Name: Quantitativos e automatizada de alto rendimento de todo o genoma Telas de RNAi em C. elegans /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprenda a realizar triagens de RNAi de alto rendimento em C. elegans para identificar genes envolvidos na imunidade antifúngica. Este método automatizado permite análise quantitativa de fenótipos em escala genômica.

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Agradecemos a D. Braendle, CL Kurz e F. Montañana-Sanchis por suas contribuições. Este projecto foi apoiado por doações da ANR e do Conseil Regional PACA e financiamento institucional de INSERM e do CNRS.

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<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
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<li>Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-genome+RNAi+Screen+for+C.+elegans+miRNA+pathway+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes.</a> Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).</li>
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<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li>
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<li>Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPowell%2C+JR+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. Ewbank, J., Vivier, E. 415, Humana Press. 403-427 (2008).</li>
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<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li>
<li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1%2C+an+ortholog+of+human+SARM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li>
<li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li>
<li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li>
<li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20%2FGCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li>
<li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li>
<li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+a+dish%3A+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li>
<li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li>
<li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li>
</ol>

O laboratório Ewbank colabora com União Biometrica e Modul-Bio.

<p class="jove_content"&gt; O protocolo atual permite grande escala de rastreamento em RNAi<em&gt; C. elegans</em&gt; Em meios sólidos, usando o nível de expressão de um gene repórter fluorescente como uma leitura para fora. Tem sido optimizada com instrumentos automatizados para facilitar alto rendimento ensaios, permitindo a manipulação fácil e rápido de grandes números de amostras, de uma maneira eficiente, fiável e reproduzível. Outros métodos têm sido descritos, que não dependa tanto manipulação automatizada da amostra líquida<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Um aspecto chave organizacional para o protocolo tem sido o desenvolvimento de um método robusto de acompanhamento amostra através da adaptação do software MBioLIMS comercial para o procedimento de tela RNAi em colaboração com o ModulBio empresa. Em cada fase do processo, as placas são agora identificados por códigos de barras geradas dentro do LIMS. À medida que o LIMS também regista a identidade dos clones em cada poço em cada placa, indo de bem ao gene putativo é simples. E, além disso, os links LIMS para o banco de dados WormBase comunidade, permitindo o acesso direto aos dados moleculares e funcionais sobre qualquer gene. O LIMS também facilita a análise a ser realizada na placa ou mesmo a nível dos cromossomas e genoma. Para estas análises, os dados são armazenados de uma maneira que é inteiramente compatível com as ferramentas previamente descritos, tais como COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Um ponto crítico experimental no método é o ajustamento da quantidade de alimento em relação ao número de vermes. Para muitos ensaios, é essencial que os vermes não fome no final da experiência, mas também é importante não ter muita comida no início. Observou-se que uma densidade elevada de alimentos diminui a indução de fluorescência no protocolo usando vermes que transportam o p<em&gt; Nlp-29</em&gt; :: Repórter GFP. Isto pode reflectir uma eficiência de infecção diminuída quando os vermes são cultivadas em bactérias demasiado (BS, resultados não publicados). Ao mesmo tempo, as condições de cultura das bactérias RNAi também é importante, uma vez que este determina se ARNdc é produzido a um nível óptimo. Alguns protocolos para grande escala RNAi requerem cultura de RNAi clones em placas de ágar antes de semear culturas líquidas<sup&gt; 8</sup&gt;. Foram obtidos silenciamento do gene robusto omitindo este passo. Optou-se para o crescimento de um excesso de cada cultura para assegurar resultados homogéneos. O protocolo descrito no facto fornece material suficiente para conduzir 2 ou 3 telas em paralelo. No interesse de obter os resultados mais robustos, nós favorecemos, no entanto, a realização de telas em duplicata, utilizando culturas independentes de vermes, bactérias e esporos de fungos de RNAi.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Outro passo crítico está relacionado ao uso de meio que não é nem muito úmido nem muito seco. Se as placas não são suficientemente seca, a bactéria RNAi não seca de forma adequada e vermes nadará durante o ensaio. Isto pode causar problemas. Por exemplo, os vermes não são eficientemente infectado por<em&gt; D. coniospora</em&gt; Em líquido (C. Couillault, resultados não publicados). Por outro lado, em placas secas, a osmolaridade dos aumentos de meio de cultura. Isso tem efeitos diretos sobre a fisiologia verme<sup&gt; 17</sup&gt;, Incluindo a indução de alguns genes de péptidos antimicrobianos, tais como<em&gt; Nlp 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. O volume utilizado para dispensar vermes e esporos é crítico para permitir a secagem eficaz e rápida. Se mais do que 10 uL de líquido é adicionada às placas frescas, os poços pode levar várias horas para secar. Isto pode significar que é difícil de utilizar métodos robóticos para adicionar vermes para as placas. Por exemplo, cada verme é dispensado pelo Biosort em cerca de 1 uL de líquido. Atualmente, distribuir os vermes manualmente, que também nos permite superar a tendência de vermes em solução de sedimentos.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nós anteriormente relatado um ajustamento do Biosort que permitiu uma placa de 96 poços a serem analisados ​​em 36 minutos<sup&gt; 19</sup&gt;. A máquina do fabricante UBI agora oferece uma modificação do Biosort diminuir ainda mais o tempo de análise. Com o &quot;FastReFlex&quot;, as amostras são encaminhadas diretamente através da célula de fluxo para análise, ignorando o filtro bolha armadilha. Isto resulta numa redução significativa no tempo de aquisição de dados; uma placa inteira pode ser analisado em 22 min, permitindo a cerca de 20 placas a ser tratado por dia. Se as placas não foram congeladas, no entanto, não haveria um intervalo de 8 horas entre os primeiros e últimos. Dada a duração relativamente curta do experimento, com a infecção dura apenas 18 horas, isso iria introduzir uma variável inaceitável em placas. Não só as placas de congelação antes da análise resolver este problema, mas também é essencial no contexto de alto rendimento como análises, com o protocolo padrão actual e líquido de tratamento de robôs, 2 pessoas podem facilmente processar um máximo de 50 placas de uma semana. Atualmente, nós rotineiramente tela de 30 placas por semana, o que permite uma tela de genoma inteiroa ser conduzida uma vez em menos de 2 meses.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Uma característica interessante deste protocolo é o facto de que ele usa agar sólido, permitindo que os ensaios que não podem ser realizados em cultura líquida. Como fisiologia verme difere dependendo das condições de cultura<sup&gt; 20,21</sup&gt;, Sendo capaz de realizar ensaios em meio sólido pode também complementar habituais líquido à base de telas. Para certos fenótipos (por exemplo, movimento), a análise pode ser realizada directamente com placas de 96 poços em meio sólido. Para a tela atual, no entanto, como o Biosort não pode provar a partir de placas de meio sólido, worms são primeiro transferidos para líquido antes do congelamento. Por outro lado, o Biosort COPAS permite uma análise quantitativa multiparamétrico compatível com a medição de muitos diferentes fenótipos. É provável que para qualquer determinada tela nem todos os parâmetros medidos será o primário de leitura para fora. No entanto, estas medições podem ser úteis por várias razões. Eles permitem que um para determinar se o ensaio correu correctamente. Por exemplo, pode-se verificar o número e tamanho dos vermes em cada poço. Só quando um clone de RNAi deve bloquear o crescimento ou a reprodução deve haver um desvio dos valores esperados. Wells com menos de 20 vermes e / ou animais 30% menor (TOF) em comparação com um standard controle sem efeito sobre o crescimento (<em&gt; Por exemplo gfp (RNAi</em&gt;)) Pode ser excluída a partir de análises subsequentes. A função destes clones podem ser tratadas utilizando um protocolo alternativo, em que os vermes são expostos às bactérias RNAi após o seu desenvolvimento é bem avançado<sup&gt; 15</sup&gt;. Os parâmetros diferentes podem também ser utilizado para refinar gene candidato (batida) de selecção, por exemplo, limitando acessos apenas para os que afectam a fluorescência verde, mas não vermelho. O método preciso escolhido para a selecção acessos dependerá do tipo de tela e sua exacta de leitura para fora. Dada a complexidade dos dados gerados a partir de uma tela de todo o genoma quantitativa, a colaboração com um estatístico pode ser necessária.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; O protocolo descrevemos pode ser prontamente adaptado a outros tipos de ensaios. Por exemplo, na fase de infecção<em&gt; D. coniospora</em&gt; Poderia ser substituído por qualquer outro agente patogénico capaz de infectar em meios sólidos. Isto é potencialmente útil como nós descobrimos que muitos dos factores de virulência importantes para Serratia marcescens infecção em cultura líquida não desempenham um papel durante a infecção em meio sólido (E. Pradel, comunicação pessoal). O protocolo é também totalmente compatível com os testes de compostos químicos<sup&gt; 22-24</sup&gt;, Ou para identificar compostos com bioactividade usando bibliotecas diferentes de bactérias<sup&gt; 25</sup&gt;, Então deve encontrar uma utilidade geral no<em&gt; C. elegans</em&gt; Comunidade de pesquisa.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> BactoPeptone </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Película adesiva AeraSeal </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropílico β-d-tiogalactopiranósido (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Placa de 96 poço profundo </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de 96 poços plana </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de 96 poços rodada </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> Tetraciclina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECAN robô </td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> União Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitativos e automatizada de alto rendimento de todo o genoma telas de rnai em c. elegans</em

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA de interferência é um poderoso método para compreender a função do gene, especialmente quando conduzida a uma escala do genoma inteiro-e num contexto quantitativa. Em C. elegans, a função do gene pode ser batido para baixo de maneira simples e eficiente pela alimentação de vermes com bactérias que expressam um ARNdc que corresponde a um gene específico 1. Embora a criação de bibliotecas de clones de RNAi cobrindo a maior parte do C. elegans genoma 2,3 abriu o caminho para estudos genômicos funcionais verdadeiros (ver, por exemplo 4-7), a maioria dos métodos estabelecidos são difíceis. Moy e colegas desenvolveram semi-automatizados protocolos que facilitem genome-wide telas 8. A abordagem baseia-se na imagem microscópica e análise de imagem. Descrevemos aqui um protocolo alternativo para um alto rendimento de tela de todo o genoma, com base no manuseamento robótico da bacteriana RNAi clones, a análise quantitativa utilizando o Biosort COPAS (União Biometrica (UBI)), e umasoftware integrado: o MBioLIMS (Laboratório de Sistema de Gestão da Informação da Modul-Bio) uma tecnologia que proporciona maior produtividade para gerenciamento de dados e rastreamento de amostra. O método permite que as telas para ser conduzido em placas de meio sólido. Isto é particularmente importante para alguns estudos, como as que tratam sistema patógeno-hospedeiro interações em C. elegans, uma vez que certos micróbios não infectam eficientemente vermes em meio líquido. Nós mostramos como o método pode ser utilizado para quantificar a importância de genes em anti-fúngica imunidade inata em C. elegans. Neste caso, a abordagem baseia-se na utilização de uma estirpe transgénicos portadores uma infecção epidérmica induzível-gene repórter fluorescente, com GFP sob o controlo do promotor do gene antimicrobiana péptido nlp 29 e um repórter vermelho fluorescente que é expressa constitutivamente na epiderme. Este último apresenta um controlo interno para a integridade funcional da epidermee transgene não específica silenciamento 9. Quando vermes de controlo são infectadas pelo fungo que fluorescem verde. Derrubar por RNAi um gene necessário para a PNL 29 resultados de expressão em fluorescência reduzida após a infecção. Actualmente, este protocolo permite que mais de 3.000 clones RNAi a ser testado e analisados ​​por semana, abrindo a possibilidade de peneiramento todo o genoma, em menos de 2 meses.

Nós descrevemos um protocolo com<em&gt; C. elegans</em&gt; E bibliotecas de alimentação RNAi que permite a medição automatizada de vários parâmetros, tais como fluorescência, tamanho e opacidade de vermes individuais de uma população. Nós dar um exemplo de um ecrã para identificar genes envolvidos na imunidade anti-fúngica inato em<em&gt; C. elegans</em&gt;.

Quantitativos e automatizada de alto rendimento de todo o genoma Telas de RNAi em C. elegans</em

A interferência de RNA é um método poderoso para compreender a função gênica, especialmente quando realizada em escala de genoma completo e em um contexto quantitativo. Em C. ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar a função gênica de maneira quantitativa e observar a elegância em uma escala genômica ampla. Isso é realizado inicialmente reduzindo a expressão de cada gene por RNA de interferência, em placas de 96 poços.Em seguida, realiza-se o teste relevante para a função gênica. Neste exemplo, avalia-se a capacidade da *sea elegance* de responder normalmente à infecção fúngica por meio da análise da expressão de um repórter fluorescente indutível. Então, realiza-se uma análise quantitativa automatizada utilizando o Coss bio sortt. Por fim, a análise de características quantificáveis, como a expressão de um gene repórter fluorescente, revela subconjuntos de genes necessários para modular vias específicas, regendo o desenvolvimento, o comportamento ou a fisiologia.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em diferentes áreas nas quais se observa elegância, como o desenvolvimento, neurobiologia e também as interações entre patógenos e hospedeiros. Tivemos pela primeira vez a ideia para este método quando as primeiras telas em larga escala de RNA para olhos foram publicadas pelo laboratório Oranger. Foi necessário um esforço considerável para desenvolver as ferramentas necessárias e aperfeiçoar a automação.Eu demonstrarei o procedimento juntamente com Olivia Ti, cientista colaboradora e assistente de pesquisa do laboratório de Jonathan Eubanks. Para preparar 10 a 12 placas de 96 poços, comece preparando 100 mililitros de meio de crescimento para nematoides, ou NGM, em água deionizada. Consulte o protocolo escrito para obter instruções.Enquanto o meio ainda estiver morno, adicione 100 microgramas por mililitro de ampicilina, 12,5 microgramas por mililitro de tetraciclina, quatro milimolar de IPTG e distribua rapidamente 75 microlitros em cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços. Verifique e remova imediatamente quaisquer bolhas de ar presentes nos poços. Armazene as placas em uma câmara úmida a quatro graus centígrados.Em seguida, prepare placas de 96 poços profundos adicionando 1,5 mililitro de LB contendo ampicilina e tetraciclina. Adicione a cada poço uma etiqueta única ou código de barras. Cubra cada placa e armazene a quatro graus centígrados se preparada com antecedência, agitando a placa estoque de LB de 96 poços contendo o RNAI.Clones bacterianos com ampicilina, tetraciclina e glicerol, e distribua três microlitros de cada clone bacteriano para o poço correspondente de uma placa de 96 poços profundos previamente preparada. Utilize poços vazios para controles, cubra as placas de 96 poços profundos com um filme adesivo e incube-as durante a noite a 37 graus centígrados com agitação. Coloque a placa de replicação de 96 poços utilizada a menos 80 graus Celsius na manhã seguinte ao cultivo noturno.Transfira as placas NGM de 96 poços de quatro graus centígrados para uma cabine de fluxo laminar estéril e deixe-as aquecerem e secarem por cinco a 15 minutos. Em seguida, adicione o rótulo ou código de barras apropriado a cada placa. Retire as placas de cultura de poços profundos de 96 do incubador.Observe as culturas bacterianas crescidas com sucesso em centrífuga. As placas de 96 poços profundos por cinco minutos a 4.000 RPM. Remova o sobrenadante virando bruscamente a placa de cabeça para baixo e seque rapidamente.As bordas da placa sobre uma toalha de papel ressuspendem o pellet bacteriano no líquido residual por meio de vortex. Idealmente, utilizando um agitador dedicado para que cada placa receba exatamente o mesmo tratamento. Transfira cinco microlitros das bactérias ressuspensas no meio NGM para placas de 96 poços utilizando uma pipeta multicanal de oito ou 12 canais.Evite tocar o NGM. Deixe as bactérias secarem sob uma cabine de fluxo laminar estéril por aproximadamente duas horas. Verificando regularmente para evitar que o NGM fique muito seco, incube as placas de 96 poços R-N-A-I-N-G-M a 37 graus centígrados durante a noite em uma câmara úmida.Consulte o protocolo escrito para preparar uma população sincronizada de vermes após o resfriamento das placas de R-N-A-I-N-G-M de 96 poços à temperatura ambiente. Adicione aproximadamente 100 a 200 vermes em dois microlitros de M nine a cada poço. Verifique se cada poço contém vermes.As minhocas devem estar nadando. Deixe as placas secarem sob uma cabine de fluxo laminar estéril por um máximo de uma hora. Verifique as placas regularmente.As minhocas devem estar rastejando em vez de nadando. Coloque as placas em uma câmara úmida a 25 graus centígrados durante a noite. Após selecionar um lote altamente infeccioso de esporos de Judge Miria.Utilize o tampão M nove para coletar os esporos de uma placa de nove centímetros. Distribua quatro microlitros de esporos para cada poço e verifique cada poço quanto à presença de esporos. Os vermes devem estar nadando.Deixe as placas secarem sob uma cabine de fluxo laminar estéril por aproximadamente uma hora. Verifique as placas regularmente até que as minhocas comecem a se mover. Em seguida, coloque as placas infectadas em uma câmara úmida a 25 graus centígrados durante a noite.Verifique os vermes antes da análise observando rapidamente ao microscópio fluorescente o desenvolvimento bem-sucedido e a boa indução de GFP no controle negativo e a redução da fluorescência de GFP nos poços do controle positivo. Se a indução for boa, utilize uma pipeta multicanal de oito ou doze canais para transferir os vermes com 100 microlitros de NaCl 50 milimolar e 0,05% de Triton para uma nova placa de 96 poços com fundo redondo, rotulada ou com código de barras.Congele as placas a menos 80 graus Celsius até a análise; no dia da análise, descongele as placas congeladas à temperatura ambiente. Após o descongelamento das placas, prossiga para a análise automatizada utilizando o COPA bios.O equipamento trata a placa poço por poço e analisa os parâmetros de cada verme, como sua fluorescência. Transcreva as informações obtidas do COPA bios sortt em um arquivo Excel para verificação da qualidade dos dados. Em seguida, armazene os dados brutos, incluindo densidade óptica, comprimento axial e emissões fluorescentes, em um pacote limbs para análises quantitativas detalhadas posteriores.Neste experimento, vermes transgênicos expressaram constitutivamente um repórter P call 12 ds red e um PNLP 29 GFP indutível. Vermes repórter foram expostos a um controle ou ao clone A-G-F-P-R-N-A de RNAi por 48 horas. Os painéis à esquerda mostram vermes não infectados, e os da direita, vermes 18 horas após infecção com D spora.Quando o fenótipo de interesse é a expressão de um repórter GFP, os poços com o clone de RNAi para GFP fornecem um controle robusto. O COPA bios SORTT gera dados numéricos para cada verme analisado. Esses gráficos mostram a média e o desvio padrão para cada poço de vermes transgênicos.Expressando constitutivamente um repórter DS vermelho p call 12 e um repórter GFP PNLP 29 indutível após RNAI e infecção com diáspora. O classificador analisa o tempo de voo ou TOF, que corresponde ao tamanho dos vermes, a fluorescência vermelha e a razão entre a fluorescência verde e o TOF. Certos clones provocam defeitos no crescimento e/ou afetam a expressão de P 12 DS vermelho.Outros afetam especificamente a expressão de FP. Por exemplo, este clone em particular tem como alvo o gene NS Y, anteriormente demonstrado como importante para a regulação de NLP 29. A fluorescência verde e vermelha e o TOF são medidos em unidades arbitrárias, mas constantes.Uma das inovações deste protocolo é o uso de placas congeladas para postergar sua análise. O congelamento permite que as placas sejam armazenadas por até duas semanas sem alterar substancialmente os resultados, conforme mostrado aqui. Embora os valores absolutos da fluorescência medida possam ser alterados, suas razões relativas permanecem semelhantes.Quatro vermes portadores dos transgenes PNLP-29 GFP e Pcall-12 dsRed foram infectados ou não com diáspora. Após 18 horas, cada placa foi aproximadamente dividida em duas metades, sendo uma metade analisada imediatamente e a outra congelada a -80 graus Celsius por 24 horas antes do descongelamento. Foram calculados valores médios de tamanho, opacidade e fluorescência verde e vermelha para cada amostra.O gráfico mostra a razão entre a média de amostras infectadas e não infectadas para as amostras congeladas e vivas apresentadas aqui. A partir de análises duplicadas de uma placa representativa, são obtidas as razões de fluorescência normalizadas para cada poço, que correspondem à média de fluorescência de um poço dividida pela média aparada da placa. Uma vez dominado, este protocolo pode permitir que um grupo de duas a três pessoas realize uma triagem em todo o genoma em dois a três meses.A execução bem-sucedida deste protocolo exige muito trabalho em equipe. Os membros do meu grupo investiram um esforço enorme para desenvolver um protocolo eficiente e relativamente fácil de realizar.

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