;500nm) no local da ablação é localizada ao foco Z (ajustar a convergência com L3 lente) e para o local XY fiduciária (ajustar com espelho cinematicamente montado passado). Segmentação axônios mais perto da superfície vai exigir menos energia laser. Da mesma forma, animais menores (L1 e L2) irá requerer menos energia do laser para axotomia em comparação com a segmentação dos axônios mesmo em adultos. Se o seu axônios de tipo selvagem não se regeneram ou a lixívia axônios você deve tentar reduzir a potência do laser de imagens ou diminuindo a taxa de amostragem. Se o seu worms morrem ou ficam doentes tente reduzir o percentual Agarose em passos de 1%. Verifique se você não está movendo a lamela após worms montagem como esta, muitas vezes, levá-los a morrer ao usar alta porpercentual de agarose e microesferas. Se o seu worms estourar ou morrer durante uma sessão de lapso de tempo é devido a: 1. Percentual de agarose é muito alto. 2. Danos à cutícula ablação por laser. 3. Movimento de lamela após a montagem. Em caso de danos à cutícula é a culpa será só afetam worms montada que têm sido alvo com o laser de ablação. Se o seu verme se move muito durante uma sessão de lapso de tempo tentar aumentar o percentual de agarose em passos de 0,5%. Axônios saudável em vermes saudáveis ​​são sempre &quot;ativo&quot; e apresentar um nível consistente de fluorescência. Se você ver uma diminuição súbita da fluorescência ou atividade do worm está morrendo ou morto. Múltiplos axônios de contas ou fragmentados são um sinal certo de um worm morrendo ou morto. Se você tiver problemas para manter seus axônios em foco durante toda a sessão lapso de tempo, pode haver vários problemas diferentes. Primeiro verifique a sua fase de drift por imagem uma amostra inerte sobre uma lâmina de vidro com mais de 10 hrs. A deriva poucos microns pode ser devido à instabilidade térmica, mas superior a 5 hum é provavelmente devido a problemas mecânicos com seu microscópio. Problemas com a montagem são mais comuns. Deixe sua worms montado equilibrar com o seu estágio do microscópio por 30 minutos antes de iniciar o seu lapso de tempo. Verifique se o seu selo vaselina não desenvolveram vazamentos durante o curso de sua sessão de lapso de tempo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comments (opcional) </th></tr><tr><td> 535 nm Laser </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (TEEM, Crystal, e CRC também oferecem lasers comparáveis) </td></tr><tr><td> Todos os óptica e hardware </td><td></td><td></td><td> (Thor oferece ópticas comparáveis ​​e hardware) </td></tr><tr><td> SUPREMA Optical Monte, de 1,0 de diâmetro </td><td> Newport </td><td> SS100-F2KN </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Um &quot;post de diâmetro, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Um &quot;fork pós diâmetro </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Acromática Zero Order-Placa Wavel, ½ Retardo Wave, 400-700nm </td><td> Newport </td><td> 10RP52-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Estágio de rotação, 1 Abertura &quot; </td><td> Newport </td><td> RSP-1T </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Um &quot;post de diâmetro, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Um &quot;fork pós diâmetro </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Glan-Laser Polarizador Calcita, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polarizador de rotação Monte </td><td> Newport </td><td> RM25A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ¼ &quot;espaçador para um&quot; post diâmetro </td><td> Newport </td><td> PS-0,25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ½ &quot;de altura, um&quot; post diâmetro </td><td> Newport </td><td> PS-0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Garfo, uma pós &quot;de diâmetro </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Dump feixe </td><td> Newport </td><td> PL15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Microscópio Objetivo Montagem de Lente </td><td> Newport </td><td> LH-OBJ1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Um &quot;post de diâmetro, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Um &quot;fork pós diâmetro </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> High-Energy Nd: YAG laser Mirror, 25,4 mm de diâmetro, 45 °, 532 nm </td><td> Newport </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SUPREMA Optical Monte, 1.0 polegadas de diâmetro, furo espaço de montagem </td><td> Newport </td><td> SN100C-F </td><td> 2 </td></tr><tr><td> High Precision Parafuso de Ajuste Knob, 12,7 milímetros de viagens, 100TPI </td><td> Newport </td><td> AJS100-0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Adaptador de rosca, ¼ do sexo masculino -20, 8-32 feminino </td><td> Newport </td><td> SS-1-B </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod Grampo para haste de 1,5 polegadas de diâmetro </td><td> Newport </td><td> 340-RC </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, de 14 polegadas (35,5 cm) de altura </td><td> Newport </td><td> 40 </td&gt; <td> 1 </td></tr><tr><td> Transportador ferroviário para X26 duração quadrados, 40mm </td><td> Newport </td><td> CN26-40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Aço Rail, 384 milímetros de comprimento (15 &quot;) </td><td> Newport </td><td> X26-384 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rod Plataforma de 1,5 polegadas de diâmetro da haste </td><td> Newport </td><td> 300-P </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, de 14 polegadas (35,5 cm) de altura </td><td> Newport </td><td> 40 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-Concave Lens, 12,7 milímetros de diâmetro, EFL-25mm, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-Convexo Lens, 25,4 milímetros de diâmetro, 50,2 milímetros EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Plano-Convexo Lens, 25,4 milímetros de diâmetro, 62,9 milímetros EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Montagem de Lente fixa de 0,5 &quot;de diâmetro, 1,0&quot; de altura Axis </td><td> Newport </td><td> LH-0.5 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Montagem de Lente fixa, 1,0 &quot;de diâmetro, 1,0&quot; de altura Axis </td><td> Newport </td><td> LH-1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Microesferas 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> Assuntos EEO </td></tr><tr><td> Muscimol </td><td> Sigma </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

construção de um baixo orçamento laser sistema axotomia para estudar a regeneração do axônio em c. elegans</em

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomia seguido por microscopia de lapso de tempo é um ensaio sensível para a regeneração do axônio fenótipos em C. elegans 1. A principal dificuldade deste ensaio é o custo percebido (US $ 25-100K) e conhecimentos técnicos necessários para a implementação de um sistema de ablação a laser 2,3. No entanto, lasers de estado sólido de pulso de custos modestos (&lt;$ 10K) pode fornecer um desempenho robusto para ablação a laser em preparações transparente, onde os axônios alvo são &quot;próximas&quot; à superfície do tecido. Construção e alinhamento de um sistema pode ser realizado em um dia. O caminho óptico fornecido pela luz do condensador focado para o laser de ablação fornece um guia de alinhamento conveniente. Um módulo intermediário com todos os óptica removido pode ser dedicado a ablação a laser e garante que nenhum dos elementos ópticos precisam ser movidas durante uma sessão de ablação por laser. A dicróicas no módulo intermediário permite gravação simultânea e ablação a laser. Centralizar o feixe de laser to feixe de saída a partir da lente focada microscópio condensador orienta o alinhamento inicial do sistema. A variedade de lentes são usadas para condicionar e expandir o feixe de laser para encher a abertura parte de trás da lente objetiva escolhido. Alinhamento e ensaios finais é realizada com uma superfície espelhada frente alvo lâmina de vidro. Potência do laser é ajustada para proporcionar um ponto de ablação tamanho mínimo (&lt;1um). O local da ablação é centrado com ajustes finos do espelho última cinematicamente montado para uma mira fixa na janela de imagem. Laser de energia para axotomia será de aproximadamente 10X maior do que o necessário para o ponto mínimo de ablação no slide-alvo (isto pode variar com o destino que você usa). Worms pode ser imobilizado por laser de axotomia e lapso de tempo de imagem através da montagem de blocos de agarose (ou em câmaras microfluídicos 4). Almofadas de agarose são facilmente feitas com 10% de agarose em solução salina equilibrada derretido em um forno de microondas. Uma gota de agarose fundida é colocado numa lâmina de vidro e achatado com outrolâmina de vidro em um bloco de cerca de 200 um de espessura (uma única camada de fita de tempo em lâminas adjacentes é usado como um espaçador). A &quot;Sharpie&quot; cap é usado para cortar um bloco de diâmetro uniforme circular de 13mm. Anestésico (1ul Muscimol 20mM) e microesferas (Chris comunicação fang Yen-pessoais) (2,65% 1ul Poliestireno 0,1 hm em água) são adicionados ao centro do painel seguido de 3-5 worms orientados para que eles estão mentindo em seus lados esquerdo. A lamela de vidro é aplicada e depois vaselina é usada para selar a lamela e evitar a evaporação da amostra.

Laser axotomia seguido por lapso de tempo de gravação é uma maneira sensível ao ensaio os efeitos das mutações no<em&gt; C. elegans</em&gt; Sobre a regeneração do axônio. A alta qualidade, mas barato, laser sistema de ablação pode ser facilmente adicionado a maioria dos microscópios. Lapso de tempo de imagem mais de 15 horas exige imobilização cuidadosa do worm.

Construção de um baixo orçamento Laser Sistema axotomia para estudar a regeneração do axônio em C. elegans</em

A axotomia a laser seguida de microscopia de lapso de tempo (time-lapse) é um ensaio sensível para fenótipos de regeneração axonal em C. elegans1. A principal dificuldade deste ensaio...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como montar e alinhar um sistema de ablação a laser para estudar a regeneração de axônios em CL gans. Isso é realizado primeiramente montando um laser, uma glândula, um polarizador Thompson, uma placa de onda semi-integral, um espelho defletor, um periscópio, um trilho e um espelho de trilho em uma placa de montagem. O próximo passo do procedimento é alinhar o feixe de laser ao feixe emergente da lente condensadora do microscópio.Em seguida, a lente expansora do feixe a laser é montada, alinhada e posicionada para centralizar o feixe a laser e torná-lo não divergente. O passo final do procedimento é tornar o ponto de ablação a laser congruente com o foco da imagem por meio de ajustes finos. Em última análise, é possível cortar com precisão axônios de meio mícron com dano mínimo ao tecido circundante utilizando o feixe a laser limitado pela difração, quando o alinhamento XY NC for imperfeito.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como os lasers de femtossegundo, é que ela é relativamente barata, custando 15.000. É praticamente isenta de manutenção e permite o corte muito preciso de axônios. Embora este método possa fornecer informações sobre a regeneração de axônios em *C. elegans*, também pode ser aplicado a outros sistemas, como moscas, peixe-zebra, camundongo, sistema nervoso periférico e células *in vitro*.Basicamente, qualquer célula que esteja a uma distância de 30 a 50 micrômetros da superfície. Comece com os componentes posicionados na matriz de contatos e fixe com parafusos o suporte do periscópio a laser e os apoios elevados do trilho. Este sistema utiliza um laser da Classe três B, que pode facilmente danificar seus olhos; portanto, por favor, leve a segurança com laser muito a sério.Fale com alguém do seu departamento local de física sobre como trabalhar com lasers de feixe livre com segurança. Sempre durante o processo de alinhamento, ajuste o laser na potência mais baixa. Quando você olhar através dos oculares, certifique-se de que o laser esteja mecanicamente encoberto e desligado.Agora, posicione primeiro o microscópio, alinhando-o com o eixo do trilho. Em segundo lugar, alinhe-o com o feixe de luz transmitida proveniente da lente do condensador do microscópio. Em terceiro lugar, alinhe ambas as extremidades do trilho com o feixe do condensador utilizando uma abertura ajustável ou lente fixada ao trilho.Use um nível e macacos de laboratório para ajustar a altura do trilho antes de prosseguir. Certifique-se de que ambas as extremidades do trilho estejam alinhadas. Agora, verifique se o feixe de laser está passando através da glândula, do polarizador Thompson e da placa de meia onda, e não está atingindo as bordas desses componentes durante a rotação.A placa de atenuação ajustará a potência do laser com todos os componentes fixados na base óptica. Ligue o laser, configure a frequência de pulso em modo contínuo de 100 e reduza a potência ao mínimo utilizando a placa de atenuação. Use um bilhete adesivo ou papel para lentes para visualizar o feixe do laser.Agora, eleve o feixe do laser a partir da placa óptica. Ajuste e fixe sequencialmente os espelhos montados cinematicamente, partindo do laser, para direcionar o feixe até o espelho montado na extremidade do trilho elevado. Ao final, o feixe do laser deverá estar alinhado aproximadamente ao centro dos espelhos, e os espelhos deverão estar orientados em torno de 45 graus em relação ao eixo do feixe do laser antes do alinhamento do feixe do laser com o feixe de luz transmitida do microscópio.Remova ou abra todos os filtros ND e diafragmas no módulo intermediário. Agora iniciamos o passo mais crítico para obter o corte preciso de axônios sem danos colaterais excessivos. Vamos alinhar o laser com precisão nos eixos x, y e z, com a potência de laser mais baixa possível, a fim de obter o menor ponto de ablação.Os feixes de laser e de luz transmitida podem ser vistos simultaneamente sobre o papel. Posicione o papel próximo à porta do microscópio para começar. Agora, inicie o alinhamento do laser utilizando os ajustes grosseiros no espelho na parte superior do periscópio e no espelho na extremidade do trilho.Coloque uma folha de papel entre a lente do condensador alinhada e a torreta de objetivas aberta. Continue usando os ajustes finos do espelho do trilho para alinhar o feixe do laser ao centro do feixe de luz transmitida maior. Agora, fixe o microscópio no lugar com grampos.Outras etapas para avaliar o alinhamento do laser podem ser encontradas no manuscrito escrito. Devem ser instalados expansores de feixe galileanos duplos para ampliar o feixe de laser de 300 mícrons 33 vezes, preenchendo assim a abertura traseira do objetivo de 10 milímetros. Comece montando as quatro lentes nos porta-lentes.Em seguida, fixe as lentes no trilho de modo que todas estejam no mesmo eixo óptico e exatamente ortogonais ao feixe do laser. Ligue o laser e ajuste-o à potência mínima e ao modo contínuo. Ajuste aproximadamente o alinhamento do feixe através de cada lente.Use papel para visualizar o feixe. Agora desligue o laser. Aplique um obturador de segurança ao laser e remova o microscópio do trajeto do feixe laser.Ligue novamente o laser e visualize-o em uma parede próxima. Use o ajuste fino das lentes para expandir o feixe. Em seguida, ajuste os dois últimos espelhos montados cinematicamente para alinhar o feixe em um círculo de brilho uniforme na posição estimada da abertura traseira do objetivo.Observe o tamanho e a uniformidade do feixe em relação ao papel. Em seguida, ajuste o feixe para convergência zero observando como o tamanho do feixe muda quando o papel é movido para mais longe da lente. Desligue o laser e acione o obturador mecânico.Deslize o microscópio de volta para o trajeto do feixe a laser usando os grampos fixos para definir o alinhamento correto. Substitua os grampos no lado livre do microscópio, mas não os aperte completamente. Agora ligue o laser.Remova o obturador de segurança e gire o revólver de objetivas para uma posição aberta usando papel na platina; um feixe a laser expandido e uniforme, centrado no feixe de luz transmitida do condensador, deve ser visível. Caso não esteja centrado, centralize os feixes afrouxando as braçadeiras do microscópio e movendo cuidadosamente o microscópio. Agora, acione o obturador de segurança e configure o laser no modo de disparo.Gire o objetivo de 60 vezes para a posição correta. Agora, visualize as arranhões na superfície de uma lâmina-alvo. Remova o obturador de segurança, dispare o laser de ablação e ajuste a potência do laser para obter o menor ponto de ablação possível.O ponto deve ser circular e estar a cinco a dez mícrons do centro da imagem, o centro, o ponto de ablacão. Usando os ajustes finos do espelho de trilho montado cinematicamente para manter o ponto centralizado e o perfil do feixe uniforme, será necessário ajustar iterativamente o espelho montado no trilho e o espelho do periscópio superior. Avalie o foco Z do laser movendo o foco para cima e para baixo sistematicamente em passos de um mícron, acionando o laser de ablacão em cada passo.Se o feixe estiver corretamente expandido e alinhado, com a convergência adequadamente ajustada, então deverá haver ablação máxima no foco da imagem e fraca ou nenhuma ablação, um mícron acima ou abaixo do foco. Se o ponto máximo de ablação estiver acima ou abaixo do foco da imagem, faça os ajustes finais no foco Z do feixe expandido movendo a lente L3 do telescópio galeano até que a ablação a laser coincida com o foco da imagem. Os nematoides foram montados em uma lâmina personalizada e os axônios foram ablacionados usando o sistema construído de laserexosomia, e a microscopia com imagens de tempo real da regeneração axonal foi muito robusta.Usando uma platina motorizada, foi possível cortar e imaginar rotineiramente cinco axônios em cinco animais diferentes em um único lâmina. O tempo de aquisição de imagens para os axônios foi o fator limitante.Cerca de 10% dos experimentos produziram filmes de lapso de tempo de alta qualidade. Os experimentos restantes forneceram todos dados bons, mas eram esteticamente menos atraentes devido a pequenos movimentos de tremor do verme que geralmente começavam após cinco a oito horas de imobilização. Ao tentar este procedimento, é sempre importante avaliar com precisão o alinhamento do laser nos eixos x, y e Z.O problema mais comum que as pessoas enfrentam ao tentar cortar axônios é o dano colateral ou a incapacidade total de cortar axônios, e isso quase sempre se deve a um laser desalinhado. Este sistema de ablação a laser e a técnica para visualizar a regeneração de axônios em c Agains permitirão que você analise rotineiramente o efeito de qualquer mutação genética na regeneração de axônios. NCL Agains.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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