Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis ​​Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia

O método visa quantificar com precisão os metabólitos lipídicos bioativos celulares pela combinação de diluição de isótopos estáveis, fase cnor, cromatografia líquida, captura de elétrons, pressão atmosférica, ionização química e espectrometria de massa. Comece colhendo amostras de mídia e células e adicione uma mistura de padrão interno rotulada com isótopo pesado. Extraia os lipídios bioativos com solvente orgânico e, em seguida, derive os lipídios bioativos com um reagente de captura de elétrons e prossiga para quantificar com precisão os lipídios bioativos por cromatografia líquida.

A espectrometria de massa por meio da análise LCMS dos resultados do lisado celular e do meio determina com precisão a concentração de lipídios bioativos direcionados e os níveis de Anant ERs individuais. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como cromatografia líquida de fase reversa, espectrometria de massa e outros métodos LCMS, é que o indivíduo e os antenos são quantificados com precisão por meio do uso de cromatografia de fase normal de carro e diluição de isótopos estabilizados. Os dados resultantes podem fornecer informações valiosas sobre as vias enzimáticas que funcionam na célula.

Para cada placa de 10 centímetros de um aderente, as células coletam três mililitros de meio em um tubo de centrífuga de vidro de 10 mililitros. Em seguida, lave as células duas vezes com PBS. Em seguida, adicione um mililitro de PBS, raspe as células da placa e transfira a amostra para um segundo tubo de centrífuga de vidro de 10 mililitros.

Prepare oito tubos adicionais com três mililitros de PBS para uma curva de calibração. Em seguida, adicione 10 microlitros do padrão de calibração apropriado a cada tubo. Alinhar cada amostra de ensaio dos três mililitros recolhidos para a extracção de lípidos bioactivos livres.

Adicione 10 microlitros de mistura de padrão interno a cada padrão de calibração e equilibre a amostra por 10 minutos em temperatura ambiente para processar amostras a cinco mililitros de éter datil e coloque em um agitador por 30 minutos. Centrifugar as amostras e transferir a fase orgânica superior para tubos de centrífuga de vidro de 10 mililitros. Continue a secar as amostras sob nitrogênio Primeiro, colete as amostras de células colhidas por centrifugação e ressuspenda cada palete em dois mililitros de PBS por Vortex Reserve 25 microlitros de cada amostra para normalização do lisado celular.

Agora divida igualmente cada lisado em tubos de centrífuga de vidro de 10 mililitros. Adicione mais dois mililitros de PBS e 10 microlitros de ISM a cada amostra para medir os lipídios celulares livres e evitar a degradação alcalina de lipídios, como as prostaglandinas, use uma de cada amostra duplicada para realizar extrações de éter datil conforme mostrado anteriormente. Para extrair lipídios esterificados, adicione cinco mililitros de mistura de clorofórmio metanol a cada uma das amostras restantes.

Coloque em uma coqueteleira em velocidade baixa por 30 minutos e depois centrifugue por 10 minutos. Agora, colete a camada orgânica inferior e seque as amostras sob nitrogênio para sificar os lipídios esterificados. Adicione 0,5 mililitros de hidróxido de potássio normal 0,4 em 80% de metanol a cada tubo.

Incube amostras a 60 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione dois mililitros de PBS e ajuste o pH dois seis com ácido clorídrico concentrado. Finalmente, adicione 10 microlitros de ISM a cada amostra e prossiga para extrações de éter datilo para as amostras secas e padrões de calibração.

Adicione reagentes de derivitização na ordem especificada. Em seguida, vórtice as amostras e incubar a 60 graus Celsius por uma hora. Agora, seque as amostras sob nitrogênio antes do armazenamento e análise.

Este método usa uma combinação de diluição de isótopos estáveis, chii, cromatografia líquida, captura de elétrons, pressão atmosférica, ionização química e análise de espectrometria de massa. Reconstitua as amostras e os padrões de calibração em 100 microlitros de etanol hexano e transfira as amostras inteiras para frascos de HPLC com inserto e coloque as amostras no amostrador automático resfriado. Crie uma lista de amostra para análise.

Em seguida, configure os métodos HPLC e MS usando os parâmetros descritos na tabela um e na tabela dois do protocolo escrito que acompanha a separação de fases. Um pacote quiral, uma coluna DH a 30 graus Celsius, injeta amostra e começa a corrida. Agora defina o MS no modo de íon negativo usando a fonte A PCI.

Comece com um hexano em branco para equilibrar a coluna. Em seguida, execute as amostras padrão de calibração em ordem crescente de concentração de SM. Continuar a processar amostras de teste de meios de cultura após a separação HBLC.

Adicione a coluna de pino de metanol para evitar a deposição na agulha corona. Usando dados gerados a partir dos padrões. Crie uma curva de calibração plotando a área amostral no eixo Y e a concentração padrão no eixo x deriva a equação Y igual a MX mais B.

Finalmente, determine as concentrações de lipídios bioativos da amostra de teste para a célula. Lysates. Normalize esses valores dividindo a concentração determinada de lipídio bioativo pelo número de células por placa ou pela proteína total normalizada nas etapas anteriores. Os dados do monitoramento de reações múltiplas indicam vários ácidos linoléico e araquidônico.

Metabólitos oxidados. 13 e nove, seguram junto com os 13 e nove correspondentes A ode Oxo são derivados do ácido linoléico. Além disso, metabólitos térmicos do ácido araquidônico e seus produtos oxidados também estão presentes conforme o esperado.

Há uma pequena mudança no tempo de retenção do padrão interno reduzido em comparação com o padrão não rotulado. É importante ressaltar que este protocolo também separa o calor e as formigas e determina transições únicas para os isômeros estéreo que podem resultar da oxidação enzimática de um ácido araquidônico ou da reação com espécies reativas de oxigênio. Por exemplo, este cromatograma mostra a separação entre os isômeros estéreo r e s de cinco.

A análise lipidômica térmica é uma técnica poderosa para análises de várias espécies lipídicas. Por exemplo, este experimento avalia e quantifica prostaglandinas, isop senes e leucotrieno B quatro. Além dos calores que Oxo come e metabólitos ômega hidroxilados, Este método pode ser otimizado para a extração de lipídios bioativos de outras matrizes biológicas, como plasma, urina e tecido.

Em alguns casos, lipídios bioativos têm sido usados como biomarcadores de resposta ao estresse oxidativo.