Patch-clamp medidas de capacitância e Ca ^{2 +} Imaging nos terminais nervosos da retina único em Fatias

O objetivo geral deste procedimento é preparar fatias retinianas embebidas em ágar para o estudo dos microcircuitos localizados nos terminais nervosos das células bipolares pré-sinápticas. Isso é feito primeiro obtendo a retina de um olho de peixinho dourado adaptado ao escuro e cortando um pequeno pedaço retangular dessa retina. A peça retiniana é então imersa em uma solução de ágar transparente e de baixo ponto de fusão, que é então solidificada em uma boa solução de fatia fria.

O próximo passo é cortar o bloco de ágar sólido contendo o pedaço retangular de retina usando um vibrador. A etapa final é visualizar, identificar e corrigir. Prenda um terminal nervoso de célula bipolar.

Em última análise, os resultados mostram a corrente de cálcio pré-sináptica e a exocitose física sináptica com medições de capacitância de membrana de terminais celulares bipolares atomizados e intactos. Olá, meu nome é Han Kim. Sou pós-doutorando em PCO de laboratório no Burham Institute.

Hoje vou apresentar a preparação de fatia incorporada AGA de retina facial fria e demonstrar a medição de capacitância de grampo de remendo em um único pipeline de. Para iniciar este procedimento, faça uma bainha em cada olho de um peixinho dourado cortando uniformemente ao redor da frente do olho com uma tesoura de mola. Em seguida, coloque as oculares em uma solução de fatia gelada sem cálcio.

Se necessário, remova a lente com uma pinça. Em seguida, remova o epitélio pigmentar ligado à retina, retirando a retina da ocular com uma pinça fina de ponta inclinada de 45 graus. Depois disso, corte o nervo óptico com uma pinça fina ou uma tesoura de mola.

Em seguida, aplique a sucção com uma pipeta de massa modificada ou uma pipeta de transferência de ponta grande. Para remover a retina, remova suavemente o resto do epitélio pigmentar ligado à retina. A superfície da retina limpa e saudável deve parecer lisa.

Em seguida, trate a retina isolada com cerca de 0,03% de IDE mais alto por 15 a 30 minutos em temperatura ambiente. Para remover o humor vítreo, observe que o procedimento deve ser realizado com pouca luz. Na próxima etapa, corte um pedaço retangular de retina de cerca de dois por dois milímetros, que contém toda a espessura da retina, removendo as bordas curvas com uma lâmina de barbear.

Em seguida, transfira a peça da retina para um pequeno recipiente cheio de solução de ágar e tente minimizar a quantidade de solução ao redor da retina à medida que ela é colocada no ágar líquido. Em seguida, mergulhe a retina com o ágar-ágar diretamente na solução de fatia gelada para solidificar o ágar. Em seguida, corte o bloco de ágar sólido contendo o pedaço retangular de retina em um cubo de um por um centímetro.

Cole o bloco na superfície da placa de corte na câmara de fatiamento pré-fatiado. Em seguida, corte o bloco em fatias com espessura de 200 a 250 mícrons na solução de fatia gelada. Usando um vibrato, um total de cinco a 10 fatias podem ser obtidas, que são viáveis por cerca de cinco a seis horas.

Depois disso, transfira uma das fatias para a câmara de gravação. Coloque uma moldura de platina em forma de U com uma grade de fios de náilon no topo da fatia. Perfunda a fatia continuamente a uma taxa de um a dois mililitros por minuto com solução de registro borbulhada com carbogênio.

Nesta etapa, use uma seringa com uma ponta de filtro de 0,2 mícron para encher a pipeta de vidro com solução interna até um nível de um a dois centímetros da parte de trás da pipeta. Em seguida, remova as bolhas de ar da ponta depois. Prenda a pipeta no suporte.

Aplique pressão positiva na pipeta e mova-a em direção ao terminal desejado usando um micro manipulador enquanto move a ponta para baixo através da fatia. Mova a pipeta em uma direção de varredura lateral para garantir que a fatia não seja puxada junto com a ponta. Em seguida, mova a ponta da pipeta ao redor do terminal para limpar a superfície da membrana.

Empurre a ponta para baixo contra a borda do terminal para criar uma covinha e liberar a pressão positiva. Se uma vedação de giga ohm não for formada, aplique imediatamente uma leve pressão negativa na pipeta. Assim que uma vedação de giga ohm for formada, mude o patch clamp de nove patches E PC amplifier para o modo de gravação onsell e altere o potencial de retenção para menos 60 ou menos 70 milivolts.

Aplique a correção rápida de capacitância e aguarde a estabilização da vedação entre cinco a 10 giga ohms. Em seguida, rompa a membrana com sucção aguda e suave. Para estabelecer a configuração de gravação de célula inteira.

Você também pode usar a sucção bucal em vez de uma seringa. Depois que toda a configuração da célula tiver sido estabelecida em um terminal MB atomizado, aplique uma despolarização de 200 milissegundos de menos 70 a zero milivolts. Lembre-se de que uma onda senoidal de dois quilohertz em um modo de grampo de tensão é aplicada antes e depois dessa despolarização Para medir a capacitância da membrana, a despolarização permite a medição direta das correntes internas de cálcio ativadas pela abertura de canais de cálcio do tipo L dependentes de tensão com uma solução interna à base de césio.

Paralelamente, é possível monitorar o salto de capacitância causado pela exocitose dependente de cálcio das vesículas sinápticas, o que aumenta a área de superfície da membrana. Se uma célula bipolar MB intacta for remendada com a pipeta no terminal sináptico, nenhuma corrente de cálcio discernível será observada devido às grandes correntes de fuga devido ao acoplamento da junção comunicante nos direitos das células bipolares MB. O que se observa é um grande vazamento externo como corrente.

No entanto, ainda é possível monitorar o salto de capacitância com um estímulo sinusoidal de alta frequência ativado antes e depois da etapa de despolarização mostrada. Aqui estão os exemplos de I-R-D-I-C, imagens de terminais celulares bipolares M. Os terminais intactos são mais propensos a parecer elípticos, como mostrado em A e B, enquanto C mostra o terminal medido, que parece redondo e circular.

O método de preenchimento de corante também pode ser usado para classificar os terminais celulares. Aqui estão os exemplos das imagens de fluorescência dos terminais celulares bipolares MBI com um axônio intacto em D, um axônio parcialmente cortado em e e um axônio totalmente removido em F. Aqui mostram as medições diretas dos sinais de imagem de cálcio, exocitose e feedback inibitório.

Em um terminal de célula bipolar MB, uma concentração transitória de cálcio crescente na teleria de um terminal MB foi ativada por uma despolarização da etapa de pinça de tensão em um a imagem de fluorescência correspondente da teleria MB pode ser vista em B.Exemplos de depressão sináptica de curto prazo da liberação de neurotransmissores são mostrados em C.Ao tentar este procedimento, É importante lembrar de minimizar a quantidade de solução ao redor da retina à medida que ela é colocada no ágar kit. Isso melhorará a fixação do latinizado do bloco de ágar.