Isolando-LacZ expressar Células de tecidos de camundongos Inner Ear usando Citometria de Fluxo

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar células Z positivas frouxas da cóclea de camundongo neonatal usando citometria de fluxo. Isso é conseguido isolando primeiro um grande número de cócleas de camundongos em um período de tempo relativamente curto para manter as células viáveis e ter tecido inicial adequado. Como segunda etapa, as células LAX Z positivas são dissociadas e depois marcadas para preparar o tecido para a triagem.

As células são então classificadas por citometria de fluxo. As populações LAX Z high e lax low resultantes podem então ser usadas para experimentação adicional. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa do ouvido, como quais são os perfis genéticos ou populações de células específicas no ouvido interno.

Demonstrando o procedimento estará Taha Gen A estudante de medicina de nosso laboratório. Primeiro, encha placas de Petri de 35 milímetros com HBSS e coloque-as em um bloco de gelo. Então, depois de usar uma tesoura de íris para decapitar 12 a 15, pós-natal sacrificado, axônio de zero a três dias de idade, dois repórter frouxos e camundongos do tipo selvagem.

Coloque as cabeças em uma placa de Petri de 60 milímetros em um bloco de gelo. Em seguida, use uma pinça Dumont número cinco e uma tesoura de íris para extirpar a mandíbula e a língua das cabeças e, em seguida, corte a base do crânio no nível da paleta. Agora remova a pele sobrejacente da panturrilha e corte a base do crânio inserindo a tesoura na parte inferior do forame magno até o meio do palato.

Faça outra incisão com a tesoura da borda cortada do palato até a face superior da calver em ambos os lados. Tomando cuidado para não danificar a cápsula ótica. Em seguida, complete o isolamento do osso temporal fazendo 2 incisões angulares de 45 graus, começando pela face superior da armação e magnum estendendo-se até o corte coronal no palato duro.

Em seguida, coloque os ossos temporais isolados nas placas de Petri de 35 milímetros contendo HBSS no bloco de gelo e transfira o bloco de gelo para uma capela de dissecção estéril. Em seguida, encha outra placa de Petri de 35 milímetros, desta vez com PBS, e coloque-a no bloco de gelo. Usando duas pinças número 55.

Comece a microdissecção removendo suavemente o córtex, o tronco encefálico e o cerebelo do osso temporal que recobre a cápsula ótica. Em seguida, sem remover a cápsula ótica, lasque partes da cápsula coclear começando na entrada do nervo coclear vestibular e continuando na cápsula ótica. Após a exposição da base da cóclea, puxe suavemente o órgão do corti e os tecidos circundantes.

Em seguida, começando na base, remova qualquer gânglio espiral e estria remanescentes e transfira a cóclea para a placa de Petri preenchida com a primeira pipeta de PBS. 50 microlitros de PBS estéril no centro de um a dois poços de uma placa de cultura de seis poços não revestida. Em seguida, transfira não mais do que 20 axinas e duas cócleas frouxas para cada gota de PBS.

Em seguida, pré-aqueça alíquotas de 50 microlitros de 0,125% de tripsina por cerca de dois minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione a tripsina à cóclea. Tomando cuidado para não sacudir o prato.

Incube a cóclea a 37 graus Celsius por oito minutos. Termine a tripsina adicionando 50 microlitros de inibidor de tripsina de soja a cada gota e, em seguida, adicione mais 50 microlitros de meio cheio após definir uma pipeta P 200 man para 125 microlitros. Use uma ponta de pipeta romba de 300 microlitros para tatuar suavemente as células 80 vezes, tomando cuidado para não criar bolhas.

Depois que cada gota for triturada, adicione mais 200 microlitros de meio completo a cada uma. Bem, agora passe as células por um filtro de células de 40 mícrons para um novo poço. Dentro da mesma placa de seis poços e, em seguida, transfira as células de cada poço para tubos de fax padrão individuais.

Em seguida, adicione 100 microlitros de células do tipo selvagem em cada um dos três tubos, seguido de diluição com 300 microlitros de meio completo apenas para o CUG. Controle diluir 10 microlitros de axônio, duas células LAX Z em 390 microlitros de meio completo. Transfira o axônio restante, duas células Z frouxas, para tubos de fax em OTs de 400 microlitros.

Em seguida, depois de incubar os tubos em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius por 10 minutos, adicione 200 microlitros de CUG diluído a cada tubo de fax apropriado. Em seguida, protegendo todos os tubos da luz, incube as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius por 25 minutos. Para a coloração enquanto as células estão incubando, coloque 10 mililitros de pilhas recém-preparadas mais FBS em um tubo de 15 mililitros e coloque o tubo no gelo.

Em seguida, adicione 1,8 mililitros da solução gelada a cada um dos tubos de fax sob o exaustor estéril com as luzes apagadas para minimizar a exposição à luz. Em seguida, centrifugue as células a 1200 RPM por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets em 300 microlitros de meio cheio.

Agrupar todas as alíquotas para a amostra de selecção e, em seguida, adicionar iodeto de propídio a cada tubo adequado até obter uma concentração final de um micrograma por mililitro. Por fim, depois de cobrir as células, coloque-as novamente no gelo. Configure os portões de classificação coletando primeiro 1000 eventos das células do tipo selvagem não coradas para determinar a distribuição de células no gráfico de dispersão direta versus lateral.

Ajuste os parâmetros de dispersão para frente e para o lado conforme necessário. Em seguida, compense com o tipo selvagem não corado, o tipo selvagem corado com PI e o axônio corado com CUG. Duas células Z LAX.

Encha dois tubos de fax com 500 microlitros de mídia cheia. Em seguida, inicie a análise com o tipo selvagem corado com PI e o axônio dois Lae CUG para excluir detritos com base no gráfico de dispersão direta versus lateral. Exclua dupletos e aglomerados usando o gráfico de altura de dispersão direta versus área de dispersão direta.

Em seguida, exclua as células mortas positivas para PI com base na área de dispersão direta versus o gráfico de cinco áreas PE sci. Para cada posicionamento da marcha, configure um gráfico de área de dispersão para frente versus cascata ou área azul do Pacífico. Analise 10.000 eventos do tubo de amostra de classificação contendo axônio dois, células coradas com PI e CUG frouxas usando todas as portas definidas com as células do tipo selvagem usando gráficos das células do tipo selvagem.

Crie portas para células azuis altas em cascata que sejam menos de 1% do número total de eventos. A cascata Blue High Gates agora deve conter cerca de 15 a 20% das células na amostra frouxa do Axônio dois. Tornando esses axônios duas células altas usando o gráfico de análise de células frouxas do axônio dois agora criam um portão para o mínimo de gripe, 15 a 20% das células usando a estratégia de bloqueio mencionada acima.

Classifique as células nos tubos de fax contendo mídia cheia, mantendo os tubos de coleta em uma câmara resfriada a quatro graus Celsius durante a classificação. Registar o número de células contadas pelo citómetro de fluxo para cada população nestes dois algarismos. As áreas de dispersão lateral versus as áreas de dispersão direta do tipo selvagem dissociado à esquerda e o axônio dois LA Z à direita.

As células cocleares são mostradas. Observe o bloqueio dos grupos distintos de eventos de tamanho muito maior do que os eventos mais próximos do eixo Y designados como população negativa de detritos. Normalmente, 40 a 45% de células livres de detritos são recuperadas do tipo selvagem e da axina duas cócleas LAX Z nesses dois painéis.

A altura de dispersão frontal versus a área de dispersão frontal é usada para excluir dublês dos detritos previamente fechados. Eventos populacionais negativos que se desviam da natureza linear esperada da parcela são excluídos. Essa preparação normalmente produz 71,1%eventos dentro do portão designado. Aqui.

O iodeto de propídio, conforme detectado pelo canal PE SCI de cinco canais, é usado para excluir células mortas, conforme observado nesses gráficos de dispersão. Cerca de 95% das células selecionadas foram viáveis e não absorveram PI PI nesses painéis. O canal azul Cascade foi usado para detectar o substrato fluorescente CUG, como visto na figura à direita.

Em média, as células positivas superiores de aproximadamente 20% CUG são células altas que se correlacionam com cerca de 15.000 axônios, duas células altas por 10 a 12 animais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e isolar células frouxas usando citometria de fluxo de tecidos do ouvido interno para experimentos de Turing celular e experimentos como perfil genético.