Name: Seguindo o destino celular, em E. coli Após a infecção por um fago Lambda (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprenda a preparar fagos lambda fluorescentes e infectar E. coli para observar em tempo real o destino celular lítico ou lisogênico. Este método combina purificação por gradiente de cloreto de césio com microscopia de fluorescência para estudar dinâmicas virais.

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Somos gratos a Michael Feiss e Sippy Jean para a orientação sobre a criação de fagos e purificação. Agradecemos Michael Elowitz para fornecer o software de reconhecimento de célula, Schnitzcell. Trabalho no laboratório de Golding é suportado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (R01GM082837), a National Science Foundation (082,265, PFC: Centro de Física de Células Vivas), a Fundação Welch (Grant Q-1759) e Ciências Humanas da Fronteira Programa (RGY 70/2008).

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<li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFasman%2C+GD+%22Practical+handbook+of+biochemistry+and+molecular+biology%22">Practical handbook of biochemistry and molecular biology</a>. , CRC press. (1989).</li>
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<li>Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinetic+analysis+of+the+bacteriophage+lambda+genetic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network.</a> Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Personal communication with M. Feiss. , Forthcoming.</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Estirpes bacterianas, fagos e plasmídeos: Strain LE392 é supF. Optou-se por suprimir a mutação SAM7 no genoma de fago (ver Tabela 1 para detalhes). Assim, lisogénios induzidas acabará por lise e liberar partículas de fagos, células infectadas como a vontade de que escolheram a via lítica. Células lisogénica são cultivadas a 30 ° C devido à presença do cl 857 sensível à temperatura alelo no genoma do fago. Após a indução de calor, gpD-EYFP e do tipo selvagem gpD são co-expressas a partir do genoma de λ LZ1 eo plasmídeo pPlate * D, respectivamente. Como resultado, a cápside do fago λ recém-criado LZ2 contém uma mistura de gpD-EYFP e proteínas gpd. Este fago mosaico é estruturalmente estável e suficientemente fluorescente para permitir a detecção de fagos individuais 5. pP RE - mCherry é um plasmídeo repórter utilizada para detectar escolha do pathwa lisogénicay. O promotor RE P é ativada pela CII durante o estabelecimento de lisogenia 1,11. pP RE - mCherry 5 foi derivado de pE-gfp 11 substituindo gfp com mCherry 12. Para mais detalhes veja o nosso trabalho anterior 5. Condição Parâmetros de crescimento: Durante a indução lisogénio (Seção 1), tremor leve a 180 rpm dá um rendimento bom vírus 13. O uso de glucose no meio de crescimento deve ser evitada, o metabolismo da glicose gera produtos metabólicos acídicos, e as partículas de lambda maduros são instáveis ​​a pH ácido 13. A adição de MgSO 4 destina-se a estabilizar a cápside do fago 3. Para fagos carregando tipo selvagem cI (em vez de cI 857), o lisogénio pode ser induzida usando o C-DNA prejudicial Mitomicina agente 3. No passo 1.3, a incubação a 37 ° C não deve exceder normalmente 90 minutos. É usef<html> ul para verificar a densidade celular por OD 600 a cada 30 min. Para uma boa lisado, OD 600 cai para cerca de 0,2 ou menos, e o restante OD 600 é um resultado de detritos de células. Incubação demasiado longo pode resultar num menor rendimento de fago uma vez que o fago pode começar a recentemente criada para injectar o DNA em fragmentos de células. Para se obter uma banda de fago visível (de pelo menos 1 x 10 11 partículas fágicas) nos passos 2.11 e 2.13, crescem, pelo menos, 500 ml de cultura na etapa 1.2. A adição de maltose a 0,2% para o meio de crescimento nas etapas 5.1 e 5.2 é destinado a induzir a expressão de LamB, o receptor para o fago lambda adsorção 3,14. A diluição de 1000 vezes, em vez de 100 vezes no passo 5.2 é destinado a reduzir o nível de fundo a partir do RE mCherry repórter plasmídeo pP - mCherry. No passo 5.5 para injecção de DNA de fago de disparo, a 35 ° C é escolhido para evitar a indução do alelo sensível à temperatura cI857. Purificação Phage: jove_content &quot;&gt; Os passos de purificação de fagos (Passos 2.1 a 2.11) pode ser substituído por outros protocolos de purificação 5, mas a ultracentrifugação de gradiente de equilíbrio final através de CsCl (Passos 2.12 e 2.13), é inevitável. rotores de caçamba móvel são necessários nos passos 2.10 e 2,12 para garantir afiadas bandas fago visíveis. Obtenção de um estoque fago puro pode facilmente levar até uma semana, por isso é necessário verificar o título de fagos ao longo do caminho para garantir que nada dê errado durante as etapas intermediárias. Manuseio Phage: Durante todos os procedimentos de purificação na Seção 2, é fundamental para lidar com fago lisado com cuidado para evitar corte caudas de fago de cabeças de fagos. Durante a infecção de células na Secção 5 (por exemplo, as etapas de 5,5 através de 5.7), é também crítica para evitar a ruptura das partículas de fago a partir da célula infectada. Note-se que, se o fago é cortado a partir da célula infectada, após injecção de seu DNA, o resultado é uma infecção &quot;escuro&quot;, ou seja, a defection resultado será observado na experiência, mas o fago infectando não. Para minimizar esses problemas, usamos uma ponteira larga sempre que manuseia fagos ou a mistura fago / célula. DAPI Teste: Manchando o estoque fago com DAPI (Seção 4) é um método rápido e eficiente para controlar a pureza do estoque de fagos. Ele também pode ser usado para testar a possível degradação de um estoque de fago existente ao longo do tempo. Para um estoque puro, a co-localização de sinais YFP e DAPI sob o microscópio de fluorescência deveria ser próximo de 100%. Nós normalmente observam que menos de 1% dos locais YFP não contêm DAPI (representando cãpsides sem o genoma viral), o que indica que estas partículas não êxito empacotar o DNA viral ou já tinham injectado o seu DNA em outro lugar. Menos de 1% dos locais DAPI não contêm YFP (correspondente a fagos não fluorescentes). Se este não for o caso, as etapas de 2,12 a 2,14 necessidade de ser repetido no order para purificar novamente. Com relação aos parâmetros de imagem, a configuração do microscópio no Passo 4.3 não é tão crítica como no capítulo 5, porque não a longo prazo imagem ao vivo de células é necessária aqui. No entanto, mantendo os ajustes de microscopia mesmas como no ponto 5 é útil quando se deseja calibrar a intensidade de fluorescência de uma única partícula fágica. Se a placa de PBS-agarose não é muito limpa, ou muito DAPI corante é usado, alguns pontos DAPI correspondentes ao ADN do fago pode ser rodeada por um &quot;halo&quot;. Se for muito pouco corante DAPI é usado, o sinal do canal DAPI pode ser muito fraca. Sistema de microscópio: Para a imagem na seção 6, nós usamos um microscópio de epifluorescência comercial invertido (Eclipse TE2000-E, Nikon) com um objetivo 100x (Plano Fluo, abertura numérica 1,40, imersão em óleo) e padrão de conjuntos de filtros (Nikon). A fonte de luz de fluorescência é uma lâmpada de arco com o controlo da intensidade da luz. Os seguintes recursos são controlados por computador: x, y, z posição; campo brilhante e persianas de fluorescência, e opção de filtro de fluorescência. Um recurso de auto-foco é necessária. Caso contrário, o foco pode facilmente afastar-se durante o filme de lapso de tempo (normalmente 4 horas de duração). A capacidade de adquirir várias posições (x, y) em cada ponto de tempo é útil, uma vez que permite acompanhar a eventos de infecções múltiplas em paralelo. Nós normalmente adquirir 8 posições de palco em cada filme, seguindo até 100 ocorrências de infecção. A câmera que usamos é um resfriado 512x512 CCD com 16x16 pixel câmera mM com uma gama dinâmica de 16 bits (Cascade512, Fotometria). Aquisição é realizada usando software MetaMorph (Molecular Devices). O microscópio deve ser colocado numa sala com temperatura controlada, em alternativa, a platina do microscópio deve ser rodeada por uma câmara de temperatura controlada. Aquisição da Imagem: Para vivo de células de imagem, que é crítico para evitar a exposição desnecessária da amostra, o que poderia levar à descoloração e phototoxicity. Portanto, o melhor é primeiro caracterizar seu sistema para encontrar uma exposição de luz ideal que permite a detecção de fluorescência, enquanto não levando ao crescimento excessivo de células de branqueamento ou de inibição. Para obter uma boa imagem de fluorescência, jogar com a intensidade de luz emocionante, tempo de exposição e ganho de câmera. Nos Passos 6,2-6,3, o intervalo de quadro 10 min é escolhido com o fim de minimizar a exposição à luz. Em cada quadro, apenas uma imagem em foco único é necessário no contraste de fase (de reconhecimento de célula) e os canais de fluorescência (para determinar o destino da célula). No primeiro momento, no entanto, várias imagens z-posição através do canal de YFP são necessárias para capturar todos os fagos que infectam na superfície da célula. O tempo de exposição YFP no quadro inicial também pode precisar de ser maior do que o utilizado para o filme de lapso de tempo nos períodos de tempo posteriores. Análise de Imagem: Muito cuidadosamente contar partículas fágicas em torno da superfície da célula na etapa 7.1. Comomencionado acima, tomamos uma série de z-pilhas através YFP canal no Passo 6.2. No entanto, isso ainda pode deixar algumas partículas de fagos fluorescentes fora de foco, que desafia a contagem. O comprimento das células no espaço de tempo inicial é medida usando o software Metamorph. O comprimento da célula pode também ser medida por ImageJ ou outras ferramentas de software. Além disso, um sistema automatizado de casas construídas programa Matlab pode ser muito útil na obtenção de informações, tais como a mudança de fluorescência ao longo do tempo ao longo de linhagens celulares.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Clorofórmio </td><td> Fisher Scientific </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma </td><td> R4642-10mg </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> Tampão SM </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td> Seringa </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td></tr><tr><td> Agulha </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td></tr><tr><td> Cassete de diálise </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66333 </td></tr><tr><td> Lâmina de microscópio </td><td> Corning </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti tubo ultra-claro </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344060 </td></tr><tr><td> SW60Ti tubo ultra-claro </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 335649 </td></tr><tr><td> Refratômetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-947 </td></tr><tr><td> Microscópio de epifluorescência </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE2000-E </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Reagentes e equipamentos.

seguindo o destino celular, em<em&gt; e. coli</em&gt; após a infecção por um fago lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Compreendendo o sistema bacteriófago (fago) lambda e a bactéria E. coli serviu durante muito tempo como um paradigma para a célula destino, 1,2 determinação. Seguindo a infecção simultânea da célula de um número de fagos, uma de duas vias é escolhido: lítico (virulento) ou lisogênico (latentes) 3,4. Recentemente, desenvolveu um método para etiquetar fluorescentemente fagos individuais, e foram capazes de estudar a decisão de pós-infecção, em tempo real, ao microscópio, a nível de fagos individuais e as células 5. Aqui, descrevemos o procedimento completo para a realização dos experimentos de infecção descritas em nossos trabalhos anteriores 5. Isto inclui a criação de fagos fluorescentes, a infecção das células, sob o microscópio de imagem e análise de dados. O fago fluorescente é um &quot;híbrido&quot;, co-expressando as versões de tipo selvagem e YFP-fusão da proteína da cápside gpD. Um ligado fágico bruto é primeiro obtido por indução de um lisogénio de o (gpD-EYFP EnhYellow Fluorescent Protein ANCED fago), portadora de um plasmídeo que expressa tipo selvagem gpD. Uma série de passos de purificação são então realizadas, seguido por DAPI-rotulagem e de imagem sob o microscópio. Isto é feito a fim de verificar a uniformidade, a eficiência de empacotamento do ADN, o sinal de fluorescência e a estabilidade estrutural do stock de fagos. A adsorção inicial de fagos às bactérias é realizada em gelo, seguido por uma incubação breve, a 35 ° C para provocar a injecção do ADN virai 6. O fago / bactérias mistura é, então, transferido para a superfície de uma laje fina agar nutriente, coberta com uma lamela e visualizados sob um microscópio de epifluorescência. O processo de pós-infecção é seguida durante 4 h, a 10 minutos de intervalo. Posições de múltiplos estágios são monitorados tais que ~ 100 infecções celulares podem ser rastreados em um único experimento. Em cada ponto de posição e de tempo, as imagens são adquiridas no contraste de fase e canais de vermelho e verde fluorescente. A imagem de contraste de fase é usado posteriormente para automatizado celreconhecimento l enquanto os canais fluorescentes são usados ​​para caracterizar o resultado de infecção: produção de novos fagos fluorescentes (verde) seguido de lise das células, ou a expressão de factores de lisogenia (vermelho), seguido de crescimento das células é reiniciada e divisão. Os adquiridos lapso de tempo os filmes são processadas utilizando uma combinação de métodos manuais e automatizados. Dados os resultados da análise para a identificação de parâmetros de infecção para cada evento de infecção (por exemplo, número e posições de infectar fagos), bem como resultado da infecção (lise / lisogenia). Os parâmetros adicionais podem ser extraídas se desejado.

Este artigo descreve o procedimento para a preparação de uma versão marcada com fluorescência do bacteriófago lambda, infecção de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérias, após o resultado da infecção sob o microscópio, e análise dos resultados de infecção.

Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

O sistema composto pelo bacteriófago (fago) lambda e pela bactéria E. coli tem servido há muito tempo como um paradigma para a determinação do destino celular1,2. Após o...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar um microscópio de fluorescência para acompanhar o sulfato em *E. coli* em tempo real após infecção pelo fago lambda. Comece criando um lisado bruto do fago lambda. Em seguida, purifique o fago e infecte *E. coli* com o fago lambda em um tubo.Continue a acompanhar o destino das células bacterianas sob o microscópio. Em última análise, os resultados podem mostrar em tempo real os diferentes destinos celulares em *E. coli* por meio da expressão de diferentes proteínas fluorescentes associadas ao crescimento ou morte celular. Geralmente, um ponto de verificação para este método está na criação de um estoque purificado e rotulado de FI.Para evitar a compartilhamento de figes durante a preparação e purificação, otimize também os parâmetros de imagem no microscópio para permitir o crescimento saudável das células. Inocule uma cultura de E 3 92 Lambda LZ um PPL estrela D em meio LBM com densidade celular de OD 600 em torno de 0,6 e induza a lise em banho-maria com agitação a 42 graus Celsius.Continue a incubar a 37 graus Celsius até que a lise seja evidente. O cultivo torna-se transparente. Adicione agora clorofórmio a 2% e, em seguida, incube por 15 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, transfira o lisado de fagos para frascos de 250 mililitros e centrifugue a cultura. Então, recupere o sobrenadante contendo as partículas de fago e realize uma segunda centrifugação para remover detritos visíveis, seguindo protocolos padrão de titulação de fagos. Meça a concentração de fago, purifique o fago por meio de um gradiente de cloreto de césio e analise a atividade com DPI para o preparo de placas aro.Limpe seis lâminas de microscópio com etanol 70%. Organize cinco lâminas conforme mostrado e fixe com fita. Em seguida, despeje uma solução de aros 1,5% em meio sobre as lâminas fixadas.Posicione a última lâmina por cima, tomando cuidado para evitar bolhas de ar. Coloque um peso em cima e deixe o AROS esfriar por cerca de 30 minutos. Remova as quatro lâminas laterais e embale o bloco de lâminas com filme plástico aderente.Usando uma cultura de bactérias transformadas de crescimento noturno como inóculo, cultive uma cultura em LBMM, pélote um mililitro de bactérias e ressuspenda. Suspenda as células em 20 microlitros de LBMM frio em gelo utilizando uma ponta de pipeta larga.Adicione 20 microlitros de fago purificado. Misture suavemente e incube primeiro no gelo por 30 minutos para permitir a absorção do fago. Em seguida, em banho-maria a 35 graus Celsius por cinco minutos.Para induzir a injeção do DNA do fago, separe os agregados celulares misturando. Dilua a mistura de um para dez em LBMM. Agora, coloque uma placa de ágar LBM.Em um lamínula, adicione um microlitro da mistura de fagos e células. Após absorção, posicione suavemente outro lamínula por cima. Comece adquirindo um conjunto de imagens pelo canal YFP para o período inicial.Adquira uma série de 15 imagens em intervalos de 200 nanômetros ao longo do eixo Z. Além disso, obtenha uma única imagem em foco pelos canais de contraste de fase e mCherry. Em seguida, adquira um filme em lapso de tempo do destino celular pós-infecção.Para minimizar o desbotamento e a fototoxicidade durante o filme com intervalos de tempo, utilize uma única imagem em posição Z por canal em cada ponto temporal, adquirindo a amostra nos canais de contraste de fase, YFP e M cherry, com intervalos de 10 minutos durante aproximadamente quatro horas. Inicie a análise das imagens com uma contagem manual de fagos e também registre a localização dos fagos e o comprimento celular. No período inicial, registre os destinos celulares como lítico, lisogênico ou não infectado.Também registre o tempo de lise e quaisquer outras informações desejadas reproduzindo o filme em lapso de tempo e extraia informações mais quantitativas, como o nível de fluorescência ao longo do tempo em células individuais, utilizando algoritmos automatizados de reconhecimento celular e rastreamento de linhagem. Normalmente, as placas dos fagos marcados com fluorescência são significativamente menores do que as do tipo selvagem, e os sinais de YFP e DAPI de um fago purificado com sucesso apresentam colocalização. Esses dados combinam conjuntos de imagens dos canais de contraste de fase, YFP e M cherry, e as imagens sobrepostas correspondentes de um filme em lapso de tempo.Os fagos individuais são claramente visíveis no intervalo de tempo inicial. Aqui, observam-se duas células, cada uma infectada por um único fago, e uma célula infectada por três fagos. Tipicamente, observa-se um número de fagos na superfície celular, enquanto outros fagos permanecem não absorvidos.Com o tempo, o resultado da infecção torna-se distinguível. Oitenta minutos depois, as duas células infectadas por fagos individuais entraram cada uma na via lítica. Com a produção intracelular de novos fagos, a célula infectada por três fagos entrou na via lisogênica, marcada pela produção de mCherry a partir do pré-motor.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar um estoque purificado de fago para infectar bactérias E. coli com o fago lambda e realizar imagens do estilo de vida em tempo real sob o microscópio.

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