Name: Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprenda a extrair e quantificar lipídeos bioativos celulares com diluição de isótopos estáveis e cromatografia líquida-espectrometria de massa. Este método avançado permite analisar vias enzimáticas metabólicas com alta precisão.

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A maioria dos métodos bioanalíticos atuais disponíveis para a medição de lipídios bioativos não são tão extensos, pois não incluem cromatografia quiral de fase normal ou SID. A LC quiral de fase normal é crítica para a separação de enantiômeros e para ser capaz de distinguir entre metabolismo mediado por enzima ou ROS. O uso do SID garante que o erro humano ou as complicações que surgem durante a extração ou análise sejam levados em consideração durante a quantificação. Esses componentes adicionados, juntamente com o ECAPCI-MRM, tornam este o método mais sensível e seletivo disponível para a análise de lipídios bioativos.

1. Misturas Padrão e Padrão Interno
<ol>
	<li>Antes da extração de lipídios, deve-se preparar uma mistura padrão (SM) e uma mistura padrão interna (ISM). Para o SM, alíquota do volume equivalente de 1 μg de cada padrão (25 no total) listado no quadro de reagentes abaixo, utilizando uma seringa calibrada, para um balão volumétrico de 10 ml. Secar os padrões em azoto e reconstituir em 10 ml de acetonitrilo (ACN). A concentração final da mistura padrão será de 100 pg/μL. Divida em alíquotas de 1 mL e armazene a -80°C até que seja necessário.</li>
	<li>A partir desta mistura padrão, 6 diluições padrão podem ser feitas para um total de 7 padrões de calibração (1 pg/μL, 2 pg/μL, 5 pg/μL, 10 pg/μL, 20 pg/μL, 50 pg/μL e 100 pg/μL). Esses padrões devem ser executados com cada lote de amostras preparado para desenvolver a curva de calibração usada na análise quantitativa.</li>
	<li>Para o ISM, alíquota do volume equivalente de 1 μg de cada IS (14 no total) listado no quadro de reagentes abaixo para um balão volumétrico de 10 ml, utilizando uma seringa calibrada, e secar sob azoto. Reconstituir o MIS em 10 mL de NCA e dividir em alíquotas de 1 mL. A concentração final do ISM deve ser de 100 pg/μL. Há ISM suficiente para processar 1000 amostras.</li>
	<li>Armazene o SM e o ISM a -80°C.</li>
</ol>
2. Coleta de meios e lisado celular
<ol>
	<li>Para cada placa de 10 cm de células aderentes (~ 1 X 107), colete 3 mL de meio em um tubo centrífugo de vidro de 10 mL. Em seguida, lave as células 2 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Adicione 1 mL de PBS à placa e raspe as células da placa e pipete em um segundo tubo de centrífuga de vidro de 10 mL. Neste ponto, células e mídia podem ser armazenadas se o procedimento não for continuado neste momento. Armazene as amostras a -80 ° C para armazenamento de longo prazo ou a -20 ° C por menos de uma semana.</li>
</ol>
3. Extração de lipídios do meio
<ol>
	<li>Os lipídios bioativos livres são encontrados no meio celular e são facilmente extraídos com um procedimento de extração l-l de uma etapa. Ao meio coletado (2.1), adicione 10 μL de ISM. Neste momento, 8 tubos de centrífuga de vidro adicionais de 10 mL devem ser rotulados como #0-7 para os padrões de calibração. Adicione 3 mL de PBS a cada um desses tubos e, em seguida, adicione 10 μL do SM apropriado aos tubos 1-7 (1-7 de 1.1).</li>
	<li>Deixar o ISM equilibrar-se em cada padrão de calibração e amostrar durante 10 minutos e, em seguida, adicionar 5 ml de éter dietílico. As amostras e os padrões de calibração são então colocados no agitador em baixa velocidade por 30 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Após agitação, todos os padrões de calibração e amostras são centrifugados a 1935 x g por 10 minutos. Em seguida, usando uma pipeta Pasteur, transferir a fase superior (orgânica) para um novo tubo de centrífuga de vidro de 10 mL e secar sob nitrogênio.</li>
</ol>
4. Extração de lipídios do lisado celular
<ol>
	<li>Gire as amostras de células nos tubos de centrífuga de vidro a 1935 X g por 5 minutos. Descarte o sobrenadante; adicione 2 mL de PBS a cada tubo e vortex brevemente. Remova 25 μL de amostra para quantificação de proteínas. A proteína total será utilizada para normalização do lisado celular.</li>
	<li>Em seguida, transfira metade da mistura de lisado / PBS para um tubo de centrífuga de vidro separado de 10 mL. Adicione mais 2 mL de PBS junto com 10 μL de ISM a cada amostra. Seguir o processo de extracção l-l descrito para os meios em 3.2 e 3.3. Esta alíquota será usada para medir lipídios livres nas células e evitar a degradação alcalina de lipídios, como as prostaglandinas. Esta alíquota não passará pelas etapas 4.3 e 4.4 descritas abaixo.</li>
	<li>A primeira etapa do processo de extração lipídica esterificada l-l requer a adição de 5 mL de CHCl3/MeOH (2:1) a cada uma das amostras. As amostras são colocadas em um agitador em velocidade baixa por 30 minutos. Após agitação, as amostras são centrifugadas a 1935 x g por 10 minutos. Em seguida, usando uma pipeta de Pasteur, transfira a camada inferior (orgânica) da extração l-l para um novo tubo de centrífuga de vidro de 10 mL e seque a amostra sob nitrogênio.</li>
	<li>Os lipídios esterificados devem ser saponificados antes da quantificação. Quando as amostras estiverem secas, adicione 0,5 mL de KOH 0,4N em 80% MeOH a cada tubo. As amostras são então incubadas a 60°C por 1 h. Após a incubação, adicione 2 mL de PBS. Ajuste o pH para 6 com ácido HCl concentrado (~ 30 μL). Adicione 10 μL de ISM a cada amostra. O resto do procedimento é o mesmo que a extração de lipídios do meio e pode ser seguido em 3.2 e 3.3.</li>
	<li>Se estas extracções forem efectuadas simultaneamente com as amostras de meios, podem ser utilizados os mesmos padrões de calibração para desenvolver uma curva de calibração; no entanto, se estas amostras forem executadas noutro momento, os padrões de calibração devem também ser processados como descrito nos pontos 3.1-3.3.</li>
</ol>
5. Derivatização de pentafluorilbenzilbrometo (PFB)
<ol>
	<li>Às amostras secas e aos padrões de calibração, adicionar 100 μL de diclorometano anidro (CH2Cl2) seguido de 100 μL de 20% (v/v) de N,N-diisopropiletilamina em CH2Cl2 anidro e, finalmente, 100 μL de PFB a 20% (v/v) em CH2Cl2 anidro. </li>
	<li>Após a adição de reagentes de derivatização, as amostras são submetidas a vórtices, incubadas a 60°C por 1 h e secas sob nitrogênio. As amostras e os padrões de calibração podem ser armazenados a -80 ° C se não forem analisados imediatamente ou a -20 ° C por até uma semana.</li>
</ol>
6. Análise de Espectrometria de Massa de Ionização Química de Ionização de Pressão Atmosférica de Diluição de Isótopos Estáveis (SID-LC-ECAPCI-MS)
<ol>
	<li>As amostras secas e os padrões de calibração são reconstituídos em 100 μL de hexano/etanol (97:3). A amostra inteira pode então ser transferida para o frasco de HPLC com inserção. Coloque as amostras no amostrador automático refrigerado (4 °C) e crie uma lista de amostras para análise.</li>
	<li>Em seguida, configure os métodos HPLC e MS usando os parâmetros descritos na Tabela 1 e na Tabela 2 abaixo. A Tabela 3 contém informações específicas sobre compostos, incluindo a transição MRM e a energia de colisão (CE) para cada lipídio, bem como o tempo de retenção estimado da análise Waters 2695 / Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra. O CE é determinado ajustando cada lipídio individual durante o desenvolvimento do método.</li>
	<li>Uma coluna Chiralpak AD-H (4,6 X 250 mm, 5 μ) aquecida a 30°C é usada para a separação de fase normal. A fase móvel inicial é 98% hexano e 2% metanol/isopropanol (1:1). Após a separação por HPLC, o metanol é adicionado após a coluna (0,75 mL / min) para evitar a deposição na agulha Corona que causaria uma diminuição na sensibilidade. O MS é definido no modo de íons negativos usando a fonte APCI. Se a fonte precisar ser alterada de ESI para APCI, certifique-se de inserir uma agulha Corona.</li>
	<li>A primeira amostra que deve ser executada é sempre um branco hexano. Isso equilibrará a coluna e também revelará se há alguma contaminação na coluna que possa interferir no padrão de calibração e na análise da amostra.</li>
	<li>As próximas amostras executadas devem ser as amostras padrão de calibração na ordem de 0-7 (aumentando a concentração de SM). Esses padrões serão usados para criar uma curva de calibração contendo a razão entre a área padrão / área IS no eixo y e a concentração ou massa padrão no eixo x. A partir da equação y = mx + b derivada deste gráfico, a razão entre a área amostral / área IS (y) pode ser usada para determinar a quantidade ou concentração (x) da amostra (desconhecida).</li>
	<li>A quantidade de lipídios bioativos encontrados no meio pode ser normalizada para o volume total do meio e a quantidade de lipídios encontrados no lisado celular pode ser normalizada para o número total de células/placa ou a quantidade de proteína total/placa. Devem ser tomadas medidas durante o ponto 4.1 do protocolo para garantir que as células são contadas ou que a proteína é quantificada.</li>
</ol>
7. Resultados Representativos:
Os cromatogramas na Figura 1 são representativos de um perfil lipidômico direcionado. O primeiro painel (Figura 1A) mostra 13- e 9-HODE juntamente com os correspondentes 13- e 9-oxoODE, derivados do ácido linoléico. Além disso, 15-oxoETE, o metabólito oxidado de 15-HETE também é mostrado no segundo painel. Os dois painéis inferiores mostram 20-HETE e 20-HETE-IS, [2H6]-20-HETE. A Figura 1B mostra a separação e as transições únicas determinadas para os estereoisômeros HETE que resultam da oxidação enzimática de AA ou por ROS. A Figura 1C é uma representação de PGs, isoPs e LTB4. Alguns dos padrões não têm um IS deuterado disponível comercialmente; portanto, um IS semelhante em tempo de retenção é usado para quantificação. Por exemplo, [2H8]-12(S)-HETE é usado para quantificar as espécies 11-HETE e 8-HETE, além de 12(R)-HETE e 12(S)-HETE.
A partir dos cromatogramas representativos, é evidente que há uma pequena mudança na retenção do IS deuterado em comparação com o padrão não marcado. Essa mudança para um tempo de retenção posterior é resultado da interação do deutério com a coluna de fase normal. O deutério é mais polar que o hidrogênio; portanto, há uma interação mais forte com a fase normal da coluna. Se essa separação estivesse ocorrendo usando uma coluna de fase invertida, a mudança seria para um tempo de retenção anterior, pois uma porção mais polar teria uma interação mais fraca com a fase reversa.
<img src="/files/ftp_upload/3399/3399fig1.jpg" alt="Figura 1"> 
Figura 1. Esta figura é um exemplo representativo de uma análise lipidômica direcionada. A Figura 1A mostra os cromatogramas de íons totais (TIC) para vários metabólitos oxidados LA e AA, incluindo 13-oxoODE e 9-oxoODE no primeiro painel, 15-oxoETE no segundo painel, 13-HODE e 9-HODE (painéis 3 e 5) e 20-HETE (painel 7). Os HODEs e 20-HETE têm um IS deuterado correspondente no painel abaixo (4, 6 e 8). Os TICs na Figura 2B mostram a separação e as transições únicas dos estereoisômeros HETE derivados de AA. A Figura 2C é uma representação de PGs, isoPs e LTs. A energia de colisão (CE), as transições MRM e o tempo de retenção (RT, min) foram otimizados usando um Waters 2695 LC acoplado a um Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra e estão listados na Tabela 3 para cada composto.
<borda da tabela="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tempo (min)</td>
			<td>% A</td>
			<td>% B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>98</td>
			<td>algarismo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>98</td>
			<td>algarismo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>Seção 96.4</td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>39</td>
			<td>98</td>
			<td>algarismo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45</td>
			<td>98</td>
			<td>algarismo</td>
		</tr>
	</tbody>

Tabela 1. Condições de gradiente de HPLC para a separação lipidômica da fase normal quiral. O solvente A é 100% hexanos e o solvente B é metanol/isopropanol (1:1).
<borda da tabela="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parâmetro de espectrometria de massa</td>
			<td>ambiente</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fonte</td>
			<td>APCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modo</td>
			<td>Íon negativo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comprimento do método</td>
			<td>40 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Largura de varredura MRM</td>
			<td>0,002 m/z</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempo de varredura MRM</td>
			<td>0,15 seg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Largura do pico MRM</td>
			<td>0,70 FWHM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lente de tubo</td>
			<td>164 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CID de origem</td>
			<td>10 eV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q2 Gás de colisão</td>
			<td>1,5 unidades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura do vaporizador</td>
			<td>450°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura capilar</td>
			<td>250°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corrente de descarga</td>
			<td>0 μA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressão do gás da bainha</td>
			<td>25 unidades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressão de varredura de íons</td>
			<td>3 unidades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressão de gás auxiliar</td>
			<td>5 unidades</td>
		</tr>
	</tbody>

Tabela 2. Listados acima estão os parâmetros de espectrometria de massa otimizados para a medição de lipídios bioativos. Esses parâmetros são retirados de um Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.
<borda da tabela="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>composto</td>
			<td>transição</td>
			<td>CE (eV)</td>
			<td>RT (min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13-oxoODE</td>
			<td>293,03 → 113,10</td>
			<td>21</td>
			<td>9.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-oxoODE</td>
			<td>293,03 → 113,10</td>
			<td>21</td>
			<td>17.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-oxoETE</td>
			<td>317,05 → 113,18</td>
			<td>18</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 (R) - HODE</td>
			<td>295,03 → 195,12</td>
			<td>18</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 (S) -HODE</td>
			<td>295,03 → 195,12</td>
			<td>18</td>
			<td>14.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-13(S)-HODE</td>
			<td>299,03 → 198,12</td>
			<td>18</td>
			<td>14.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 (R) -HODE</td>
			<td>295,03 → 171,10</td>
			<td>18</td>
			<td>13.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 (S) -HODE</td>
			<td>295,03 → 171,10</td>
			<td>18</td>
			<td>21.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-9(S)-HODE</td>
			<td>299,03 → 172,12</td>
			<td>18</td>
			<td>21.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-HETE</td>
			<td>319,03 → 289,10</td>
			<td>18</td>
			<td>12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H6]-20-HETE</td>
			<td>325,03 → 295,10</td>
			<td>18</td>
			<td>12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 115.04</td>
			<td>16</td>
			<td>15.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(S)-HETE</td>
			<td>319.04 → 115.04</td>
			<td>16</td>
			<td>16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-5(S)-HETE</td>
			<td>327.04 → 116.04</td>
			<td>16</td>
			<td>16.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 179,11</td>
			<td>14</td>
			<td>11.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 179,11</td>
			<td>14</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-12(S)-HETE</td>
			<td>327,13 → 184,11</td>
			<td>14</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 (R) -HETE</td>
			<td>319,04 → 219,12</td>
			<td>13</td>
			<td>12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 219,12</td>
			<td>13</td>
			<td>15.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-15(S)-HETE</td>
			<td>327,03 → 226,12</td>
			<td>13</td>
			<td>16.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 167,11</td>
			<td>16</td>
			<td>11.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 167,11</td>
			<td>16</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 155.09</td>
			<td>16</td>
			<td>11.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8(S)-HETE</td>
			<td>319.04 → 155.09</td>
			<td>16</td>
			<td>12.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTB4</td>
			<td>335,03 → 195,10</td>
			<td>18</td>
			<td>32.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-LTB4</td>
			<td>339,03 → 197,10</td>
			<td>18</td>
			<td>32.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PÁG.2</td>
			<td>351,03 → 271,15</td>
			<td>18</td>
			<td>31.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGE2</td>
			<td>355.03 → 275.15</td>
			<td>18</td>
			<td>31.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGD2</td>
			<td>351,03 → 271,15</td>
			<td>25</td>
			<td>32,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGD2</td>
			<td>355.03 → 275.15</td>
			<td>25</td>
			<td>32,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-ISO-PGE2</td>
			<td>351,03 → 271,15</td>
			<td>18</td>
			<td>37.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11β-PGF2</td>
			<td>353,03 → 193,11</td>
			<td>25</td>
			<td>27.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-11β-PGF2</td>
			<td>357,03 → 197,11</td>
			<td>25</td>
			<td>27.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF2α</td>
			<td>353,03 → 193,11</td>
			<td>25</td>
			<td>33.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGF2α</td>
			<td>357,03 → 197,11</td>
			<td>25</td>
			<td>33.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-iso-PGF2α</td>
			<td>353,03 → 193,11</td>
			<td>25</td>
			<td>34.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-8-iso-PGF 2α</td>
			<td>357,03 → 197,11</td>
			<td>25</td>
			<td>34.4</td>
		</tr>
	</tbody>

Tabela 3. Esta tabela lista os compostos detectados nos cromatogramas de íons totais da Figura 1A-C. A segunda coluna fornece a transição usada para MRM/MS, a terceira coluna lista a energia de colisão (CE, eV) e a última coluna lista o tempo de retenção (RT, min). Os parâmetros foram otimizados usando um módulo de separação Waters 2695 acoplado a um Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.</borda></borda></borda>

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<li>Ciccimaro, E., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+dilution+LC-MS+for+quantitative+biomarker+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis.</a> Bioanalysis. 2, 311-341 (2010).</li>
<li>Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-capture+negative-ion+chemical+ionization+mass-spectrometry+of+lipid+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Electron-capture negative-ion chemical ionization mass-spectrometry of lipid mediators.</a> Methods in Enzymology. 187, 13-23 (1990).</li>
<li>Singh, G., Gutierrez, A., Xu, K., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography%2Felectron+capture+atmospheric+pressure+chemical+ionization%2Fmass+spectrometry%3A+analysis+of+pentafluorobenzyl+derivatives+of+biomolecules+and+drugs+in+the+attomole+range%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography/electron capture atmospheric pressure chemical ionization/mass spectrometry: analysis of pentafluorobenzyl derivatives of biomolecules and drugs in the attomole range.</a> Analytical Chemistry. 72, 3007-3013 (2000).</li>
<li>Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlair%2C+IA+%22Encyclopedia+of+Mass+Spectrometry%22">Encyclopedia of Mass Spectrometry</a>. Capriol, R. M., Gross, M. L. , Elsevier. 283-307 (2005).</li>
<li>Lee, S. H., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chiral+lipidomics+analysis+by+liquid+chromatography+electron+capture+atmospheric+pressure+chemical+ionization+mass+spectrometry+%28LC-ECAPCI%2FMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeted chiral lipidomics analysis by liquid chromatography electron capture atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (LC-ECAPCI/MS).</a> Methods in Enzymology. 433, 159-174 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os padrões e padrões internos usados neste protocolo fornecem uma representação de um método lipidômico direcionado. Um módulo de separação Waters 2695 e Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra foram usados para a análise LC-MS e as configurações ideais de parâmetros podem ser encontradas nas Tabelas 1 e 2. Além disso, este protocolo de extração foi projetado para células aderentes, mas pode ser modificado para outros tipos de células, bem como outras matrizes biológicas, incluindo urina, sangue...

<table><tbody><tr><td>5-oxo-6E,8Z, 11Z, 14Z-eicosatetraenóico-6,8,9,11,12,14,15-d7 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>334250</td> <td>[2H7] -5-ox &# 8211; TE Padrão Interno</td></tr><tr><td>5S-hidroxi-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eicosatetraenóico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>334230</td> <td>[2H8] -5 (S) -HETE Padrão Interno</td></tr><tr><td>12S-hidroxi-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenóico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>334570</td> <td>[2H8] -12 (S) -HETE Padrão interno</td></tr><tr><td>15S-hidroxi-5Z, 8Z, 11Z, 13E-eicosatetraenóico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>334720</td> <td>[2H8] -15 (S) -HETE Padrão interno</td></tr><tr><td>20-hidroxi-5Z, 8Z, 11Z, 14Z-eicosatetraenóico-16,16,17,17,18,18-d6 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>390030</td> <td>[2H6] -20-HETE Padrão interno</td></tr><tr><td>9S-hidroxi-10E, 12Z-octadecadienoico-9,10,12,13-d4 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>338410</td> <td>[2H 4] -9 (S ) -HODE Padrão interno</td></tr><tr><td>13S-hidroxi-9Z, 11E-octadecadienoico-9,10,12,13-d4 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>338610</td> <td>[2H 4] -13 (S) -HODE Padrão interno</td></tr><tr><td>9 &alfa;, 11 &alfa; 15S-trihidroxi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>316010</td> <td>[2H4] -PGF 2 e alfa; Padrão Interno</td></tr><tr><td>9&alfa;,11&alfa;,15S-tri-hidroxi-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>316350</td><td>[2H4]-8-iso-PGF2a Padrão Interno</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&#946;.,15S-trihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>10008989</td><td>[2H4]-11&#946;-PGF2 Padrão Interno</td></tr><tr><td>9&alfa;,15S-dihidroxi-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>312010</td> <td>[2H4] -PGD 2 Padrão interno</td></tr><tr><td>9-oxo-11 &alfa;, 15S-dihidroxi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>314010</td> <td>[2H4] -PGE2 Padrão Interno</td></tr><tr><td>5S,12R-dihidroxi-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenóico-6,7,14,15-d4 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>320110</td><td>[2H4]-LTB4 Padrão Interno</td></tr><tr><td>9&alpha;,11,15S-trihidroxi-trombomba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>319030</td><td>[2H4]-TxB2 Padrão Interno</td></tr><tr><td>5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-ácido eicosatetraenóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34250</td><td>5-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-ácido eicosatetraenóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34580</td><td>12-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>15-oxo-5Z, 8Z,11Z,13E-ácido eicosatetraenóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34730</td><td>15-ox&#8211;TE Padrão</td></tr><tr><td>5R-hidroxi-6E,8Z,11Z,14Z-ácido eicosatetraenóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34225</td><td>5(R)-HETE Padrão</td></tr><tr><td>5S-hidroxi-6E,8Z,11Z,14Z-ácido eicosatetraenóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34230</td><td>5(S)-HETE Padrão</td></tr><tr><td>8R-hidroxi-5Z,9E,11Z, ácido 14Z-eicosatetraenóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34350</td><td>8 (R) -HETE Padrão</td></tr><tr><td>8S-hidroxi-5Z, 9E, 11Z, 14Z-ácido eicosatetraenóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34360</td><td>8 (S) -HETE Padrão</td></tr><tr><td>11R-hidroxi-5Z, 8Z, 12E, 14Z-ácido eicosatetraenóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34505</td><td>11 (R) -HETE Padrão</td></tr><tr><td>11S-hidroxi-5Z, 8Z, 12E, ácido 14Z-eicosatetraenóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34510</td><td>11 (S) -HETE Padrão</td></tr><tr><td>12R-hidroxi-5Z, 8Z, 10E, 14Z-ácido eicosatetraenóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34560</td><td>12 (R) -HETE Padrão</td></tr><tr><td>12S-hidroxi-5Z, 8Z, 10E, 14Z-ácido eicosatetraenóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34570</td><td>12 (S) -HETE Padrão</td></tr><tr><td>15R-hidroxi-5Z, 8Z, 11Z, 13E-ácido eicosatetraenóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34710</td><td>15 (R) -HETE Padrão</td></tr><tr><td>15S-hidroxi-5Z, 8Z, 11Z, 13E-ácido eicosatetraenóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34720</td><td>15 (S) -HETE Padrão</td></tr><tr><td>20-hidroxi-5Z, 8Z, 11Z, 14Z-ácido eicosatetraenóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>90030</td><td>20-HETE Padrão</td></tr><tr><td>9R-hidroxi-10E, 12Z-ácido</td> <td>octadecadienóicoCayman Chemical</td><td>38405</td><td>9 (R) -HODE Padrão</td></tr><tr><td>9S-hidroxi-10E, 12Z-ácido octadecadienóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>38410</td><td>9 (S) -HODE Padrão</td></tr><tr><td>13R-hidroxi-9Z, 11E-ácido octadecadienóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>38605</td><td>13 (R) -HODE Padrão</td></tr><tr><td>13S-hidroxi-9Z, 11E-ácido octadecadienóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>38610</td><td>13 (S) -HODE Padrão</td></tr><tr><td>9 &alfa;, 11 &alfa;, 15S-tri-hidroxi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oico ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>16010</td><td>PGF 2 &alpha; Padrão</td></tr><tr><td>9&alfa;,11&alfa;,15S-trihidroxi-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>16350</td><td>8-iso-PGF2&alpha; Padrão</td></tr><tr><td>9&alfa;,11&#946;,15S-trihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oico ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>16520</td><td>11&#946;-PGF2 Padrão</td></tr><tr><td>9&alfa;,15S-dihidroxi-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-ácido oico</td><td>Cayman Chemical</td><td>12010</td><td>PGD2 Padrão</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alfa;,15S-dihidroxi-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>14350</td><td>8-iso-PGE2 Padrão</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alpha;,15S-dihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>14010</td><td>PGE2 Standard</td></tr><tr><td>5S,12R-dihidroxi-6Z,8E,10E,14Z-ácido eicosatetraenóico</td><td>Cayman Chemical</td><td>20110</td><td>LTB4 Standard</td></tr><tr><td>9&alfa;,11,15S-trihidroxitromba-5Z,13E-dien-1-oico ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>19030</td><td>TxB2 Fosfato Padrão</td></tr><tr><td>Tampolado Salino</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Acros Organics</td><td>61030-1000</td><td>anidro</td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387649</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de pentafluorilbenzila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101052</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Fluka</td><td>00650</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Clorofórmio Científico</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Fisher Scientific</td><td>H303-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Água</td><td>Fisher Scientific</td><td>W7-4</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga de Vidro de 10 mL</td><td>Kimble Chase</td><td>73785-10</td><td>Tampa de rosca</td></tr><tr><td>Tampas de Fenólico Kimble</td><td>Chase</td><td>73802-13415</td><td></td></tr><tr><td>Coluna Chiralcel ADH Chiral</td><td>Technologies</td><td>19325</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de HPLC</td><td>Waters</td><td>60000751CV</td><td></td></tr><tr><td>Insertos de HPLC</td><td>Waters</td><td>WAT094171</td><td></td></tr></tbody></table>

extração de lipídeos celulares para targeted diluição de isótopos estáveis ​​líquido análise espectrometria de massa-cromatografia

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

O metabolismo de ácidos graxos, como ácido araquidônico (AA) e ácido linoléico (LA), resulta na formação de lipídios bioativos oxidados, incluindo numerosos estereoisômeros1,2. Esses metabólitos podem ser formados a partir de ácidos graxos livres ou esterificados. Muitos desses metabólitos oxidados têm atividade biológica e têm sido implicados em várias doenças, incluindo doenças cardiovasculares e neurodegenerativas, asma e câncer3-7. Os lipídios bioativos oxidados podem ser formados enzimaticamente ou por espécies reativas de oxigênio (ROS). As enzimas que metabolizam ácidos graxos incluem ciclooxigenase (COX), lipoxigenase (LO) e citocromos P450 (CYPs)1,8. O metabolismo enzimático resulta na formação enantiosseletiva, enquanto a oxidação das ROS resulta na formação racêmica dos produtos.
Embora este protocolo se concentre principalmente na análise de metabólitos bioativos derivados de AA e alguns LA, ele pode ser facilmente aplicado a metabólitos de outros ácidos graxos. Os lipídios bioativos são extraídos do lisado celular ou do meio usando extração líquido-líquido (l-l). No início do processo de extração l-l, padrões internos de isótopos estáveis são adicionados para contabilizar erros durante a preparação da amostra. A diluição de isótopos estáveis (SID) também é responsável por quaisquer diferenças, como supressão de íons, que os metabólitos podem experimentar durante a análise de espectrometria de massa (MS)9. Após a extração, a derivatização com um reagente de captura de elétrons (EC), brometo de pentafluorilbenzila (PFB), é empregada para aumentar a sensibilidade de detecção10,11. O monitoramento de reações múltiplas (MRM) é usado para aumentar a seletividade da análise de MS. Antes da análise de MS, os lipídios são separados usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) quiral de fase normal. As condições de HPLC são otimizadas para separar os enantiômeros e vários estereoisômeros dos lipídios monitorados12. Este método específico de LC-MS monitora prostaglandinas (PGs), isoprostanos (isoPs), ácidos hidroxieicosatetraenóicos (HETEs), ácidos hidroxioctadecadienóicos (HODEs), ácidos oxoeicosatetraenóicos (oxoETEs) e ácidos oxooctadecadianóicos (oxoEDEs); no entanto, os parâmetros de HPLC e MS podem ser otimizados para incluir quaisquer metabólitos de ácidos graxos13.
A maioria dos métodos bioanalíticos atualmente disponíveis não leva em consideração a quantificação separada de enantiômeros. Isso é extremamente importante ao tentar deduzir se os metabólitos foram ou não formados enzimaticamente ou por ROS. Além disso, as proporções dos enantiômeros podem fornecer evidências de uma via enzimática específica de formação. O uso do SID permite a quantificação precisa dos metabólitos e é responsável por qualquer perda de amostra durante a preparação, bem como as diferenças experimentadas durante a ionização. O uso do reagente de captura de elétrons PFB aumenta a sensibilidade de detecção em duas ordens de magnitude em relação aos métodos convencionais de APCI. No geral, este método, SID-LC-EC-ionização química à pressão atmosférica APCI-MRM / MS, é um dos métodos mais sensíveis, seletivos e precisos de quantificação de lipídios bioativos.

Este protocolo demonstrará a extração e análise de ácidos graxos bioativos livres e esterificados das células. Os ácidos graxos são quantificados com precisão usando diluição de isótopos estáveis, cromatografia líquida quiral, espectrometria de massa de monitoramento de reações múltiplas de ionização química atmosférica de captura de elétrons (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis ​​Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

O método visa quantificar com precisão os metabólitos lipídicos bioativos celulares pela combinação de diluição de isótopos estáveis, fase cnor, cromatografia líquida, captura de elétrons, pressão atmosférica, ionização química e espectrometria de massa. Comece colhendo amostras de mídia e células e adicione uma mistura de padrão interno rotulada com isótopo pesado. Extraia os lipídios bioativos com solvente orgânico e, em seguida, derive os lipídios bioativos com um reagente de captura de elétrons e prossiga para quantificar com precisão os lipídios bioativos por cromatografia líquida.A espectrometria de massa por meio da análise LCMS dos resultados do lisado celular e do meio determina com precisão a concentração de lipídios bioativos direcionados e os níveis de Anant ERs individuais. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como cromatografia líquida de fase reversa, espectrometria de massa e outros métodos LCMS, é que o indivíduo e os antenos são quantificados com precisão por meio do uso de cromatografia de fase normal de carro e diluição de isótopos estabilizados. Os dados resultantes podem fornecer informações valiosas sobre as vias enzimáticas que funcionam na célula.Para cada placa de 10 centímetros de um aderente, as células coletam três mililitros de meio em um tubo de centrífuga de vidro de 10 mililitros. Em seguida, lave as células duas vezes com PBS. Em seguida, adicione um mililitro de PBS, raspe as células da placa e transfira a amostra para um segundo tubo de centrífuga de vidro de 10 mililitros.Prepare oito tubos adicionais com três mililitros de PBS para uma curva de calibração. Em seguida, adicione 10 microlitros do padrão de calibração apropriado a cada tubo. Alinhar cada amostra de ensaio dos três mililitros recolhidos para a extracção de lípidos bioactivos livres.Adicione 10 microlitros de mistura de padrão interno a cada padrão de calibração e equilibre a amostra por 10 minutos em temperatura ambiente para processar amostras a cinco mililitros de éter datil e coloque em um agitador por 30 minutos. Centrifugar as amostras e transferir a fase orgânica superior para tubos de centrífuga de vidro de 10 mililitros. Continue a secar as amostras sob nitrogênio Primeiro, colete as amostras de células colhidas por centrifugação e ressuspenda cada palete em dois mililitros de PBS por Vortex Reserve 25 microlitros de cada amostra para normalização do lisado celular.Agora divida igualmente cada lisado em tubos de centrífuga de vidro de 10 mililitros. Adicione mais dois mililitros de PBS e 10 microlitros de ISM a cada amostra para medir os lipídios celulares livres e evitar a degradação alcalina de lipídios, como as prostaglandinas, use uma de cada amostra duplicada para realizar extrações de éter datil conforme mostrado anteriormente. Para extrair lipídios esterificados, adicione cinco mililitros de mistura de clorofórmio metanol a cada uma das amostras restantes.Coloque em uma coqueteleira em velocidade baixa por 30 minutos e depois centrifugue por 10 minutos. Agora, colete a camada orgânica inferior e seque as amostras sob nitrogênio para sificar os lipídios esterificados. Adicione 0,5 mililitros de hidróxido de potássio normal 0,4 em 80% de metanol a cada tubo.Incube amostras a 60 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione dois mililitros de PBS e ajuste o pH dois seis com ácido clorídrico concentrado. Finalmente, adicione 10 microlitros de ISM a cada amostra e prossiga para extrações de éter datilo para as amostras secas e padrões de calibração.Adicione reagentes de derivitização na ordem especificada. Em seguida, vórtice as amostras e incubar a 60 graus Celsius por uma hora. Agora, seque as amostras sob nitrogênio antes do armazenamento e análise.Este método usa uma combinação de diluição de isótopos estáveis, chii, cromatografia líquida, captura de elétrons, pressão atmosférica, ionização química e análise de espectrometria de massa. Reconstitua as amostras e os padrões de calibração em 100 microlitros de etanol hexano e transfira as amostras inteiras para frascos de HPLC com inserto e coloque as amostras no amostrador automático resfriado. Crie uma lista de amostra para análise.Em seguida, configure os métodos HPLC e MS usando os parâmetros descritos na tabela um e na tabela dois do protocolo escrito que acompanha a separação de fases. Um pacote quiral, uma coluna DH a 30 graus Celsius, injeta amostra e começa a corrida. Agora defina o MS no modo de íon negativo usando a fonte A PCI.Comece com um hexano em branco para equilibrar a coluna. Em seguida, execute as amostras padrão de calibração em ordem crescente de concentração de SM. Continuar a processar amostras de teste de meios de cultura após a separação HBLC.Adicione a coluna de pino de metanol para evitar a deposição na agulha corona. Usando dados gerados a partir dos padrões. Crie uma curva de calibração plotando a área amostral no eixo Y e a concentração padrão no eixo x deriva a equação Y igual a MX mais B.Finalmente, determine as concentrações de lipídios bioativos da amostra de teste para a célula. Lysates. Normalize esses valores dividindo a concentração determinada de lipídio bioativo pelo número de células por placa ou pela proteína total normalizada nas etapas anteriores. Os dados do monitoramento de reações múltiplas indicam vários ácidos linoléico e araquidônico.Metabólitos oxidados. 13 e nove, seguram junto com os 13 e nove correspondentes A ode Oxo são derivados do ácido linoléico. Além disso, metabólitos térmicos do ácido araquidônico e seus produtos oxidados também estão presentes conforme o esperado.Há uma pequena mudança no tempo de retenção do padrão interno reduzido em comparação com o padrão não rotulado. É importante ressaltar que este protocolo também separa o calor e as formigas e determina transições únicas para os isômeros estéreo que podem resultar da oxidação enzimática de um ácido araquidônico ou da reação com espécies reativas de oxigênio. Por exemplo, este cromatograma mostra a separação entre os isômeros estéreo r e s de cinco.A análise lipidômica térmica é uma técnica poderosa para análises de várias espécies lipídicas. Por exemplo, este experimento avalia e quantifica prostaglandinas, isop senes e leucotrieno B quatro. Além dos calores que Oxo come e metabólitos ômega hidroxilados, Este método pode ser otimizado para a extração de lipídios bioativos de outras matrizes biológicas, como plasma, urina e tecido.Em alguns casos, lipídios bioativos têm sido usados como biomarcadores de resposta ao estresse oxidativo.

cellular-lipid-extraction-for-targeted-stable-isotope-dilution-liquid

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Bioengineering

Bioengenharia

Duas técnicas de isolamento de gotículas lipídicas celulares a partir de 1) células de levedura e 2) placentas humanas estão apresentadas. A peça central de ambos os processos é a centrifugação de gradiente de densidade, onde a camada flutuante resultante contendo as gotículas podem ser facilmente visualizadas por olho, extraiu-se, e quantificada por análise de Western Blot quanto à pureza.

Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

Fosfoinositídeos estão sinalizando lipídios, cuja abundância relativa muda rapidamente em resposta a vários estímulos. Este artigo descreve um método para medir a abundância de fosfoinositídeos por meio de rotulagem metabolicamente células com 3 H- mio-inositol, seguido por extracção e desacilação. Extraídos glicero-inositides são então separados por cromatografia líquida de alto desempenho e quantificadas por cintilação fluxo.

Radiomarcação e quantificação dos níveis celulares de Fosfoinositídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado Fluxo de Cintilação

gotículas lipídicas são organelos importantes para a replicação de vários agentes patogénicos, incluindo o vírus da hepatite C (HCV). Descreve-se um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas; ele pode ser utilizado sob uma variedade de condições, tais como infecção por vírus, stress ambiental, ou tratamento com droga.

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

É apresentado um protocolo para extração abrangente de lipídios, metabólitos e proteínas de tecidos biológicos usando uma amostra.

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Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar e qualificar cada espécie de esfingomielina usando múltiplas reação monitoramento e modo de MS/MS/MS, respectivamente.

Método quantitativo e qualitativo para esfingomielina por LC-MS usando dois estável desvendar rotulado esfingomielina espécies

Este artigo apresenta um protocolo modular para lipidômica tecidual e transcriptômica, e lipidomias plasmáticas em modelos de camundongos de doenças neurológicas que visam lipídios subjacentes à inflamação e atividade neuronal, lipídios de membrana, mensageiros a jusante e enzimas/receptores de codificação de mRNA. São delineados procedimentos de amostragem, processamento de amostras, extração e quantificação.

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Este método fornece um quadro para estudar a incorporação de ácidos graxos exógenos de fontes hospedeiras complexas em membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para conseguir isto, os protocolos para o enriquecimento de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha e do perfil de ácido gordo subseqüente de fosfolipídios bacterianos que utilizam a espectrometria maciça são descritos.

Isolação de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha para o estudo da incorporação do ácido gordo do micróbio patogénico bacteriano em phospholipids da membrana

Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem para identificar e quantificar os principais lipídios celulares em Saccharomyces cerevisiae. O método descrito para uma avaliação quantitativa das principais classes lipídicas dentro de uma célula de levedura é versátil, robusto e sensível.

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Aqui, é apresentado um protocolo para a rotulagem metabólica da levedura com ácido acético de 14C, que é acoplado à cromatografia de camada fina para a separação de lipídios neutros.

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Descrevemos um método para o uso de ciclodextrina para mediar a troca entre lipídios da membrana plasmática com lipídios exógenos. Essa técnica pode ser combinada com experimentos que estudam proteínas transmembranares, que se comportam de maneira diferente em ambientes semelhantes a jangadas lipídicas do que em ambientes não semelhantes a jangadas.

Ensaio de Troca Lipídica em Células Vivas

Aprenda a extrair e quantificar lipídeos bioativos celulares com diluição de isótopos estáveis e cromatografia líquida-espectrometria de massa. Este método avançado permite analisar vias enzimáticas metabólicas com alta precisão.

Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis ​​Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia (Vídeo) | JoVE Journal

Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis ​​Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia

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