Construção de um baixo orçamento Laser Sistema axotomia para estudar a regeneração do axônio em C. elegans

O objetivo geral deste procedimento é mostrar como montar e alinhar um sistema de ablação a laser para estudar a regeneração do axônio em gans CL. Isso é feito primeiro montando um espelho giratório de placa de meia onda polarizador Thompson de glândula laser, trilho de periscópio e espelho de trilho em uma placa de ensaio. A próxima etapa do procedimento é alinhar o feixe de laser ao feixe de saída da lente condensadora do microscópio.

Em seguida, a lente expansora do feixe de laser é montada, alinhada e posicionada para centralizar o feixe de laser e torná-lo zero divergente. A etapa final do procedimento é tornar o ponto de ablação a laser congruente com o foco da imagem, fazendo ajustes finos. Em última análise, é possível cortar com precisão axônios de meio mícron com danos colaterais mínimos ao tecido usando o feixe de laser limitado por difração quando é um alinhamento XY NC imperfeito.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como os segundos lasers Femto, é que ela é relativamente barata em 15.000. É relativamente livre de manutenção e fornece corte de axônio muito preciso. Embora este método possa fornecer informações sobre a regeneração do axônio do elgan do mar, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como moscas, camundongos peixe-zebra, sistema nervoso periférico e células in vitro.

Basicamente, qualquer célula que esteja dentro de 30 a 50 micrômetros da superfície. Comece com os componentes posicionados na placa de ensaio e aparafuse o poste do periscópio do laser e os suportes de trilho elevados. Este sistema usa um laser Classe três B que pode facilmente danificar seus olhos, portanto, leve a sério a segurança segura do laser.

Converse com alguém do departamento de física local sobre como trabalhar com lasers de feixe livre com segurança. Sempre durante o processo de alinhamento, ajuste o laser na potência mais baixa. Ao olhar pelas oculares, certifique-se de que o laser esteja fechado mecanicamente e que o laser esteja desligado.

Agora, posicione o microscópio primeiro, alinhe-o com o eixo do trilho. Em segundo lugar, alinhe-o com o feixe de luz transmitido da lente do condensador do microscópio. Terceiro, alinhe ambas as extremidades do trilho ao feixe do condensador usando uma abertura ajustável ou lente afixada no trilho.

Use um nível e macacos de laboratório para ajustar a altura do trilho antes de prosseguir. Certifique-se de que ambas as extremidades do trilho estejam alinhadas. Agora, certifique-se de que o feixe de laser esteja passando pela glândula, pelo polarizador Thompson e pela placa intermediária e não esteja atingindo suas bordas girando.

A placa intermediária ajustará a potência do laser com todos os componentes presos à placa de ensaio. Ligue o laser, defina a frequência de pulso para o modo contínuo 100 e reduza a potência ao mínimo usando a placa intermediária. Use um post-it ou papel de lente para visualizar o feixe de laser.

Agora, para trazer o feixe de laser da placa de ensaio. Ajuste e fixe os espelhos montados cinematicamente em sequência do laser para trazer o feixe até o espelho montado na extremidade do trilho elevado. Quando terminar, o feixe de laser deve ser alinhado aproximadamente ao centro dos espelhos, e os espelhos devem ser orientados aproximadamente 45 graus em relação ao eixo do feixe de laser antes de alinhar o feixe de laser com o feixe de luz transmitida do microscópio.

Remova ou abra quaisquer filtros ND e aberturas no módulo intermediário. Começamos agora a etapa mais crítica para fornecer um corte preciso dos axônios sem danos colaterais excessivos. Vamos alinhar o laser precisamente nos eixos x, y e Z com a menor potência do laser para fornecer o menor ponto de ablação.

O laser e os feixes de luz transmitidos podem ser vistos simultaneamente contra o papel. Posicione o papel próximo à porta do microscópio para começar. Agora comece a alinhar o laser usando os ajustes de curso no espelho na parte superior do periscópio e o espelho na extremidade do trilho.

Coloque um papel entre a lente do condensador alinhada e a torre da objetiva aberta. Continue usando os ajustes finos no espelho de trilho para alinhar o feixe de laser ao centro do feixe de luz transmitido maior. Agora, fixe o microscópio no lugar com grampos.

Etapas adicionais sobre a avaliação do alinhamento do laser podem ser encontradas no manuscrito escrito. Expansores de feixe galileano duplo devem ser instalados para expandir o feixe de laser de 300 mícrons 33 vezes para preencher a abertura traseira da objetiva de 10 milímetros. Comece montando as quatro lentes em suportes.

Em seguida, prenda as lentes ao trilho de forma que fiquem todas no mesmo eixo óptico e exatamente ortogonais ao feixe de laser. Ligue o laser e ajuste-o para a potência mínima e para o modo contínuo. Ajuste aproximadamente o alinhamento do feixe através de cada lente.

Use papel para ver o feixe. Agora desligue o laser. Aplique um obturador de segurança ao laser e remova o microscópio do caminho do feixe de laser.

Ligue o laser novamente e visualize-o contra uma parede próxima. Use o ajuste fino das lentes para expandir o feixe. Em seguida, ajuste os dois últimos espelhos montados cinematicamente para alinhar o feixe em um círculo de brilho uniforme na posição estimada da abertura traseira da objetiva.

Visualize o tamanho e a uniformidade do feixe em relação ao papel. Em seguida, ajuste o feixe para convergência zero observando como o tamanho do feixe muda à medida que o papel é movido para mais longe da lente. Desligue o laser e acione o obturador mecânico.

Deslize o microscópio de volta para o caminho do feixe de laser usando os grampos fixos para definir o alinhamento correto. Recoloque os grampos no lado livre do microscópio, mas não os aperte. Agora ligue o laser.

Remova o obturador de segurança e gire a torre da objetiva para uma posição aberta usando papel no palco e o feixe de laser expandido e uniforme centrado no feixe de luz transmitido do condensador deve ser visível. Se não estiver centralizado, centralize os feixes afrouxando os grampos do microscópio e empurrando cuidadosamente o microscópio. Agora acione o obturador de segurança e defina o laser para o modo de disparo.

Gire a objetiva 60 vezes no lugar. Agora imagem dos arranhões da superfície em um slide de destino. Remova o obturador de segurança, acione o laser de ablação e ajuste a potência do laser para o ponto mínimo de ablação.

O ponto deve ser circular e dentro de cinco a 10 mícrons do centro da imagem, centro, o ponto de ablação. Usando os ajustes finos do espelho de trilho montado cinematicamente para manter o ponto centralizado e o perfil do feixe uniforme, será necessário ajustar iterativamente o espelho montado no trilho e o espelho do periscópio superior. Avalie o foco Z do laser movendo o foco para cima e para baixo sistematicamente em etapas de um mícron acione o laser de ablação em cada etapa.

Se o feixe estiver corretamente expandido e alinhado e com convergência ajustada corretamente, ele deve ablar Se o ponto máximo de ablação estiver acima ou abaixo do foco da imagem, faça os ajustes finais no foco Z do feixe expandido movendo a lente L três do telescópio de Galileu até que a ablação a laser seja congruente com o foco da imagem. Os nematóides foram montados em uma lâmina personalizada e os axônios foram ablacionados usando o sistema construído Laser exosomy e a imagem de lapso de tempo da regeneração do axônio foram muito robustas.

Usando um estágio motorizado, foi possível cortar e visualizar de forma rotineira e precisa cinco axônios em cinco animais diferentes. Em um único slide. O tempo de imagem dos axônios foi o fator limitante.

Cerca de 10% dos experimentos produziram filmes de lapso de tempo de alta qualidade. Todos os experimentos restantes forneceram bons dados, mas foram esteticamente menos atraentes por causa de pequenos movimentos de tremor do verme que geralmente começavam após cinco a oito horas de imobilização. Ao tentar este procedimento, é sempre importante avaliar com precisão o alinhamento do laser nos eixos x, y e Z.

O problema mais comum que as pessoas têm ao tentar cortar o axônio é o dano colateral ou a completa incapacidade de cortar os axônios, e isso quase sempre se deve a um laser desalinhado. Este sistema de ablação a laser e técnica para visualizar a regeneração do axônio em c Agains permitirá que você teste rotineiramente o efeito de qualquer mutação genética na regeneração do axônio. NCL Agains.