Seguindo o destino celular, em

O objetivo geral deste procedimento é utilizar um microscópio de fluorescência para acompanhar o sulfato em *E. coli* em tempo real após infecção pelo fago lambda. Comece criando um lisado bruto do fago lambda. Em seguida, purifique o fago e infecte *E. coli* com o fago lambda em um tubo.

Continue a acompanhar o destino das células bacterianas sob o microscópio. Em última análise, os resultados podem mostrar em tempo real os diferentes destinos celulares em *E. coli* por meio da expressão de diferentes proteínas fluorescentes associadas ao crescimento ou morte celular. Geralmente, um ponto de verificação para este método está na criação de um estoque purificado e rotulado de FI.

Para evitar a compartilhamento de figes durante a preparação e purificação, otimize também os parâmetros de imagem no microscópio para permitir o crescimento saudável das células. Inocule uma cultura de E 3 92 Lambda LZ um PPL estrela D em meio LBM com densidade celular de OD 600 em torno de 0,6 e induza a lise em banho-maria com agitação a 42 graus Celsius.

Continue a incubar a 37 graus Celsius até que a lise seja evidente. O cultivo torna-se transparente. Adicione agora clorofórmio a 2% e, em seguida, incube por 15 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, transfira o lisado de fagos para frascos de 250 mililitros e centrifugue a cultura. Então, recupere o sobrenadante contendo as partículas de fago e realize uma segunda centrifugação para remover detritos visíveis, seguindo protocolos padrão de titulação de fagos. Meça a concentração de fago, purifique o fago por meio de um gradiente de cloreto de césio e analise a atividade com DPI para o preparo de placas aro.

Limpe seis lâminas de microscópio com etanol 70%. Organize cinco lâminas conforme mostrado e fixe com fita. Em seguida, despeje uma solução de aros 1,5% em meio sobre as lâminas fixadas.

Posicione a última lâmina por cima, tomando cuidado para evitar bolhas de ar. Coloque um peso em cima e deixe o AROS esfriar por cerca de 30 minutos. Remova as quatro lâminas laterais e embale o bloco de lâminas com filme plástico aderente.

Usando uma cultura de bactérias transformadas de crescimento noturno como inóculo, cultive uma cultura em LBMM, pélote um mililitro de bactérias e ressuspenda. Suspenda as células em 20 microlitros de LBMM frio em gelo utilizando uma ponta de pipeta larga.

Adicione 20 microlitros de fago purificado. Misture suavemente e incube primeiro no gelo por 30 minutos para permitir a absorção do fago. Em seguida, em banho-maria a 35 graus Celsius por cinco minutos.

Para induzir a injeção do DNA do fago, separe os agregados celulares misturando. Dilua a mistura de um para dez em LBMM. Agora, coloque uma placa de ágar LBM.

Em um lamínula, adicione um microlitro da mistura de fagos e células. Após absorção, posicione suavemente outro lamínula por cima. Comece adquirindo um conjunto de imagens pelo canal YFP para o período inicial.

Adquira uma série de 15 imagens em intervalos de 200 nanômetros ao longo do eixo Z. Além disso, obtenha uma única imagem em foco pelos canais de contraste de fase e mCherry. Em seguida, adquira um filme em lapso de tempo do destino celular pós-infecção.

Para minimizar o desbotamento e a fototoxicidade durante o filme com intervalos de tempo, utilize uma única imagem em posição Z por canal em cada ponto temporal, adquirindo a amostra nos canais de contraste de fase, YFP e M cherry, com intervalos de 10 minutos durante aproximadamente quatro horas. Inicie a análise das imagens com uma contagem manual de fagos e também registre a localização dos fagos e o comprimento celular. No período inicial, registre os destinos celulares como lítico, lisogênico ou não infectado.

Também registre o tempo de lise e quaisquer outras informações desejadas reproduzindo o filme em lapso de tempo e extraia informações mais quantitativas, como o nível de fluorescência ao longo do tempo em células individuais, utilizando algoritmos automatizados de reconhecimento celular e rastreamento de linhagem. Normalmente, as placas dos fagos marcados com fluorescência são significativamente menores do que as do tipo selvagem, e os sinais de YFP e DAPI de um fago purificado com sucesso apresentam colocalização. Esses dados combinam conjuntos de imagens dos canais de contraste de fase, YFP e M cherry, e as imagens sobrepostas correspondentes de um filme em lapso de tempo.

Os fagos individuais são claramente visíveis no intervalo de tempo inicial. Aqui, observam-se duas células, cada uma infectada por um único fago, e uma célula infectada por três fagos. Tipicamente, observa-se um número de fagos na superfície celular, enquanto outros fagos permanecem não absorvidos.

Com o tempo, o resultado da infecção torna-se distinguível. Oitenta minutos depois, as duas células infectadas por fagos individuais entraram cada uma na via lítica. Com a produção intracelular de novos fagos, a célula infectada por três fagos entrou na via lisogênica, marcada pela produção de mCherry a partir do pré-motor.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar um estoque purificado de fago para infectar bactérias E. coli com o fago lambda e realizar imagens do estilo de vida em tempo real sob o microscópio.