Um Protocolo para Detecção e eliminação em fase gasosa radicais livres do fumo do cigarro Mainstream

O objetivo geral deste procedimento é medir a quantidade de radicais livres na fumaça principal do tabaco e avaliar a capacidade de eliminação de diversos antioxidantes. Isso é realizado primeiramente preparando filtros contendo diferentes compostos eliminadores, bem como controles sem filtro eliminador. O preparo é seguido por simulação de fumaça com a fumação de cigarros de pesquisa, fazendo a fumaça passar por uma solução de captura de spins.

A ressonância de spin eletrônico, abreviada como ESR, é então utilizada para registrar espectros de radicais aprisionados, bem como de amostras de referência. Os espectros de ESR obtidos posteriormente são submetidos a uma análise de rotina, com o objetivo de separar o sinal dos radicais aprisionados na fase gasosa do fundo e quantificar a concentração de radicais utilizando uma amostra de referência. Por fim, os resultados mostram informações quantitativas sobre o teor de radicais livres na fumaça principal do cigarro e estimativas da capacidade de eliminação de antioxidantes naturais por meio da espectroscopia de ESR com aprisionamento de spin.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes de análise da fumaça do tabaco, como a cromatografia gasosa, é que a RPE é especificamente sensível aos radicais livres. As implicações desta técnica podem ajudar na redução dos efeitos nocivos da fumaça do tabaco, pois os radicais livres constituem um grupo importante de carcinogênicos. Este método pode proporcionar uma melhor compreensão do estudo dos radicais livres na fumaça do tabaco, e também pode ser aplicado a outros sistemas, como a emissão de fumaça industrial e fumaça de crack. O Centro Nacional de Pesquisa Biomédica para a tecnologia de ressonância de spin eletrônico, também conhecido como cert, é um desdobramento de nossa vasta experiência no desenvolvimento da tecnologia moderna de RPE.

Para pesquisadores envolvidos na ressonância de spin eletrônico, oferecemos uma ampla variedade de serviços para eles e para a comunidade biomédica. Colocamos nossas instalações regularmente à disposição para introduzir antioxidantes no filtro do cigarro. Primeiro, dissolva os antioxidantes, pycnogenol e extrato de uva em etanol 95% e dissolva licopeno em acetona.

Ajuste os volumes do solvente conforme a solubilidade dos antioxidantes. Em seguida, combine os antioxidantes dissolvidos com carbono ativado sob agitação em condições anaeróbicas por aproximadamente 12 horas. As condições anaeróbicas são obtidas borbulhando Argonne através da mistura durante a agitação.

Após a incubação, filtre a solução e seque sob vácuo. Em seguida, introduza os antioxidantes e o carbono em um filtro de acetato convencional cortando primeiro o filtro em duas partes. Insira os antioxidantes vegetais revestidos entre duas partes do filtro para formar um sanduíche de filtro com antioxidantes, e reinsira-o no cilindro de papel do cigarro.

Prepare o filtro controle da mesma forma que o filtro com antioxidante, exceto por não adicionar o antioxidante antes da montagem experimental. Os cigarros de pesquisa devem ser desembalados e mantidos em um ambiente de umidade constante, utilizando uma solução saturada de brometo de sódio, por um período mínimo de dois dias. Retire as hastes de cigarro contendo tabaco e conecte-as ao filtro combinado.

Realize a simulação de fumo para análise rotineira à temperatura ambiente utilizando um dispositivo de fumo de porta única, que consiste em um aspirador de água ou bomba de vácuo/compressor de ar conectado ao conjunto de captura por spin através de uma junção em T com uma extremidade aberta. Use um medidor de fluxo para verificar o fluxo de gás e ajuste-o em aproximadamente 2,2 pés cúbicos padrão por hora, regulando uma válvula posicionada entre a bomba e a ventilação. Fume os cigarros de pesquisa com um volume intenso de baforada de 35 mililitros durante um período de dois segundos, repetindo a cada 60 segundos.

A extremidade aberta do dispositivo de fumo deve ser tampada para realizar as tragadas e mantida aberta entre as tragadas. Enquanto a extremidade estiver destampada, há pouca corrente de ar através do cigarro, o que corresponde às condições entre as tragadas. Realize 10 tragadas intensas para cada cigarro, coletando radicais livres na fase gasosa ao passar a fumaça principal do cigarro por uma almofada de filtro Cambridge e, em seguida, introduzindo-a na solução de aprisionamento de spins.

A armadilha de nitrogênio líquido remove o vapor d'água da fumaça principal, mas não afeta substancialmente os radicais na fase gasosa. Após a última tragada, transfira uma alíquota da solução de armadilhamento borbulhada para um tubo de amostra de vidro com aproximadamente 25 cm de comprimento e diâmetro interno de três milímetros. Como o oxigênio alarga os espectros de RPE e diminui a sensibilidade do método, desoxigene a solução utilizando o método de congelamento, bombeamento e descongelamento, mergulhando primeiro o tubo em nitrogênio líquido, depois evacuando a solução com uma bomba a óleo e, em seguida, descongelando a solução sob argônio.

Repita este método de congelamento, bombeamento e descongelamento várias vezes. Em seguida, feche o tubo sob vácuo. O tubo está agora pronto.

Para medições adicionais de RPE, registre espectros de RPE em banda X em um espectrômetro Bruker EMX a uma frequência de 9,34 gigahertz. Em condições padrão, consulte o protocolo escrito para obter as configurações típicas do espectrômetro utilizadas. Para esses experimentos, realize 25 acumulações de RPE, o que normalmente leva aproximadamente 20 minutos.

Embora os aditivos aprisionadores de spins sejam relativamente estáveis nas condições experimentais após 12 horas, a intensidade dos sinais de RPE em solução de benzeno diminuiu por um fator de cinco. Para quantificar a concentração do aditivo aprisionador, integre o espectro inicial de primeira derivada de RPE. O espectro de absorção resultante mostra um fundo largo de sinal único, provavelmente devido a produtos de fuligem e alcatrão contidos na fumaça.

Após a subtração desse fundo, integre o triplo separado do aditivo de aprisionamento. Mais uma vez, para obter a concentração do radical livre. Os valores das integrais duplas para a solução de aprisionamento de spin são comparados com os de uma solução de um radical nitroxila tempo com concentração conhecida, proveniente do experimento demonstrado aqui, bem como com cálculos adicionais encontrados no protocolo escrito.

Obteve-se uma concentração de radicais livres na fase gasosa da fumaça principal do cigarro de aproximadamente 7,1 vezes 10 elevado a menos nove molar. A partir disso, determinou-se que o número total de radicais aprisionados a partir da fase gasosa de um cigarro inteiro é de cerca de 1,5 vezes 10 à 15ª potência. Durante este experimento, medições iniciais levaram a sinais fracos de RPE e baixa reprodutibilidade devido à umidade no fluxo de fumaça.

Para resolver este problema, uma armadilha de nitrogênio líquido foi adicionada ao dispositivo de simulação de fumaça entre o filtro de Cambridge e a solução do spin trap. A armadilha de nitrogênio líquido removeu a água do fluxo de fumaça principal do cigarro por congelamento rápido e captura na parede interna do tubo de vidro. Isso melhorou significativamente os sinais de RPE e permitiu resultados altamente reprodutíveis.

Foram observados diferentes níveis do efeito sequestrante de antioxidantes vegetais sobre radicais livres na fase gasosa da fumaça principal do cigarro, e suas taxas de sequestro são apresentadas. O licopeno e o extrato de semente de uva apresentaram as taxas mais altas, enquanto uma taxa mais baixa foi observada para o pycnogenol. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em menos de uma hora, se executada corretamente.

Após tentar o procedimento, é importante fazer a fumaça passar por uma armadilha de nitrogênio líquido. Isso melhora a qualidade dos espectros de RS e a reprodutibilidade após o desenvolvimento. A técnica auxiliou pesquisadores na área da saúde e do meio ambiente a explorar e identificar a presença de radicais livres perigosos para a saúde em diversos compostos voláteis.

Após assistir ao vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar radicais livres na fumaça principal do tabaco, com o objetivo de reduzir os efeitos nocivos do fumo.