Name: Transretinal Recordings ERG de Retina do mouse: Rod e Photoresponses Cone (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprenda a realizar gravações de ERG transretinal em retina de camundongo para obter fotorespostas de bastonetes e cones. Este método isola respostas fotoreceptoras bloqueando transmissão sináptica, permitindo análises precisas em neurociência.

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Apoiado pelo Prémio Carreira de Desenvolvimento de Pesquisa para a Prevenção da Cegueira, NIH concede EY19312 e EY19543 (VJK), bem como pela concessão irrestrita de Pesquisa para a Prevenção da Cegueira e EY02687 (Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais da Universidade de Washington).

1. Fazendo Eletrodos <ol><li> Prepare-se eletrodos de vidro. Pesar 120 mg de agar e misturá-lo em 10 mL de água destilada (concentração final de ágar 1,2%). Derreta a solução ágar-ágar em banho de água quente. Encha capilares de vidro (usamos Instruments Presision palavra TW100-4 capilares com as seguintes dimensões: comprimento = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm, eo volume interno = uL 44) com a solução de agar usando uma seringa de plástico. Solidificar o ágar, à temperatura ambiente durante 10 min. Assim, até ~ 200 capilares podem ser preenchidos (o resto da mistura de ágar pode ser armazenada a -4 ° C e re-usados ​​várias vezes). </li><li> Cortar os capilares em metades, utilizando uma faca de diamante. </li><li> Embeber os eléctrodos de vidro resultantes em solução eléctrodo rato durante pelo menos 24 horas a 4 ° C. Armazenar os eléctrodos a 4 ° C e utilizá-los ao longo do período de 3-4 meses. </li></ol> 2. Configurando o Experimento <ol><li> Dark-se adaptar um mouse durante a noite. Use tipo selvagem (por exemplo, C57Bl / 6) ratos para vara-driven gravações transretinal e alfa T - / - ratos haste falta de sinalização 8 para gravações de cone transretinal. </li><li> Preparar uma solução de perfusão L, 100 mL solução eléctrodo, e 20 mL solução de incubação (ver abaixo) e filtrar a solução de perfusão através de um Millipore de 0,45 ou 0,22 mM de filtro (opcional). </li><li> Calibrar a fonte de luz (505 nm LED ou estimulador de halogénio lâmpada óptico), utilizando um fotómetro colocado no plano da retina. No caso da fonte de luz de LED, usar um difusor óptico para alcançar a uniformidade da luz. </li><li> Prepare a câmara de perfusão para a experiência (construções de câmara pode variar). A nossa câmara é feita de 3 Plexiglas mm, com uma parte inferior feita a partir da tampa de uma placa de Petri de plástico pequeno, e tem um volume de perfusão activa de ~ 400 uL (L = 25 mm, W = 8 mm, H ≈ 2 mm). Encher o espaço eléctrodo inferior da câmara de eléctrodo com uma solução contendo 2 mM de L-glutamato e 10 mM de BaCl 2. Usando tubos de plástico e um capilar de vidro, fazer uma ligação entre a solução no espaço inferior do eléctrodo (feita de ligador de tubagem de plástico ligado à parte inferior da câmara) e do suporte de eléctrodo. Certifique-se que não há bolhas no eletrodo, o tubo de ligação, ou o titular do eletrodo (purgar a solução com seringa de plástico, se necessário). </li><li> Montar a câmara de gravação sobre a fase do microscópio (opcional: o microscópio pode ser montado sobre uma mesa de anti-vibração e blindado dentro de uma gaiola de Faraday para minimizar o ruído mecânica e electromagnética). Ligue o suporte inferior do eléctrodo para o pólo headstage positivo do amplificador diferencial (por exemplo, Warner Instruments amplificador DP-311). Centro e alinhar o eletrodo câmara inferior de abertura com o ponto de luz de estímulo. Ligue a linha de perfusão para a câmara de gravação e transformar a perfusão no. </li><li> Solução de bolha a perfusão com 95% O2 / 5% CO 2, enquanto incubando-lo em 40 ° C watbanho de er. CO 2 ajusta o pH da solução para 7,2. A solução flui a partir do frasco para a câmara de gravação por gravidade passando através de uma resistência de cerâmica de reaquecimento para 36-37 ° C. Para reduzir a perda de calor, o aquecedor deve estar localizado mais próximo da câmara de registo quanto possível, preferencialmente na fase do microscópio. </li><li> Com um regulador de fluxo ajustar a taxa de fluxo de até cerca de 1 mL / min. </li><li> Ligue o eléctrodo superior ao pólo (negativo) do segundo headstage usando um suporte de eléctrodo segundo. Se ligam a sonda do termopar ao eléctrodo superior usando um O-ring. Assegure-se que as pontas de eléctrodos e termopar estão juntos de modo a que a leitura da temperatura é tomado como perto do centro da retina quanto possível. Mergulha-se o ponta do eléctrodo superior na solução de perfusão e coloque-o no centro da câmara. Permitir 10-15 min para a estabilização de linha de base. </li><li> Ajustar a tensão de CC para o aquecedor de modo que a temperatura da solução é de 36 -37 ° C. </li></ol> 3. Isolando a retina do rato <ol><li> Sob a luz vermelha ofuscante, a eutanásia o mouse de adaptação ao escuro com CO 2 e deslocamento cervical. Opcional: fazer uma marca de referência em cada olho do rato por cauterização do ponto mais dorsal da esclera com uma caneta de bisturi ou pino dissecando aquecida. Todos os procedimentos subsequentes são realizados sob a luz infravermelha utilizando conversores de imagem de infravermelhos ajustado a um microscópio de dissecação. </li><li> Dissecar os olhos com tesouras curvas através da aplicação de uma ligeira pressão e esticar a pele sobre os lados de cada olho. Hemisect ambos os globos oculares sob iluminação infravermelha usando microtesoura ou uma lâmina de barbear. </li><li> Remover o córnea e do cristalino. Remover o máximo do vítreo quanto possível. </li><li> Peel a retina primeiro a partir da camada de epitélio pigmentar e, se necessário, limpar cuidadosamente com uma pinça para remover os grânulos permanência do epitélio do pigmento. Estamos tipicamente usando retina todo para ambos haste e transret conegravações Inal. No entanto, se você deseja gravar especificamente da parte dorsal da retina do rato que tem mais M / L de cones 9, antes de descascar a retina remover a parte ventral da ocular com uma lâmina de barbear ou microtesoura usando a marca de cauterização como uma referência. </li><li> Coloque o globo ocular segundo hemisected numa placa de Petri com solução de incubação pequeno e incubar a preparação de uma caixa à prova de luz saturado com oxigénio puro até à utilização. Tipicamente, nestas condições a ocular do rato segundo pode ser armazenada durante várias horas à temperatura ambiente e utilizada para gravações. </li><li> Usando uma pipeta de vidro ou de plástico transferir a retina isolado para uma gota de solução de perfusão (300 uL ca.) sobre a tampa de uma placa de Petri. Adicionar 5-6 pequenas gotas de solução de eléctrodo contendo BaCl 2 a pré-incubar o retina com BaCl 2. Coloque um pedaço quadrado (mm 5x5 ca.) do lado do canto-untada (usamos Dow Corning lubrificante válvula 111 e selante) papel de filtro Millipore (0,45 mm Harg tipo) com pré-fabricados furo no seu centro (2-2,5 mm de diâmetro) para a gota mesma solução. Usando posição pinça da retina no topo do papel de filtro (fotoreceptor lado para cima) e pressionar os seus bordos na periferia à secção plana-montá-lo. A retina deve ser centrado sobre a abertura no papel de filtro. </li><li> Utilizando uma pinça transferir o papel de filtro com a retina para a câmara de perfusão e colocá-lo acima do estímulo spot-alinhados espaço eléctrodo inferior. Ligeiramente pressionar as bordas untadas do papel de filtro para ligação com a câmara. </li><li> Coloque o eletrodo superior sobre o centro da retina (ligeiramente tocar na camada dos fotorreceptores). Centrando o eléctrodo superior sobre a retina aumenta a amplitude do sinal (até 20-40% ~, em comparação com colocando-o mais perto da borda da retina). Embora a localização do eletrodo como distorce um pouco a intensidade do estímulo eficaz luz que atinge um pequeno setor da retina (~ 12-15% de sua área total), ainda é a melhor maneira de colocar a elecatropelou. A preparação está agora pronto para gravações transretinal. </li></ol> 4. Gravações Transretinal <ol><li> Dependendo da sua linha de mouse, registro haste ou M / L-cone-driven respostas flash de teste de fraca a intensidade de luz brilhante nm calibrado 505 fornecidos a partir de fonte de luz LED ou estimulador óptico. No caso de a nossa fonte de luz de LED, a intensidade do flash é controlada por uma combinação de controlo computadorizado de tensão de entrada de LED, resistores comutáveis, e um conjunto de filtros de densidade neutra (usamos E Cor-# 211 0,9 filtros ND película de Rosco Laboratories ), colocada entre o LED ea retina. A duração do teste LED de flash (20 ms) é controlado por um computador. Se usando uma lâmpada de halogéneo de estimulador óptico, teste de intensidade de flash e comprimento de onda pode ser controlada por um conjunto de filtros de densidade neutra e filtros de interferência de banda estreita, respectivamente. Teste de duração do flash pode ser controlado por computador orientadas persianas. </li><li> Opcional: para a manutenção eficientesupressão do componente glial de photoresponse com BaCl 2 ao longo do dia, mudar a solução eléctrodo inferior, ocasionalmente (por exemplo, antes do ensaio, cada retina) pela purga-lo usando uma seringa de plástico cheio com solução fresca. </li></ol> 5. Os resultados representativos Soluções <ol><li> Rato solução de perfusão retina: 112,5 mM de NaCl, 3,6 mM de KCl, 2,4 mM de MgCl2, 1,2 mM de CaCl2, 10 mM de HEPES (pH 7,2), 20 mM NaHCO3, 3 mM Na succinato, 0,5 mM de glutamato, de Na 0,02 mM de EDTA, e 10 mM de glucose. Além disso, a solução é suplementado com 2 mM de L-glutamato e 10 uM de DL-AP-4 para bloquear os componentes de ordem superior do photoresponse 10,11, e com 0,1% de vitaminas MEM e soluções de MEM de aminoácidos (Sigma) para melhorar a retina viabilidade. </li><li> Solução rato eléctrodo: 140 mM de NaCl, 3,6 mM de KCl, 2,4 mM de MgCl2, 1,2 mM de CaCl2, 3 mM de HEPES (pH 7,4, NaOH). A solução na parte inferior do elementoctrode espaço também contém 2 mM de L-glutamato de bloquear a transmissão sináptica 10 e, além disso, 10 mM de BaCl 2 para suprimir o componente glial do photoresponse 3,12. </li><li> Solução de incubação retina: dissolver 272 mg de L-15 médio (Sigma) e 20 mg de BSA em 20 mL de água desionizada. Final L-15 e as concentrações de BSA são 13,6 mg / mL e 1 mg / mL, respectivamente. Ajustar o pH para 7,4 com 1 M de HCl. </li></ol><img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1."> Figura 1. Diagrama esquemático, mostrando o isolamento de retina do rato para gravações transretinal ERG. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2."> Figura 2. Fotografia da câmara de perfusão e eletrodos de registro com seus titulares. As setas vermelhas indicam a direção do fluxo de perfusão. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3."> Figura 3. Diagrama esquemático da montagem experimental para as gravações transretinal ERG. As setas vermelhas indicam a direção do fluxo de perfusão. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4."> Os resultados representativos Figura 4:. Gravado família de rato haste-driven respostas transretinal. Photoresponses foram filtrada passa-baixa de 30 Hz (8-pólo Bessel), digitalizados em 1 kHz e armazenadas em um computador para análise posterior. Traços apresentados representam médias de 5-6 respostas em intensidades de luz ténue e 2-3 respostas a intensidades luminosas saturantes. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5."> Figura 5: Os resultados representativos. Família gravada do rato-driven cone respostas transretinal. Photoresponses foram filtrada passa-baixa de 30 Hz (8-pólo Bessel), digitalizados em 1 kHz e armazenadas em um computador para análise posterior. Traços são mostrados averages de respostas 5-10 em intensidades de luz ténue e 3-5 respostas a intensidades luminosas saturantes.

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li>
<li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li>
<li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+photoproducts%3A+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li>
<li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li>
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<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mass+receptor+potential+of+the+isolated+frog+retina.+I.+General+properties+of+the+response%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response.</a> Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).</li>
<li>Vinberg, F., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sets+the+physiological+value+of+the+dominant+time+constant+of+saturated+mouse+rod+photoresponse+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery.</a> PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).</li>
<li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método de vara e cone-driven gravações transretinal ERG descrito acima está se tornando uma poderosa ferramenta para investigar a função dos fotorreceptores do mouse tanto no tipo selvagem e animais geneticamente modificados. Além disso para a caracterização das propriedades de fácil photoresponse básicos, esta técnica simples fornece estabilidade grande resposta de longa duração, durante experimentos realizados em preparações próxima do intactas da retina. Ambos de adaptação ao escuro haste amplitude de resposta máxi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do material </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentar </td></tr><tr><td> DL-AP-4 </td><td></td><td> TOCRIS biociência </td><td> 0101 </td><td></td></tr><tr><td> Todos os outros reagentes </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Capilares de vidro </td><td></td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> TW100-4 </td><td> Para fazer eletrodos </td></tr><tr><td> Papel-filtro </td><td> Harg </td><td> Millipore </td><td> HABG01300 </td><td></td></tr><tr><td> Fotômetro </td><td></td><td> Instrumentos da UDT </td><td> S350 </td><td> Para a calibração da luz </td></tr><tr><td> Sensor de silício radiométrica </td><td></td&gt; <td> Instrumentos da UDT </td><td> 221 </td><td> Para a calibração da luz </td></tr><tr><td> Anti-vibração tabela </td><td></td><td> Técnico Manufacturing Corporation </td><td> TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 </td><td> Para minimizar o ruído mecânico </td></tr><tr><td> Compressor de ar Panther P 15TC </td><td></td><td> Werther Internacional </td><td> P 15TC </td><td> Conectado a anti-vibração tabela </td></tr><tr><td> Estereomicroscópio </td><td></td><td> LEICA </td><td> MZ9.5 </td><td> Para dissecção olho do mouse </td></tr><tr><td> Infravermelhos conversores de imagem </td><td></td><td> BEMeyers </td><td> ProwlerTM </td><td> Obrigado a estereomicroscópio </td></tr><tr><td> Amplificador diferencial DP-311 </td><td></td><td> Warner Instruments </td><td> DP-311 </td><td></td></tr><tr><td> Axon Digidata 1440A Digitizer </td><td>; </td><td> Molecular Devices </td><td> 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Dual Channel 8 pólos Filtro </td><td></td><td> Krohn-HITE Corporação </td><td> 3382 </td><td></td></tr><tr><td> Resistor de cerâmica </td><td></td><td> TE Conectividade </td><td> CGS SBCHE618RJ </td><td> Para reaquecer a solução de perfusão </td></tr><tr><td> Termopar </td><td> T </td><td> Physitemp Instruments </td><td> TI-18 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor de temperatura </td><td></td><td> Ómega </td><td> DPi32 </td><td> Conectado ao termopar </td></tr><tr><td> LED 505 nm </td><td></td><td> TT Electronics / Optek Technology </td><td> Digi-chave P / N 365-1185-ND </td><td> Para aplicar flashes de ensaio ou de luz de branqueamento </td></tr><tr><td> Caneta Cauterização </td><td></td><td> Bovie </td><td> AA25 </td><td> Para marcar a parte dorsaldo globo ocular do mouse </td></tr><tr><td> pCLAMP 10 Eletrofisiologia de Aquisição de Dados e Análise de Software </td><td></td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transretinal recordings erg de retina do mouse: rod e photoresponses cone

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Existem duas classes distintas de imagem formadoras de fotorreceptores na retina de vertebrados: bastonetes e cones. Rods são capazes de detectar fótons individuais de luz, enquanto cones operar continuamente sob rápidas mudanças das condições de luz brilhante. A absorção de luz pela vara e cone específicos pigmentos visuais nos segmentos exteriores de fotorreceptores desencadeia uma cascata de fototransdução que conduz eventualmente a encerramento de nucleótidos cíclicos-gated canais na membrana plasmática e hiperpolarização da célula. Esta mudança induzida pela luz em corrente e potencial de membrana pode ser registrado como um photoresponse, por qualquer de sucção 1,2 eletrodo clássica técnica de gravação ou por gravações eletrorretinograma transretinal (ERG) de retinas isoladas com farmacologicamente bloqueados componentes da resposta pós-sinápticos 3-5. O último método permite a droga acessíveis de longa duração gravações de fotorreceptores do rato e é particularmente útil para a obtenção de photoresponses estáveis ​​from os cones do mouse escassos e frágeis. No caso de cones, tais experimentos podem ser realizados tanto em condições de adaptação ao escuro e iluminação intensa seguinte que branqueia essencialmente todo o pigmento visual, para acompanhar o processo de recuperação fotossensibilidade cone durante a adaptação ao escuro 6,7. Neste vídeo, vamos mostrar como realizar vara e M / L-cone-driven gravações transretinal de escuro-adaptado retina mouse. Gravações haste irá ser efectuada utilizando retina do tipo selvagem (C57BL / 6) ratinhos. Por simplicidade, as gravações de cone será obtida a partir geneticamente modificado haste transducina α subunidade knockout (Tα - / -) ratinhos que carecem de haste de sinalização 8.

Nós descrevemos um método relativamente simples de transretinal eletrorretinograma (ERG) para a obtenção de gravações photoresponses haste e cone da retina do rato intacto. Esta abordagem tira vantagem do bloco de transmissão sináptica de fotorreceptores para isolar as suas respostas de luz e gravar os usando eléctrodos de campo colocados através da retina plana montado isolado.

Transretinal Recordings ERG de Retina do mouse: Rod e Photoresponses Cone

Existem duas classes distintas de fotorreceptores formadores de imagem na retina de vertebrados: bastonetes e cones. Os bastonetes são capazes de detectar fótons únicos de luz...

O objetivo geral deste procedimento é realizar gravações de eletroretinograma transretiniano a partir de retina de camundongo isolada e intacta, a fim de obter respostas fotônicas mediadas por bastonetes e cones. Primeiro, capilares de vidro e uma câmara de perfusão são preparados para as gravações. Ambas as câmaras oculares de um camundongo adaptado à escuridão são hemissecionadas.Sob iluminação infravermelha, a lente da córnea e o vítreo são removidos. A retina é destacada do epitélio pigmentado e colocada sobre o papel filtro com o lado dos fotorreceptores voltado para cima. A retina sobre o papel filtro é transferida para a câmara de perfusão no estágio do microscópio e posicionada entre dois eletrodos conectados ao estágio inicial de um amplificador diferencial.Por fim, são registradas respostas fotoelétricas mediadas por bastonetes e cones na retina de camundongo montada em plano. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como os registros clássicos de única célula, é que ela permite gravações prolongadas com acesso a fármacos a partir de fotorreceptores bastonetes e cones de camundongos de linhagem normal e modificados geneticamente. Está se tornando particularmente útil para obter respostas estáveis de camundongos, cujos fotorreceptores são escassos e frágeis.Cons Comece preparando as capilares de vidro. Prepare 10 mililitros de ágar a 1,2% em banho-maria quente. Encha as capilares de vidro com a solução de ágar usando uma seringa plástica, onde o ágar solidifica rapidamente.Corte os capilares ao meio usando uma lâmina de diamante. Mergulhe os eletrodos de vidro resultantes na solução de eletrodo para camundongo por pelo menos 24 horas a quatro graus Celsius. Agora prepare o microscópio de forma geral para minimizar ruídos mecânicos e eletromagnéticos.Monte o microscópio sobre uma mesa antivibratória e proteja-o dentro de uma gaiola de Faraday. No entanto, esses recursos não são essenciais. Calibre a fonte de luz utilizando um fotômetro colocado no plano da retina.No caso da Fonte de Luz LED, use um difusor óptico para obter uniformidade de luz utilizando um tubo de plástico e uma capilar de vidro. Faça a conexão entre o eletrodo inferior e o suporte do eletrodo. Em seguida, preencha o compartimento do eletrodo inferior da câmara de perfusão com a solução eletrolítica.Certifique-se de que não haja bolhas no eletrodo, na tubulação de conexão ou no suporte do eletrodo. Remova quaisquer bolhas purgando a solução com uma seringa. Após colocar a câmara de gravação sob o microscópio, conecte o suporte do eletrodo inferior ao polo positivo do estágio diferencial do amplificador.Em seguida, centralize e alinhe a abertura do eletrodo inferior da câmara com o ponto de luz estimuladora, utilizando uma solução de perfusão tamponada com bicarbonato contendo 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono, enquanto a incuba em um banho-maria a 40 graus Celsius. O pH da solução atingirá 7,2. Conecte a linha de perfusão à câmara de gravação e ligue a perfusão.A solução flui da garrafa para a câmara de gravação por gravidade. Ao passar por um resistor cerâmico, é reaquecida a 36 ou 37 graus Celsius. Para reduzir a perda de calor, o aquecedor deve ser posicionado o mais próximo possível da câmara de gravação.Idealmente, na platina do microscópio, coloque um regulador de fluxo no trajeto das soluções e ajuste-o para cerca de um mililitro por minuto. Agora, conecte o eletrodo superior ao segundo polo negativo da cabeça do estágio usando um suporte de eletrodo com uma O-ring, fixe a sonda do termopar a este eletrodo com as pontas o mais próximas possível, de modo que a leitura de temperatura seja feita próximo ao centro da retina. Em seguida, imerja a ponta do eletrodo superior na solução de perfusão e posicione-o no centro da câmara.Permita de 10 a 15 minutos para a estabilização da linha de base. Por fim, ajuste a voltagem contínua para o aquecedor de modo que a temperatura da solução fique entre 36 e 37 graus Celsius. Prepare o camundongo mantendo-o no escuro, adaptando-o durante a noite.Utilize camundongos selvagens, como C57 black six, para gravações transretinianas mediadas por bastonetes ou camundongos knockout do alfa transdutor de bastonetes, que não possuem sinalização de bastonetes, para gravações transretinianas de cones. Antes de trabalhar no escuro, prepare um pedaço quadrado de papel filtro fazendo um orifício de dois a 2,5 milímetros em seu centro e engraxe suas pontas. Todos os passos a seguir devem ser realizados sob luz infravermelha. O microscópio de dissecação é equipado com conversores de imagem infravermelha a partir dos hemisférios oculares seccionados.Remova ambas as córneas e lentes. Remova o máximo possível do vítreo durante esses procedimentos. Prossiga trabalhando com uma cúpula ocular por vez.O segundo copo ocular pode ser conservado por várias horas em uma placa contendo solução de incubação, dentro de uma caixa iluminada saturada com oxigênio puro e à temperatura ambiente, para realizar gravações de retinas inteiras. Descasque a primeira retina da camada do epitélio pigmentar e, se necessário, limpe-a cuidadosamente com pinça para remover grânulos remanescentes do epitélio pigmentar. Para realizar gravações da região dorsal da retina, remova a parte ventral do copo ocular antes de descascar a retina, utilizando uma lâmina de barbear ou tesoura microcirúrgica.E, com referência aos marcadores corry, remova a cúpula ocular ventral. Use uma pipeta para transferir a retina isolada para uma gota de solução de perfusão na tampa de uma placa de Petri. Em seguida, adicione cinco a seis pequenas gotas de solução eletrolítica contendo cloreto de bário.Coloque o filtro preparado com o orifício em uma gota de solução de perfusão com a retina, utilizando pin&ccedil;as. Posicione a retina em cima do papel filtro com o lado dos fotorreceptores voltado para cima. Em seguida, pressione suas bordas na periferia para mont&aacute;-la plana.A retina deve ser centralizada sobre a abertura no papel-filtro. Agora, transfira o papel-filtro com a retina para a câmara de perfusão e posicione-o acima do ponto de estímulo, alinhado ao espaço do eletrodo inferior. Pressione levemente as bordas com graxa do papel-filtro para fixá-lo à câmara.Por fim, posicione o eletrodo superior sobre o centro da retina de modo que o eletrodo toque levemente a camada de fotorreceptores. Agora prossiga com o experimento realizando gravações transretinianas. Para a nossa análise, utilizamos o software de aquisição e análise de dados Peak Lamp 10 da Molecular Devices Rotten Ate Our Accordance.Utilizamos uma luz LED de 505 nanômetros proveniente desta fonte LED durante sessões prolongadas de gravação. Para manter a supressão eficiente do componente glial da resposta fotônica, a solução do eletrodo inferior é trocada. Antes dos testes, cada retina deve ser suficiente.A intensidade do flash da fonte de luz LED foi controlada por uma combinação de controle computadorizado da voltagem do LED, resistores comutáveis e um conjunto de filtros de densidade neutra colocados entre o LED e a retina. A duração do flash de teste do LED, tipicamente de 20 milissegundos, foi controlada por um computador. Esses registros transretinianos mediados por bastonetes em camundongos C57 black six mostram traçados que representam médias de cinco a seis respostas em intensidades de luz baixa e de duas a três respostas em intensidades de luz saturantes.Cada traço desses dados de reescrita retiniana trans derivados do cone, obtidos de camundongos com inativação do gene da alfa-transducina nas bastonetas, representa uma média de cinco a dez respostas em intensidades de luz baixa e de três a cinco respostas em intensidades de luz saturante. Assim, após assistir a este vídeo, deveremos ter uma boa compreensão de como realizar e oito revestimentos de eletroretinograma a partir de retina isolada de camundongo para obter respostas fotônicas derivadas de bastonetas e cones.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Vamos mostrar como gravar respostas flash de cones do mouse usando um eletrodo de sucção.

Gravações de uma única célula de sucção de cones fotorreceptores rato

Este artigo fornece uma descrição de como dissecar e registro da preparação isolada da retina em mouse. Em particular, descrevemos como luz para gravar as respostas de uma população fluorescente etiquetado células ganglionares e, posteriormente, identificar e analisar a sua morfologia.

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

Este vídeo demonstra a gravação de um eletrorretinograma de acoplamento direto (DC-ERG) em um epitélio pigmentar da retina (EPR) de camundongo anestesiado e adaptado ao escuro. Após a aplicação de gotas dilatadoras, o animal é colocado em uma configuração de gravação e o eletrodo capilar preenchido com um tampão de sal é colocado na córnea. Depois de estabelecer a linha de base, o DC-ERG é registrado.

Registro de eletrorretinograma acoplado direto do epitélio pigmentar da retina em um camundongo

Nós descrevemos a preparação de fatias finas de retina aquático salamandras tigre...

Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

Demonstraremos como preparar fatias de retina do olho do camundongo e registrar as respostas à luz nos neurônios da retina. Todo o procedimento é realizado em condições adaptadas ao escuro.

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

Nós descrevemos um protocolo para acompanhar a dinâmica de Ca2 + nos terminais do axônio de cones fotorreceptores, utilizando uma preparação fatia ex-vivo da retina mouse. Este protocolo permite que os estudos exaustivos sobre cone Ca 2+ sinalização em um importante sistema de modelo de mamífero, o rato.

Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

O eletrorretinograma (ERG) é um potencial elétrico gerado pela retina em resposta à luz. Este artigo descreve como usar o ERG para avaliar a função retiniana, em ratos adaptados ao escuro, e como ele pode ser usado para avaliar uma intervenção neuroprotetora, no presente caso o pré-condicionamento isquêmico remoto.

Usando o Eletrorretinograma na Avaliação da Função na Roedor Retina e os efeitos protetores do remoto Limb Pré-Condicionamento Isquêmico

Ex vivo O ERG pode ser usado para registrar a atividade elétrica das células da retina diretamente de retinas intactas isoladas de animais ou humanos. Demonstramos aqui como os sistemas ERG in vivo comuns podem ser adaptados para gravações de ERG ex vivo, a fim de dissecar a atividade elétrica das células da retina.

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

Este protocolo descreve a medição simultânea do eletrorretinograma e dos potenciais evocados visuais em ratos anestesiados.

Gravação simultânea de Eletrorretinografia e potenciais evocados visuais em ratos anestesiados

Mostramos procedimentos de implantação e de gravação cirúrgicos para medir sinais eletrofisiológicos visuais do olho (eletrorretinograma) eo cérebro (potencial evocado visual) em ratos conscientes, que é mais análogo à condição humana, onde as gravações são realizadas sem confunde anestesia.

Implantação e Gravação do Wireless Eletrorretinograma e Visual Potencial Evocado em ratos conscientes

Aqui, apresentamos um método para registrar respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento da retina (RPE) em camundongos usando uma técnica conhecida como DC-ERGs descrita pela primeira vez por Marmorstein, Peachey, e colegas no início dos anos 2000.

Eletroretinograma acoplado direto (DC-ERG) para gravar as respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento de retina do rato

Aprenda a realizar gravações de ERG transretinal em retina de camundongo para obter fotorespostas de bastonetes e cones. Este método isola respostas fotoreceptoras bloqueando transmissão sináptica, permitindo análises precisas em neurociência.

Transretinal Recordings ERG de Retina do mouse: Rod e Photoresponses Cone

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