Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro

O objetivo geral deste procedimento é gerar fatias organotípicas do mesencéfalo embrionário de neurônios E 12,5 para a análise de neurônios dopaminérgicos em desenvolvimento. Isso é realizado primeiramente dissecando o cérebro embrionário. Em seguida, o cérebro é embutido em agarose de baixo ponto de fusão.

O terceiro passo é seccionar os cortes cerebrais usando um vibrátomo. O passo final é escolher o corte cerebral adequado para o cultivo e a microscopia com imagens de longa duração. Por fim, utiliza-se a microscopia de imagens de longa duração e a microscopia de imunofluorescência para demonstrar os estágios iniciais dos neurônios dopaminérgicos, o comportamento migratório e a diferenciação.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área do desenvolvimento neural, como o acompanhamento do comportamento neuronal e migratório durante o desenvolvimento do cérebro ventral. Um dia antes da dissecção, prepare um X de solução de Krebs e o meio de cultura conforme descrito no manuscrito anexo, cerca de duas horas antes da dissecção. Prepare 100 mililitros de agarose de baixo ponto de fusão a 4% na solução de Krebs aquecendo-a no micro-ondas até que a agarose esteja completamente dissolvida.

Em seguida, coloque os aros em um banho-maria a 45 graus Celsius. Depois, encha a bandeja de tampão Vibram com tampão de Krebs gelado. Ligue o elemento de refrigeração e mantenha-o a quatro graus Celsius.

Em seguida, fixe uma lâmina de barbear no suporte da lâmina. Prepare um bisturi, um pincel fino e uma colherinha perfurada miniatura para recolher as fatias na área do vibrátomo para posterior seccionamento. Então, adicione o tampão de Krebs às placas de Petri estéreis e mantenha-as sobre gelo.

Na área de dissecação, prepare três placas de Petri estéreis grandes para dissecação e duas placas de Petri estéreis pequenas para acomodar um par de tesouras, dois pares de pinças finas, uma colherinha perfurada miniatura, uma pipeta de Pasteur de vidro com ponta arredondada e fechada, polida ao fogo, e um litro de tampão de Krebs sobre gelo. Limpe todas as ferramentas de dissecação com etanol 70%. Em seguida, adicione meio de cultura aos poços de uma placa de seis poços e incube-a a 37 °C por duas horas.

Em seguida, adicione 1,5 mililitros de tampão de Krebs com penicilina estreptomicina em cada poço de outra placa de seis poços sob condições estéreis. Coloque os insertos de membrana milicelular nos poços. Posicione a placa de seis poços ao lado do vibrátomo para que as fatias de cérebro possam ser transferidas para as membranas filtrantes.

Imediatamente após o seccionamento, sacrifique uma fêmea de camundongo grávida com embriões no estágio E 12.5 e remova o útero levantando-o com um par de pinças. Em seguida, use outro par de pinças para rasgar o miométrio afastando-o do útero. Depois disso, coloque o útero em tampão de Krebs gelado sob o microscópio.

Use um par de pinças finas para separar a parede muscular do útero, a membrana de Riker e o saco vitelino visceral do embrião. Em seguida, remova os embriões do útero e transfira o embrião para uma placa de Petri separada com tampão de Krebs estéril. A seguir, corte a cabeça de cada um dos embriões.

Fixe a cabeça perfurando-a ao nível dos olhos com um par de pinças finas. Use outro par de pinças para remover cuidadosamente a pele e o crânio. Em seguida, levante cuidadosamente o cérebro e transfira-o para uma placa de Petri contendo solução salina de Krebs estéril.

Após isso, lave os cérebros em agarose a 4% de ponto de fusão baixo. Incorpore dois ou três cérebros por vez em agarose fresca a 4% de ponto de fusão baixo, utilizando uma pipeta de Pasteur com ponta redonda polida ao fogo.

Em seguida, coloque os recipientes de inclusão sobre gelo da forma mais nivelada possível. Depois, levante os cérebros até que a base do aros esteja solidificada, para que os cérebros possam assentar uniformemente e fiquem paralelos ao fundo do bloco de aros. Quando o aros estiver completamente solidificado, corte o aros ao redor dos cérebros.

Em seguida, cole o bloco de aros na platina do vibrátomo. Ao colar o bloco, certifique-se de que o lado ventral do cérebro esteja paralelo à plataforma. Seccione fatias horizontais com espessura de 300 mícrons, com frequência de 50 hertz, amplitude da lâmina de 1,1 milímetro e velocidade de 25 milímetros por segundo.

Colete as fatias cerebrais utilizando um pincel fino para empurrar a fatia até uma colher pequena perfurada. Em seguida, transfira-as para um recipiente com solução tampão de Krebs estéril e gelada sob o microscópio. Escolha a fatia que contém tecido do mesencéfalo ventral.

Nesta etapa, utilize uma colher pequena perfurada e um pincel fino para transferir os cortes cerebrais para inserts de membrana Millicell em uma placa de seis poços contendo tampão de Krebs preparado previamente. Em seguida, transfira as membranas com os cortes para outra placa de seis poços contendo meio de cultura, mantendo a parte superior das membranas seca, de modo que os cortes cerebrais recebam o meio por baixo e o ar por cima.

Coloque as fatias em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. É muito importante que as fatias sejam colocadas na incubadora dentro de duas horas após a etapa inicial da dissecação. Essas fatias podem ser mantidas in vitro por três a quatro dias.

Após quatro a cinco horas de recuperação. As fatias podem ser usadas em imagens com lapso de tempo logo antes da aquisição da imagem. Adicione 1,5 microlitros de ácido ascórbico 200 milimolar à placa para proteger as fatias contra fototoxicidade.

Incube as fatias em uma câmara ambiental a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a aquisição de imagens de lapso de tempo. Esta é uma fatia aguda mostrando a localização normal de neurônios dopaminérgicos na região ventral do mesencéfalo, na qual as projeções para o prosencéfalo ainda não se desenvolveram. Após um dia em cultura, as projeções para os prosencéfalos começam a se formar, conforme indicado pela seta amarela.

A seta branca indica a localização dos corpos celulares mostrados em maior ampliação nas inserções. Aqui está a raiz migratória de neurônios marcados com YFP. Em um corte horizontal agudo, a posição inicial das células é marcada com uma seta vermelha.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar fatias genotípicas do mesencéfalo embrionário de camundongo em E 12,5 para obter fatias viáveis e intactas. É importante realizar a dissecação do cérebro embrionário com cuidado e, após o corte com vibrosserrote, escolher a fatia cerebral correta para cultivo e imagem de lapso de tempo.