Quantitativos e automatizada de alto rendimento de todo o genoma Telas de RNAi em C. elegans

O objetivo geral deste procedimento é analisar a função gênica de maneira quantitativa e observar a elegância em uma escala genômica ampla. Isso é realizado inicialmente reduzindo a expressão de cada gene por RNA de interferência, em placas de 96 poços.

Em seguida, realiza-se o teste relevante para a função gênica. Neste exemplo, avalia-se a capacidade da *sea elegance* de responder normalmente à infecção fúngica por meio da análise da expressão de um repórter fluorescente indutível. Então, realiza-se uma análise quantitativa automatizada utilizando o Coss bio sortt. Por fim, a análise de características quantificáveis, como a expressão de um gene repórter fluorescente, revela subconjuntos de genes necessários para modular vias específicas, regendo o desenvolvimento, o comportamento ou a fisiologia.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em diferentes áreas nas quais se observa elegância, como o desenvolvimento, neurobiologia e também as interações entre patógenos e hospedeiros. Tivemos pela primeira vez a ideia para este método quando as primeiras telas em larga escala de RNA para olhos foram publicadas pelo laboratório Oranger. Foi necessário um esforço considerável para desenvolver as ferramentas necessárias e aperfeiçoar a automação.

Eu demonstrarei o procedimento juntamente com Olivia Ti, cientista colaboradora e assistente de pesquisa do laboratório de Jonathan Eubanks. Para preparar 10 a 12 placas de 96 poços, comece preparando 100 mililitros de meio de crescimento para nematoides, ou NGM, em água deionizada. Consulte o protocolo escrito para obter instruções.

Enquanto o meio ainda estiver morno, adicione 100 microgramas por mililitro de ampicilina, 12,5 microgramas por mililitro de tetraciclina, quatro milimolar de IPTG e distribua rapidamente 75 microlitros em cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços. Verifique e remova imediatamente quaisquer bolhas de ar presentes nos poços. Armazene as placas em uma câmara úmida a quatro graus centígrados.

Em seguida, prepare placas de 96 poços profundos adicionando 1,5 mililitro de LB contendo ampicilina e tetraciclina. Adicione a cada poço uma etiqueta única ou código de barras. Cubra cada placa e armazene a quatro graus centígrados se preparada com antecedência, agitando a placa estoque de LB de 96 poços contendo o RNAI.

Clones bacterianos com ampicilina, tetraciclina e glicerol, e distribua três microlitros de cada clone bacteriano para o poço correspondente de uma placa de 96 poços profundos previamente preparada. Utilize poços vazios para controles, cubra as placas de 96 poços profundos com um filme adesivo e incube-as durante a noite a 37 graus centígrados com agitação. Coloque a placa de replicação de 96 poços utilizada a menos 80 graus Celsius na manhã seguinte ao cultivo noturno.

Transfira as placas NGM de 96 poços de quatro graus centígrados para uma cabine de fluxo laminar estéril e deixe-as aquecerem e secarem por cinco a 15 minutos. Em seguida, adicione o rótulo ou código de barras apropriado a cada placa. Retire as placas de cultura de poços profundos de 96 do incubador.

Observe as culturas bacterianas crescidas com sucesso em centrífuga. As placas de 96 poços profundos por cinco minutos a 4.000 RPM. Remova o sobrenadante virando bruscamente a placa de cabeça para baixo e seque rapidamente.

As bordas da placa sobre uma toalha de papel ressuspendem o pellet bacteriano no líquido residual por meio de vortex. Idealmente, utilizando um agitador dedicado para que cada placa receba exatamente o mesmo tratamento. Transfira cinco microlitros das bactérias ressuspensas no meio NGM para placas de 96 poços utilizando uma pipeta multicanal de oito ou 12 canais.

Evite tocar o NGM. Deixe as bactérias secarem sob uma cabine de fluxo laminar estéril por aproximadamente duas horas. Verificando regularmente para evitar que o NGM fique muito seco, incube as placas de 96 poços R-N-A-I-N-G-M a 37 graus centígrados durante a noite em uma câmara úmida.

Consulte o protocolo escrito para preparar uma população sincronizada de vermes após o resfriamento das placas de R-N-A-I-N-G-M de 96 poços à temperatura ambiente. Adicione aproximadamente 100 a 200 vermes em dois microlitros de M nine a cada poço. Verifique se cada poço contém vermes.

As minhocas devem estar nadando. Deixe as placas secarem sob uma cabine de fluxo laminar estéril por um máximo de uma hora. Verifique as placas regularmente.

As minhocas devem estar rastejando em vez de nadando. Coloque as placas em uma câmara úmida a 25 graus centígrados durante a noite. Após selecionar um lote altamente infeccioso de esporos de Judge Miria.

Utilize o tampão M nove para coletar os esporos de uma placa de nove centímetros. Distribua quatro microlitros de esporos para cada poço e verifique cada poço quanto à presença de esporos. Os vermes devem estar nadando.

Deixe as placas secarem sob uma cabine de fluxo laminar estéril por aproximadamente uma hora. Verifique as placas regularmente até que as minhocas comecem a se mover. Em seguida, coloque as placas infectadas em uma câmara úmida a 25 graus centígrados durante a noite.

Verifique os vermes antes da análise observando rapidamente ao microscópio fluorescente o desenvolvimento bem-sucedido e a boa indução de GFP no controle negativo e a redução da fluorescência de GFP nos poços do controle positivo. Se a indução for boa, utilize uma pipeta multicanal de oito ou doze canais para transferir os vermes com 100 microlitros de NaCl 50 milimolar e 0,05% de Triton para uma nova placa de 96 poços com fundo redondo, rotulada ou com código de barras.

Congele as placas a menos 80 graus Celsius até a análise; no dia da análise, descongele as placas congeladas à temperatura ambiente. Após o descongelamento das placas, prossiga para a análise automatizada utilizando o COPA bios.

O equipamento trata a placa poço por poço e analisa os parâmetros de cada verme, como sua fluorescência. Transcreva as informações obtidas do COPA bios sortt em um arquivo Excel para verificação da qualidade dos dados. Em seguida, armazene os dados brutos, incluindo densidade óptica, comprimento axial e emissões fluorescentes, em um pacote limbs para análises quantitativas detalhadas posteriores.

Neste experimento, vermes transgênicos expressaram constitutivamente um repórter P call 12 ds red e um PNLP 29 GFP indutível. Vermes repórter foram expostos a um controle ou ao clone A-G-F-P-R-N-A de RNAi por 48 horas. Os painéis à esquerda mostram vermes não infectados, e os da direita, vermes 18 horas após infecção com D spora.

Quando o fenótipo de interesse é a expressão de um repórter GFP, os poços com o clone de RNAi para GFP fornecem um controle robusto. O COPA bios SORTT gera dados numéricos para cada verme analisado. Esses gráficos mostram a média e o desvio padrão para cada poço de vermes transgênicos.

Expressando constitutivamente um repórter DS vermelho p call 12 e um repórter GFP PNLP 29 indutível após RNAI e infecção com diáspora. O classificador analisa o tempo de voo ou TOF, que corresponde ao tamanho dos vermes, a fluorescência vermelha e a razão entre a fluorescência verde e o TOF. Certos clones provocam defeitos no crescimento e/ou afetam a expressão de P 12 DS vermelho.

Outros afetam especificamente a expressão de FP. Por exemplo, este clone em particular tem como alvo o gene NS Y, anteriormente demonstrado como importante para a regulação de NLP 29. A fluorescência verde e vermelha e o TOF são medidos em unidades arbitrárias, mas constantes.

Uma das inovações deste protocolo é o uso de placas congeladas para postergar sua análise. O congelamento permite que as placas sejam armazenadas por até duas semanas sem alterar substancialmente os resultados, conforme mostrado aqui. Embora os valores absolutos da fluorescência medida possam ser alterados, suas razões relativas permanecem semelhantes.

Quatro vermes portadores dos transgenes PNLP-29 GFP e Pcall-12 dsRed foram infectados ou não com diáspora. Após 18 horas, cada placa foi aproximadamente dividida em duas metades, sendo uma metade analisada imediatamente e a outra congelada a -80 graus Celsius por 24 horas antes do descongelamento. Foram calculados valores médios de tamanho, opacidade e fluorescência verde e vermelha para cada amostra.

O gráfico mostra a razão entre a média de amostras infectadas e não infectadas para as amostras congeladas e vivas apresentadas aqui. A partir de análises duplicadas de uma placa representativa, são obtidas as razões de fluorescência normalizadas para cada poço, que correspondem à média de fluorescência de um poço dividida pela média aparada da placa. Uma vez dominado, este protocolo pode permitir que um grupo de duas a três pessoas realize uma triagem em todo o genoma em dois a três meses.

A execução bem-sucedida deste protocolo exige muito trabalho em equipe. Os membros do meu grupo investiram um esforço enorme para desenvolver um protocolo eficiente e relativamente fácil de realizar.