Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro

O objetivo geral deste procedimento é gerar fatias organotípicas do mesencéfalo embrionário do neurônio E 12.5 para a análise de neurônios dopaminérgicos em desenvolvimento. Isso é feito dissecando primeiro o cérebro embrionário. Em seguida, o cérebro é incorporado em aeros de baixo derretimento.

O terceiro passo é seccionar as fatias do cérebro usando um vibrador. A etapa final é escolher a fatia direita do cérebro para cultura e imagens de lapso de tempo. Em última análise, a imagem de lapso de tempo e a microscopia de imunofluorescência são usadas para mostrar os primeiros passos dos neurônios dopaminérgicos, comportamento migratório e diferenciação.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do neurodesenvolvimento, como seguir neurônios e comportamento migratório durante o desenvolvimento ventral do cérebro. Um dia antes da dissecação, prepare um tampão X Krebs e o meio de cultura de acordo com o manuscrito acompanhado cerca de duas horas antes da dissecação. Prepare 100 mililitros de aros de baixo ponto de fusão a 4% em tampão Krebs no micro-ondas da solução até que o aros esteja completamente dissolvido.

Em seguida, coloque o aros em um banho-maria a 45 graus Celsius. Em seguida, encha a bandeja de buffer Vibram com buffer Krebs gelado. Ligue o elemento de resfriamento e mantenha-o a quatro graus Celsius.

Depois disso, fixe uma lâmina de barbear no suporte da lâmina. Prepare um bisturi, um pincel fino e uma mini colher perfurada para pegar as fatias na área do vibrador para posterior seccionamento. Em seguida, adicione o tampão Krebs às placas de Petri estéreis e mantenha-as no gelo.

Na área de dissecação, prepare três grandes placas de Petri estéreis para dissecação e duas pequenas placas de Petri estéreis para embutir uma tesoura pequena, dois pares de pinças finas, uma mini colher perfurada, uma pipeta de pasto de vidro polida a fogo com uma ponta redonda fechada e um litro de tampão Krebs no gelo. Limpe todas as ferramentas de dissecção com etanol 70%. Em seguida, adicione meio de cultura aos poços de uma placa de seis poços e incube-o a 37 graus Celsius por duas horas.

Em seguida, adicione 1,5 mililitros de tampão Krebs com estreptomicina de penicilina a cada poço de outra placa de seis poços em condições estéreis. Coloque inserções de membrana de mili células nos poços. Coloque a placa de seis poços ao lado do vibrato para que as fatias do cérebro possam ser transferidas para as membranas do filtro.

Imediatamente após a secção, sacrifique uma rata grávida com embriões no estágio E 12.5 e remova o útero levantando-o com uma pinça. Em seguida, use outro par de pinças para arrancar o miométrio do útero. Depois disso, coloque o útero em tampão Krebs gelado sob o microscópio.

Use uma pinça fina para separar a parede muscular do útero, a membrana de Riker e o saco vitelino visceral do embrião. Em seguida, remova os embriões do útero e mova o embrião para uma placa de Petri separada com tampão Krebs estéril. Em seguida, corte a cabeça de cada um dos embriões.

Fixe a cabeça perfurando-a ao nível dos olhos com uma pinça fina. Use outro par de pinças para remover cuidadosamente a pele e o crânio. Em seguida, levante cuidadosamente o cérebro e transfira-o para uma placa de Petri com tampão Krebs estéril.

Depois disso, lave os cérebros em 4% de baixo ponto de fusão aros. Incorpore dois a três cérebros de cada vez em 4% de aros frescos e de baixo ponto de fusão. Usando uma pipeta Pasteur com ponta redonda polida a fogo.

Em seguida, coloque os pratos de embutir no gelo o mais uniforme possível. Em seguida, levante os cérebros até que a parte inferior do aros esteja solidificada, para que os cérebros possam se acomodar uniformemente e ficar paralelos à parte inferior do bloco de aros. Quando o aros estiver totalmente solidificado, apare o aros ao redor do cérebro.

Depois dessa cola, o bloco aros no estágio de amostra do vibrador. Ao colar o bloco, certifique-se de que o lado ventral do cérebro esteja paralelo à plataforma. Corte fatias horizontais de 300 mícrons de espessura a uma frequência de 50 hertz, amplitude da lâmina de 1,1 milímetros e velocidade de 25 milímetros por segundo.

Colete as fatias de cérebro usando o pincel fino para empurrar a fatia para uma mini colher perfurada. Em seguida, transfira-os para um prato com tampão Krebs estéril e gelado sob o microscópio. Escolha a fatia que contém tecido do mesencéfalo ventral.

Nesta etapa, use uma mini colher perfurada e um pincel fino para transferir as fatias de cérebro para inserções de membrana de mili células em uma placa de seis poços com tampão de Krebs que foi preparada anteriormente. Em seguida, transfira as membranas com as fatias para outras seis. Bem placa com meio de cultura, mantenha a parte superior das membranas secas para que as fatias do cérebro recebam o meio de baixo e o ar de cima.

Coloque as fatias em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. É muito importante que as fatias sejam colocadas na incubadora dentro de duas horas após a etapa inicial da dissecção. Essas fatias podem ser mantidas in vitro por três a quatro dias.

Após quatro a cinco horas de recuperação. As fatias podem ser usadas em imagens de lapso de tempo logo antes da imagem. Adicione 1,5 microlitros, 200 milimolares de ácido ascórbico ao prato para proteger as fatias contra a fototoxicidade.

Incube as fatias em uma câmara ambiental a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a imagem de lapso de tempo. Aqui está uma fatia aguda mostrando a localização normal dos neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo ventral, no qual as projeções para o prosencéfalo ainda não se desenvolveram. Depois de um dia em cultura, as projeções para o prosencéfalo começam a se formar, conforme indicado pela seta amarela.

A ponta da seta branca indica a localização dos corpos celulares mostrados em maior ampliação nas inserções. Aqui está a raiz migratória dos neurônios marcados com YFP. Em um corte horizontal agudo, a posição inicial das células é marcada com uma ponta de seta vermelha.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar fatias genotípicas do mesencéfalo embrionário marinho E 12.5 para obter fatias viáveis e intactas. É importante realizar a dissecção do cérebro embrionário com cuidado e após a secção do vibrato para escolher a fatia de cérebro correta para cultura e imagem com lapso de tempo.