Name: Isolando-LacZ expressar Células de tecidos de camundongos Inner Ear usando Citometria de Fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprenda a isolar células LacZ do ouvido interno de camundongos neonatos usando citometria de fluxo. Este método permite analisar perfis de expressão gênica em populações celulares específicas da cóclea.

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Agradecemos a S. Heller, K. Oshima, R. Nusse e Y. Zeng pelas discussões produtivas, e a C. Tang, A. Lee, E. Liaw e à equipe da Stanford Shared FACS Facility pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Howard Hughes Medical Institute Medical Research Training Fellowship, pelo programa Stanford University Medical Scholars (ambos para T.A.J.), pela Stanford University Dean's Fellowship (para R.C.), pela American Otological Society, pela Triological Society, pelo Percy Memorial Award, pelo Akiko Yamazaki and Jerry Yang Faculty Scholar Fund e pelo NIDCD/NIH K08 DC011043 (todos para A.G.C.).

1. Microdissecação da cóclea
<ol>
	<li>Prepare o microscópio de dissecação sob capela, limpando as superfícies com etanol 70% e colocando blocos de gelo.</li>
	<li>Prepare 10-15 placas de Petri de 35 mm em condições estéreis e preencha-as até metade (~2 ml) com solução salina equilibrada de Hank com cálcio (HBSS) estéril.</li>
	<li>Prepare duas placas de Petri de 35 mm em condições estéreis e preencha-as até metade (~2 ml) com solução tampão fosfato 1x estéril (PBS).</li>
	<li>Esterilize a pinça microcirúrgica em tubo cônico Falcon de 50 ml com etanol 70%.</li>
	<li>Em uma sala separada da capela estéril, use tesoura de íris para decapitar 12-15 camundongos repórter Axin2LacZ/+ pós-natais (P) com 0-3 dias de idade e coloque as cabeças em uma placa de Petri de 60 mm sobre um bloco de gelo.</li>
	<li>Usando pinça #5 Dumont e tesoura de íris, remova a mandíbula e a língua e corte a base do crânio ao nível do palato.</li>
	<li>Remova a pele sobrejacente da calvária e seccione a base do crânio inserindo a tesoura na parte inferior do forame magno até o meio do palato.</li>
	<li>Realize outro corte com a tesoura de íris desde a borda cortada do palato até a face superior da calvária em ambos os lados, tomando cuidado para não danificar a cápsula ótica.</li>
	<li>Complete o isolamento do osso temporal realizando dois cortes angulados a 45 graus, começando da face superior do forame magno até o corte coronal no palato duro.</li>
	<li>Coloque os ossos temporais isolados em placas de Petri de 35 mm contendo HBSS sobre bloco de gelo.</li>
	<li>Colete ossos temporais de aproximadamente 12-15 animais sacrificados, totalizando 24-30 ossos temporais.</li>
	<li>Transfira a placa de Petri com os ossos temporais isolados para a capela de dissecação estéril previamente preparada (1.1).</li>
	<li>Transfira quatro ossos temporais para cada placa de Petri de 35 mm previamente preparada contendo HBSS (1.2) e coloque sobre bloco de gelo.</li>
	<li>Inicie a microdissecação usando duas pinças #55 para remover suavemente o córtex, o bulbo e o cerebelo no osso temporal sobrejacente à cápsula ótica.</li>
	<li>Sem remover a cápsula ótica, retire partes da cápsula coclear começando pela entrada do nervo vestibulococlear na cápsula ótica.</li>
	<li>Após expor a base da cóclea, puxe suavemente a cóclea e os tecidos circundantes. Remova qualquer gânglio espiral remanescente e a estria vascular começando pela base.</li>
	<li>Transfira a cóclea para uma placa de Petri de 35 mm contendo PBS sobre bloco de gelo.</li>
	<li>Para viabilidade tecidual ideal, o tempo total de dissecação deve ser inferior a 60 minutos.</li>
	<li>Repita os passos acima para 3-5 camundongos selvagens (WT) P0-P3 como controles para os camundongos Axin2-LacZ.</li>
</ol>
2. Dissociação celular (modificado de métodos previamente descritos)2,10
<ol>
	<li>Coloque 50 μl de PBS estéril no centro de um poço em uma placa de cultura de 6 poços não revestida.</li>
	<li>Transfira até 20 cócleas Axin2LacZ/+ para cada gota de 50 μl de PBS. Uma nova gota de 50 μl de PBS deve ser usada para mais de 20 cócleas.</li>
	<li>Pré-aqueça alíquotas de 50 μl de tripsina a 0,125% por cerca de 2 minutos em banho-maria a 37°C.</li>
	<li>Adicione 50 μl de tripsina pré-aquecida a 0,125% ao PBS contendo as cócleas.</li>
	<li>Coloque a placa de 6 poços a 37°C por 8 minutos, tomando cuidado para não agitar a placa.</li>
	<li>Para interromper a tripsinização, adicione 50 μl de inibidor de tripsina de soja a cada gota de 100 μl.</li>
	<li>Adicione um volume adicional de 50 μl de Meio Completo (MC) (IGF-1, EGF, bFGF, HS, ampicilina em DMEM/F12)2.</li>
	<li>Usando uma ponteira larga de 300 μl e um micropipetador p200 ajustado em 125 μl, pipete suavemente as células 80 vezes, tomando cuidado para não formar bolhas.</li>
	<li>Após a trituração de cada gota, adicione um volume adicional de 200 μl de MC a cada poço.</li>
	<li>Passe as células através de um filtro celular azul Falcon de 40 μm para um novo poço.</li>
	<li>Transfira as células para tubos FACS Falcon padrão (aproximadamente 300 μl permanecem após trituração e filtração).
	<ol class="lalpha">
		<li>Divida as células provenientes de cócleas selvagens em três tubos, diluindo 100 μl com 300 μl de MC em cada tubo. Um tubo será usado como controle em branco, outro será corado apenas com iodeto de propídio (PI, 1 μg/ml) (sem adição nesta etapa), enquanto o último será corado com 3-carboxiumbelil β-D-galactopiranosídeo (CUG, ver 2.15) para detectar fluorescência de fundo.</li>
		<li>Coloque 400 μl de células dissociadas provenientes de cócleas Axin2-LacZ em cada tubo FACS. Como controle com CUG apenas, dilua 10 μl de células em 390 μl de MC (ver tubo F na etapa 2.15). Ajuste o volume dos demais tubos para 400 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Incube as células em incubadora úmida a 37°C por 10 minutos.</li>
	<li>Prepare a solução de CUG:
	<ol class="lalpha">
		<li>Prepare 200 μl de CUG para cada tubo FACS que necessitar coloração.</li>
		<li>Dilua o CUG em MC na proporção de 1:50 em capela escura, com exposição mínima à luz.</li>
		<li>Pré-aqueça o CUG diluído a 37°C por 3 a 5 minutos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Em seguida, adicione 200 μl de CUG diluído a cada tubo FACS apropriado. Para tubos não designados para receber CUG, adicione apenas MC (ver 2.15).</li>
	<li>Neste ponto, devem existir cinco categorias de tubos com os seguintes conteúdos (não adicione PI nesta etapa):
	<ol class="ualpha">
		<li>Selvagem – sem CUG ou PI (para compensação, ver etapa 3.5-6)</li>
		<li>Selvagem – com PI apenas (para compensação)</li>
		<li>Selvagem – com CUG e PI (para controle contra células Axin2-LacZ)</li>
		<li>Axin2-LacZ – com CUG apenas (para compensação)</li>
		<li>Axin2-LacZ – com CUG e PI (para separação celular real)</li>
		<li>Axin2-LacZ – com CUG e PI (para análise de eventos)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proteja todos os tubos da luz e incube-os em incubadora úmida a 37°C por 25 minutos.</li>
	<li>Prepare solução fresca de HEPES + Soro Fetal Bovino (FBS) para interromper a reação após a incubação:
	<ol class="lalpha">
		<li>Dilua 400 μl de FBS recentemente descongelado em 10 ml de HEPES estéril 10 mM (em PBS) em um tubo Falcon de 15 ml.</li>
		<li>Coloque o tubo no gelo até a conclusão da etapa 2.16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Adicione 1,8 ml de solução de HEPES gelada a cada tubo FACS em capela estéril com as luzes apagadas para minimizar a exposição à luz.</li>
	<li>Centrifugue as células a 1200 rpm por 5 minutos.</li>
	<li>Remova o sobrenadante e re-suspenda as células em 300 μl de MC, reunindo todas as alíquotas para a amostra de separação (Axin2-LacZ corada com CUG e PI).</li>
	<li>Adicione PI a cada tubo para atingir uma concentração final de 1 μg/ml.</li>
	<li>Coloque as células no gelo e proteja-as da luz.</li>
</ol>
3. Citometria de Fluxo
<ol>
	<li>Utilizamos um BD Aria II equipado com lasers de 488 nm, 633 nm e 407 nm. A detecção de CUG foi realizada utilizando o laser violeta de 407 nm e a PI utilizando o laser azul de 488 nm na Stanford Shared FACS Facility.</li>
	<li>É necessário um operador treinado de citômetro de fluxo. Prossiga para o próximo passo após aquecer os lasers, calibrar os detectores do citômetro seguindo as instruções do fabricante e definir os parâmetros ideais de separação. Em nossa experiência, verificamos que o uso de um bico de 100 μm otimiza a viabilidade celular para experimentos subsequentes.</li>
	<li>Os seguintes parâmetros foram utilizados: limiar em 5.000 eventos, taxa de fluxo inferior a 3.000 eventos/segundo, dispersão frontal (FSC) em 125 volts e dispersão lateral (SSC) em 250 volts; o canal PE-Cy5 foi usado para PI e o Cascade Blue para CUG.</li>
	<li>Enxágue a câmara do citômetro com etanol 70% e PBS, duas vezes cada, nesta ordem.</li>
	<li>Inicie a análise com células selvagens não coradas (tubo A no Passo 2.15). Colete 1.000 eventos para determinar a distribuição celular no gráfico de FSC versus SSC. Se a dispersão não for desejada, ajuste os parâmetros de FSC e SSC.</li>
	<li>Realize a compensação utilizando células WT não coradas (tubo A), WT coradas com PI (tubo B) e Axin2-LacZ coradas com CUG (tubo D). A compensação permitirá uma discriminação mais precisa dos sinais entre os diferentes comprimentos de onda dos lasers.</li>
	<li>Inicie a análise com células selvagens coradas com PI e CUG (tubo C) e defina os parâmetros de seleção para:
	<ol class="lalpha">
		<li>Exclusão de detritos com base no gráfico de FSC versus SSC.</li>
		<li>Exclusão de dupletos e agregados utilizando o gráfico de FSC-altura versus FSC-área.</li>
		<li>Exclusão de células mortas com base no gráfico de FSC-área versus PE-Cy5-área.</li>
		<li>Configure o gráfico de FSC-área versus Cascade Blue-área com qualquer posicionamento de porta (gate).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Em seguida, analise 10.000 eventos do tubo da amostra de separação que contém células Axin2-LacZ coradas com PI e CUG (tubo F).
	<ol class="lalpha">
		<li>Todas as portas (gates) definidas utilizando células selvagens devem ser aplicadas aqui.</li>
		<li>Utilizando os gráficos das células selvagens, crie portas para células Cascade Blue-alto que representem menos de 1% do número total de eventos.</li>
		<li>Essa mesma porta de Cascade Blue-alto agora abrange aproximadamente 15-20% das células na amostra Axin2-LacZ, identificando-as como células Axin2-alto.</li>
		<li>Utilizando o gráfico de análise das células Axin2-LacZ, crie uma porta para os 15-20% menos fluorogênicos das células, doravante denominadas células Axin2-baixo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Com base na estratégia de seleção acima mencionada, separe as células em tubos FACS contendo 500 μl de FM, um tubo para células Axin2-alto e outro para células Axin2-baixo. Certifique-se de que os tubos de coleta estejam em uma câmara refrigerada a 4°C durante a separação.</li>
	<li>Registre o número de células contadas pelo citômetro de fluxo para cada população.</li>
</ol>
4. Resultados Representativos (ver Figura 2):
Com o protocolo descrito acima, normalmente recuperamos de 40 a 45% de células livres de detritos tanto das cócleas selvagens quanto das Axin2LacZ/+ (Figuras 2A e B), com cerca de 70% delas livres de dupletos (ver Figuras 2A' e B'). A maioria das células classificadas é viável e não incorporou PI (~95%) (Figuras 2A'' e B''). Em média, os ~20% superiores de células positivas para CUG são consideradas células positivas para Axin2-LacZ (Figura 2B''') e correspondem a cerca de 15.000 células com alto nível de Axin2-LacZ por 10 a 12 animais.
A análise de reordenação por citometria de fluxo de células Axin2-alta revelou pureza superior a 93% no canal Cascade Blue. Para confirmar ainda mais a identidade dessas células, realizamos imunomarcação pós-ordenação de células Axin2-alta e Axin2-baixa utilizando anticorpos anti-β-galactosidase, e observamos que as células Axin2-alta continham cerca de 93,4% de células positivas para β-galactosidase (mais de 1.500 células analisadas), enquanto as células Axin2-baixa continham cerca de 4,8% de células positivas para β-galactosidase.
Figuras e Tabelas:
<img alt="Processo de isolamento da cóclea e marcação com LacZ; diagrama de análise por citometria de fluxo." src="/files/ftp_upload/3432/3432fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Paradigma experimental. A figura acima ilustra a estratégia e as técnicas experimentais gerais conforme descritas na seção do protocolo. Cócleas de camundongos selvagens e Axin2LacZ/+ são coletadas e dissociadas em células individuais, que posteriormente são tratadas com CUG, um substrato fluorescente para β-galactosidase. Células com alto e baixo sinal de Axin2-LacZ são então separadas por meio de citometria de fluxo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3432/3432fig1large.jpg">Clique aqui para visualizar uma versão em tamanho ampliado desta imagem.</a>
<img alt="Gráficos de dispersão de citometria de fluxo, selvagem versus Axin2-lacZ, detritos, dupletos, viabilidade, análise de LacZ." src="/files/ftp_upload/3432/3432fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Estratégias de seleção (gating). Esta figura ilustra as estratégias de seleção utilizadas na citometria de fluxo. A) Células selvagens dissociadas que passaram pelo mesmo tratamento que as células Axin2-LacZ são analisadas aqui utilizando um total de 10.000 eventos. O primeiro painel demonstra a área de dispersão lateral (SSC-A) versus a área de dispersão frontal (FSC-A). Aqui, um grupo distinto de eventos apresenta tamanho muito maior do que os eventos mais próximos ao eixo y. Esses eventos são designados como "Negativo para detritos". A próxima seleção, A', analisa as células "Negativas para detritos" do painel A, que correspondem a 43,8% do número total de eventos (ver tabela abaixo). Neste painel, a altura de dispersão frontal (FSC-H) versus FSC-A é utilizada para excluir dupletos. Eventos que se desviam do comportamento linear esperado no gráfico são excluídos. Esta preparação normalmente resulta em cerca de 70% dos eventos dentro da seleção definida, sendo as células restantes excluídas. No painel A'', o iodeto de propídio (PI), detectado pelo canal PE-Cy5, é usado para marcar células mortas (5,3%). No painel seguinte (A'''), o canal Cascade blue é usado para detectar o substrato fluorescente CUG. Neste caso, as seleções LacZ-alto incluem menos de 1% do total de eventos. B) Células dissociadas de camundongos Axin2-LacZ tratadas com CUG e PI são analisadas aqui utilizando um total de 10.000 eventos. As mesmas seleções do painel A são aplicadas. B' mostra que 29,5% das células são excluídas como dupletos, enquanto B'' demonstra que 5,4% não são viáveis. As seleções iniciais para células LacZ-alto e LacZ-baixo são definidas usando o painel B''', com LacZ-alto inicialmente ajustado em 19,7% e LacZ-baixo em 20,4%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3432/3432fig2large.jpg">Clique aqui para visualizar uma versão em tamanho real desta imagem.</a>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>Número de eventos</td>
			<td>Porcentagem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>Análise de tipo selvagem</td>
			<td>10,000</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A'</td>
			<td>Negativo para detritos</td>
			<td>4,381</td>
			<td>43,80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A''</td>
			<td>Negativo para dupletos</td>
			<td>3,116</td>
			<td>71,10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A'''</td>
			<td>Negativo para PI</td>
			<td>2,951</td>
			<td>94,70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-alto</td>
			<td>16</td>
			<td>0,54%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-baixo</td>
			<td>2,790</td>
			<td>94,50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>Análise Axin2-LacZ</td>
			<td>10,000</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B'</td>
			<td>Negativo para detritos</td>
			<td>4,218</td>
			<td>42,2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B''</td>
			<td>Negativo para dupletos</td>
			<td>2,973</td>
			<td>70,50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B'''</td>
			<td>Negativo para PI</td>
			<td>2,813</td>
			<td>94,6%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-alto</td>
			<td>553</td>
			<td>19,70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-baixo</td>
			<td>573</td>
			<td>20,40%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Análises quantitativas das estratégias de seleção apresentadas na Figura 2.

<ol><li>Li, H., Liu, H., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+from+the+adult+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med.%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear.</a> Nat. Med.. 9, 1293-1299 (2003).</li>
<li>Oshima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+distribution+of+stem+cells+in+the+auditory+and+vestibular+organs+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Differential distribution of stem cells in the auditory and vestibular organs of the inner ear.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 18-31 (2007).</li>
<li>Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Jaks, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+marks+cycling%2C+yet+long-lived%2C+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells.</a> Nat. Genet. 40, 1291-1299 (2008).</li>
<li>Kalani, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt-mediated+self-renewal+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Wnt-mediated self-renewal of neural stem/progenitor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16970-16975 (2008).</li>
<li>Willert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+proteins+are+lipid-modified+and+can+act+as+stem+cell+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors.</a> Nature. 423, 448-452 (2003).</li>
<li>Zeng, Y. A., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+proteins+are+self-renewal+factors+for+mammary+stem+cells+and+promote+their+long-term+expansion+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt proteins are self-renewal factors for mammary stem cells and promote their long-term expansion in culture.</a> Cell Stem Cell. 6, 568-577 Forthcoming.</li>
<li>Chai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Expression+of+Lgr5%2C+a+Wnt+Target+Gene%2C+in+the+Developing+and+Mature+Mouse+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Expression of Lgr5, a Wnt Target Gene, in the Developing and Mature Mouse Cochlea.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. , Forthcoming.</li>
<li>Lustig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+loop+of+Wnt+signaling+through+upregulation+of+conductin%2Faxin2+in+colorectal+and+liver+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Negative feedback loop of Wnt signaling through upregulation of conductin/axin2 in colorectal and liver tumors.</a> Mol. Cell Biol. 22, 1184-1193 (2002).</li>
<li>Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2Fprogenitor+cells+derived+from+the+cochlear+sensory+epithelium+give+rise+to+spheres+with+distinct+morphologies+and+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 173-190 (2009).</li>
<li>Savary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+stem%2Fprogenitor+cells+from+a+postnatal+cochlea+respond+to+Jagged1+and+demonstrate+that+notch+signaling+promotes+sphere+formation+and+sensory+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cochlear stem/progenitor cells from a postnatal cochlea respond to Jagged1 and demonstrate that notch signaling promotes sphere formation and sensory potential.</a> Mech. Dev. 125, 674-686 (2008).</li>
<li>White, P. M., Doetzlhofer, A., Lee, Y. S., Groves, A. K., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cochlear+supporting+cells+can+divide+and+trans-differentiate+into+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian cochlear supporting cells can divide and trans-differentiate into hair cells.</a> Nature. 441, 984-987 (2006).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> J. Neurosci. Methods. 164, 271-279 (2007).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

Estudos de pesquisa independentes caracterizaram a capacidade regenerativa limitada nos cócleas neonatais2,10,12,13. Utilizando camundongos com marcador GFP e citometria de fluxo, White e colegas isolaram células de suporte cocleares específicas e descobriram que elas possuem características de células progenitoras12.
Demonstrou-se que a via canônica do Wnt marca populações de células-tronco/progenitoras em múltiplos sistemas orgânicos, incluindo o cérebro, a glândula mam...

<table><tbody><tr><td>placa de Petri, poliestireno, estéril Geriner Bio-one 35 x 10 mm &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-540 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Coador de Células, Estéril, BD Biosciences, azul, 40 &amp;mu;m &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>21008-949 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solução Salina Balanceada (HBSS). Solução com Cálcio, Magnésio e sem Vermelho de Fenol, Estéril &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>45000-456 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga Cellstar, polipropileno, estéreis, Greiner Bio-One, 50 ml &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-346 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga Cellstar, polipropileno, estéreis, Greiner Bio-One, 15 ml &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-278 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento Livre de Soro B-27 (50x), líquido &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N-2 (100x), líquido &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>bFGF, fator de crescimento de fibroblastos básico humano &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1, fator de crescimento semelhante à insulina-1 de camundongo &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8779&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>EGF, fator de crescimento epidérmico humano &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Eagle Modificado&amp;rsquo;s Meio/Ham&amp;rsquo;s F-12 50/50 Mix: 1X, com L-Glutamina e 15 mM HEPES&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>45000-350&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Tubos Cónicos de Fundo Redondo, Descartáveis, de Poliestireno, 12x75&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>60819-295&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,25% (1X) com EDTA 4Na, líquida&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>ep Dualfilter TIPS 300uL, 960 TIPS&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Eppendorf</td><td>22491245&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Tripsina, de Soja, Purificado&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS003570&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon filtros celulares de 40 μm&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>BD Biosciences</td><td>21008-949&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Placas Multipoços, Poliestireno, Greiner Bio-One, Placas não tratadas, 6 poços&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-846&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Detecção de Beta-Galactosidase LacZ para FACS Azul de Gene Marcador&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Tecnologias de Genes Marcadores</td><td>M0255&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolando-lacz expressar células de tecidos de camundongos inner ear usando citometria de fluxo

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

O isolamento de tipos celulares específicos permite analisar populações celulares raras, como células-tronco/progenitoras. Essa abordagem para o estudo dos tecidos da orelha interna apresenta um desafio único devido à escassez de células de interesse e ao pequeno número de modelos de camundongos transgênicos com repórter. Aqui, descrevemos um protocolo que utiliza sondas conjugadas com fluorescência para rotular seletivamente células positivas para LacZ provenientes da cóclea neonatal.
A patologia mais comum subjacente à perda auditiva neurossensorial é o dano irreversível e a perda de células ciliadas sensoriais cocleares, que são necessárias para transduzir ondas sonoras em impulsos neurais. Evidências recentes sugerem que os órgãos auditivo e vestibular de camundongos abrigam células-tronco ou progenitoras que podem ter potencial regenerativo1,2. Essas descobertas justificam investigações adicionais, incluindo a identificação de tipos celulares específicos com características de células-tronco ou progenitoras. Demonstrou-se que a via de sinalização Wnt desempenha um papel crítico na manutenção de populações de células-tronco ou progenitoras em diversos sistemas orgânicos3-7. Recentemente, identificamos células que expressam Axin2 e respondem ao sinal Wnt na cóclea neonatal, mas sua função é amplamente desconhecida8.
Para compreender melhor o comportamento dessas células responsivas à Wnt in vitro, desenvolvemos um método para isolar células que expressam Axin2 de cócleas de camundongos repórter Axin2-LacZ9. Utilizando citometria de fluxo para isolar células Axin2-LacZ positivas de cócleas neonatais, poderíamos então realizar uma variedade de experimentos com células vivas para investigar seu comportamento como células-tronco/progenitoras. Aqui, descrevemos em detalhes os passos para a microdissecação da cóclea neonatal, dissociação desses tecidos, marcação das células LacZ-positivas utilizando um substrato fluorogênico e separação celular. Técnicas para dissociação de cócleas em células individuais e isolamento de células cocleares por citometria de fluxo já foram descritas2,10-12. Realizamos modificações nessas técnicas para estabelecer um protocolo inédito para isolar células que expressam LacZ da cóclea neonatal.

A citometria de fluxo é uma ferramenta poderosa que permite o isolamento e o estudo de populações celulares específicas. Este protocolo descreve os passos para o isolamento de células que expressam LacZ a partir de tecidos cocleares de camundongos transgênicos neonatos. Células cocleares dissociadas foram marcadas usando substratos conjugados com fluoróforo da β-galactosidase antes da separação por citometria de fluxo.

Isolando-LacZ expressar Células de tecidos de camundongos Inner Ear usando Citometria de Fluxo

O isolamento de tipos celulares específicos permite analisar populações celulares raras, tais como células estaminais/progenitoras. Tal abordagem para o estudo de tecidos do ouvido interno...

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar células positivas para LAX Z do cóclea de camundongo neonatal utilizando citometria de fluxo. Isso é alcançado primeiramente isolando um grande número de cócleas de camundongo em um período de tempo relativamente curto, para manter as células viáveis e obter tecido inicial adequado. Como segundo passo, as células positivas para LAX Z são dissociadas e então marcadas para preparar o tecido para separação. As células são então separadas por citometria de fluxo. As populações resultantes de LAX Z alto e lax baixo podem então ser utilizadas para experimentações adicionais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa auditiva, como quais são os perfis genéticos ou populações celulares específicas dentro da orelha interna.Quem demonstrará o procedimento será Taha Gen, um estudante de medicina do nosso laboratório. Primeiro, preencha placas de Petri de 35 milímetros com HBSS e coloque-as sobre um bloco de gelo. Em seguida, após usar tesoura de íris para decapitar de 12 a 15 camundongos eutanasiados, com idade pós-natal de zero a três dias, portadores do repórter axon e camundongos selvagens.Coloque as cabeças em uma placa de Petri de 60 milímetros sobre um bloco de gelo. Em seguida, use pinça número cinco Dumont e tesoura de íris para remover a mandíbula e a língua das cabeças, e depois corte a base do crânio ao nível do palato. Agora, remova a pele sobrejacente do crânio e seccione a base do crânio inserindo a tesoura na parte inferior do forame magno até o meio do palato.Realize outro corte com a tesoura da borda cortada do palato até a região superior do cálcaneo em ambos os lados, tomando cuidado para não danificar a cápsula ótica. Em seguida, finalize o isolamento do osso temporal realizando dois cortes angulados a 45 graus, iniciando na região superior da estrutura e do magno, estendendo-se até o corte coronal no palato duro.Em seguida, coloque os ossos temporais isolados nas placas de Petri de 35 milímetros contendo HBSS sobre o bloco de gelo e transfira o bloco de gelo para uma câmara de dissecação estéril. A seguir, encha outra placa de Petri de 35 milímetros, desta vez com PBS, e coloque-a sobre o bloco de gelo. Usando duas pinças número 55.Inicie a microdiseção removendo suavemente o córtex, o bulbo e o cerebelo do osso temporal que recobre a cápsula ótica. Em seguida, sem remover a cápsula ótica, retire partes da cápsula coclear começando pela entrada do nervo vestibulococlear e continuando em direção à cápsula ótica. Após a exposição da base da cóclea, puxe suavemente o órgão de Corti e os tecidos circundantes.Em seguida, começando pela base, remova qualquer gânglio espiral e estria vascular remanescentes e transfira a cóclea para a placa de Petri contendo PBS. Pipete 50 microlitros de PBS estéril no centro de uma a duas cavidades de uma placa de cultura de seis poços não revestida. Em seguida, transfira no máximo 20 axônios de duas cócleas para cada gota de PBS.A seguir, aqueça previamente alíquotas de 50 microlitros de tripsina 0,125% por cerca de dois minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione a tripsina à cóclea, tomando cuidado para não agitar o recipiente.Incube a cóclea a 37 graus Celsius por oito minutos. Interrompa a tripsinização adicionando 50 microlitros de inibidor de tripsina de soja a cada gota e, em seguida, adicione mais 50 microlitros de meio completo após ajustar uma pipeta P200 para 125 microlitros. Use uma ponteira de pipeta romba de 300 microlitros para pipetar suavemente as células 80 vezes, tomando cuidado para não formar bolhas.Em seguida, após cada gota ter sido triturada, adicione mais 200 microlitros de meio completo a cada uma. Agora, passe as células através de um filtro celular de 40 mícrons para um novo poço. Na mesma placa de seis poços e, em seguida, transfira as células de cada poço para tubos cónicos individuais padrão.Em seguida, adicione 100 microlitros de células selvagens a cada um dos três tubos, seguido pela diluição com 300 microlitros de meio completo apenas para o CUG. Como controle, dilua 10 microlitros de axón, duas células LAX Z, em 390 microlitros de meio completo. Transfira as células axón duas LAX Z restantes para tubos de fax em 400 microlitros de OTs.Em seguida, após incubar os tubos em um incubador umidificado a 37 graus Celsius por 10 minutos, adicione 200 microlitros de CUG diluído a cada tubo fax apropriado. Depois, protegendo todos os tubos da luz, incube as células em um incubador umidificado a 37 graus Celsius por 25 minutos. Para a coloração, enquanto as células estão em incubação, coloque 10 mililitros de heaps recém-preparado mais FBS em um tubo de 15 mililitros e coloque o tubo no gelo.Em seguida, adicione 1,8 mililitro da solução gelada de heap a cada um dos tubos de fax sob a capela estéril com as luzes apagadas para minimizar a exposição à luz. A seguir, centrifugue as células a 1200 RPM durante cinco minutos à temperatura ambiente. Então, remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets em 300 microlitros de meio completo.Reúna todas as alíquotas da amostra para classificação e, em seguida, adicione iodeto de propídio a cada tubo apropriado até atingir uma concentração final de um micrograma por mililitro. Por fim, após cobrir as células novamente, coloque-as no gelo. Configure os limites de classificação coletando inicialmente 1000 eventos das células selvagens não coradas para determinar a distribuição celular no gráfico de dispersão para frente versus dispersão lateral.Ajuste os parâmetros de dispersão para a frente e lateral conforme necessário. Em seguida, faça a compensação com o tipo selvagem não corado, o tipo selvagem corado com PI e o axônio corado com CUG. Duas células LAX Z.Encha dois tubos FACS com 500 microlitros de meio completo. Em seguida, inicie a análise com as células selvagens coradas com PI e as células axon duas coradas com Lae CUG, utilizando o gate para excluir detritos com base no gráfico de dispersão frente versus dispersão lateral. Exclua dupletos e agregados utilizando o gráfico de altura de dispersão frente versus área de dispersão frente.Em seguida, exclua as células mortas positivas para PI com base no gráfico de área de dispersão para frente versus área PE sci cinco. Para cada posição de comporta, configure um gráfico de área de dispersão para frente versus área cascade ou azul Pacífico. Analise 10.000 eventos do tubo de amostra de ordenação contendo células coradas com axon dois laxy PI e CUG utilizando todas as comportas definidas com as células do tipo selvagem, com base nos gráficos obtidos das células do tipo selvagem.Crie portas para as células com alta intensidade de azul em cascata que representem menos de 1% do número total de eventos. As portas de alta intensidade de azul em cascata devem agora conter cerca de 15 a 20% das células na amostra Axon dois laxy. Usando essas células Axon dois positivas, com base no gráfico de análise de células Axon dois laxy, crie agora uma porta para as células com menor fluorescência, abrangendo 15 a 20% das células, utilizando a estratégia de porteamento acima mencionada.Seccione as células nos tubos de fax que contêm meio completo, mantendo os tubos de coleta em uma câmara resfriada a quatro graus Celsius durante a separação. Registre o número de células contadas pelo citômetro de fluxo para cada população nestas duas figuras. As áreas de dispersão lateral versus as áreas de dispersão frontal do tipo selvagem dissociado à esquerda e do axon dois LA Z à direita.As células cocleares são mostradas. Observe o comportamento dos grupos distintos de eventos de tamanho muito maior do que aqueles eventos mais próximos ao eixo Y, designados como população negativa para detritos. Típicamente, de 40 a 45% das células livres de detritos são recuperadas tanto da cóclea de tipo selvagem quanto da axin dois LAX Z nestes dois painéis.A altura do espalhamento para a frente versus a área do espalhamento para a frente é utilizada para excluir dupletos dos detritos previamente selecionados. Eventos de populações negativas que se desviam da natureza linear esperada do gráfico são excluídos. Este preparo normalmente resulta em 71,1% dos eventos dentro do quadrante designado. Aqui.O iodeto de propídio, detectado pelo canal PE SCI de cinco canais, é utilizado para excluir células mortas, conforme observado nestes diagramas de dispersão. Cerca de 95% das células classificadas eram viáveis e não absorveram PI nos painéis apresentados. O canal Cascade blue foi utilizado para detectar o substrato fluorescente CUG, conforme visto na figura à direita.Em média, as células positivas para CUG no topo, cerca de 20%, são células lae altas que correspondem a aproximadamente 15.000 axónios, duas células altas a cada 10 a 12 animais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar e isolar células lae altas utilizando citometria de fluxo a partir de tecidos da orelha interna, tanto para experimentos de Turing celular quanto para experimentos como perfis gênicos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A inflamação desempenha um papel central na patogênese do AVC isquêmico. Evidências crescentes sugerem que ele atua como uma faca de dois gumes que exacerba a lesão cerebral precoce, mas também contribui para o reparo posterior. Este protocolo descreve o isolamento de células imunes do cérebro isquêmico e sua subsequente fenotipagem citométrica de fluxo.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Subconjuntos distintos de células dendríticas existem como populações raras em órgãos linfóides e, portanto, são difíceis de isolar em número e pureza suficientes para experimentos imunológicos. Aqui descrevemos um método de alta eficiência e alto rendimento para isolamento de todos os principais subconjuntos atualmente conhecidos de células dendríticas esplênicas de camundongos.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Há um interesse crescente na caracterização quantitativa de linfócitos intestinais devido ao crescente reconhecimento de que essas células desempenham um papel crítico em uma variedade de doenças intestinais e sistêmicas. Neste protocolo, descrevemos como isolar populações de células únicas de diferentes compartimentos do intestino delgado para posterior caracterização por citometria de fluxo.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

Milhões de pessoas sofrem de doenças degenerativas da retina que resultam em cegueira irreversível. Um elemento comum de muitas dessas doenças é a perda de células ganglionares da retina (RGCs). Este protocolo detalhado descreve o isolamento de RGC murinos primários por seleção positiva e negativa com citometria de fluxo.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

Após a infecção viral, o rim abriga um número relativamente grande de células CD8+ T e oferece uma oportunidade de estudar células TRM não mucosas. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar linfócitos renais de camundongos para análise de citometria de fluxo.

Isolamento das células CD8+ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

Este trabalho descreve um protocolo para quantificação de modificações globais de histonas utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada. O trabalho também contém o protocolo de isolamento da micróglia que foi utilizado para a coleta de dados.

Quantificação de modificações pós-traducionais globais de histona utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada de camundongos

Apresenta-se aqui um eficiente protocolo para o isolamento de células satélites de músculo de membros de camundongos (FACS) adaptado ao estudo da regulação da transcrição em fibras musculares por clivagem sob alvos e liberação utilizando nuclease (CUT&amp;RUN).

Um Protocolo Eficiente para Análise CUT&amp;RUN de Células Satélites de Camundongos Isoladas por FACS

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Para investigar a resposta imune a distúrbios cerebrais, uma abordagem comum é analisar as mudanças nas células imunológicas. Aqui, dois protocolos simples e eficazes são fornecidos para isolar células imunes do tecido cerebral murino e da medula óssea do crânio.

Isolando células imunes do cérebro e crânio de camundongos

Este protocolo detalha o isolamento de populações imunes e não imunes vivas do pulmão de camundongo em estado estacionário e após a infecção por influenza. Ele também fornece estratégias de gating para identificar subconjuntos de células epiteliais e mieloides.

Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo

Aprenda a isolar células LacZ do ouvido interno de camundongos neonatos usando citometria de fluxo. Este método permite analisar perfis de expressão gênica em populações celulares específicas da cóclea.

Isolando-LacZ expressar Células de tecidos de camundongos Inner Ear usando Citometria de Fluxo

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