Name: Screening alto teor em Doenças Neurodegenerativas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Aprenda ensaios de alto conteúdo para quantificar vias afetadas em doenças neurodegenerativas usando células SH-SY5Y e imagem automatizada. Este método acelera a identificação de alvos terapêuticos.

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Agradecemos aos programadores Hamilton e especialistas para o apoio contínuo e Blaas Eva para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por duas bolsas de Investimento NWO (911-07-031 e 40-00506-98-10011), The Prinses Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 eo Neuroscience Campus Amsterdam; SJ é suportado por Ti-Pharma: T5-207.

1. Processo de cultura de células aderentes automatizado (Figura 1) 20 <ol><li> Preparar o sistema de cultura de células automatizado para a entrada das placas de cultura de células. Consumíveis de carga (por exemplo, pontas de pipeta, placas de cultura celular, placas de ensaio) para o sistema utilizando a interface gráfica do usuário (GUI). Garantir que há meios de cultura de células suficiente, tampão fosfato salino (PBS) e tripsina no sistema robótico. </li><li> Propagar manualmente duas placas omnitray com 2 x 10 6 células por placa, da linhagem de células SH-SY5Y neuroblastoma. Manter as células em Opti-MEM com 10% de soro fetal bovino (FBS). Coloque as placas em cultura de células do robô usando o GUI. As células serão incubadas a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Escolha qual célula protocolo de cultura precisa ser iniciado 20. Pode-se escolher a partir de um processo de cultura de células aderentes 22, cultivo e expansão do tronco embrionárias (ES) células em células de camundongo alimentador 23 ou cultura de suspensão cells 22. </li><li> Selecione o protocolo de cultura de células aderentes (Figura 1) e garantir a aderência de células line arquivos de parâmetros específicos são ajustados para que o limite de confluência (a área da placa omnitray que contém células) é fixado em 70%. Definir o tempo de tripsinização total para dois minutos. </li><li> Instruir o robô a preparar pratos omnitray novo, com um número de celular semeadura de 2 x 10 6 células por placa. </li><li> Placas de entrada omnitray no sistema de cultura celular utilizando o protocolo automatizado cultura de células aderentes (Figura 1). Este protocolo envolve as seguintes etapas: as placas são incubadas e fotografada até atingirem o limite de confluência pré-definidos. Se as células não atingir o limiar confluência dentro de 5 leituras, as placas são removidas do sistema. Ao chegar à confluência limiar definido pelo usuário, as células são lavadas, tripsinizados e contadas. Um número pré-definido de células são adicionados às placas omnitray novo e se houver um número suficiente de células, um numb especificadoer de placas de ensaio são transportados para o convés e um número definido de células dispensada em cada poço. Placas de ensaio pode ser diretamente fotografada usando o microscópio integrados ou saída do sistema para processamento posterior. </li><li> Instruir o sistema para preparar 4 placas de ensaio por placa omnitray, com um total de 5.000 células por poço. </li></ol> 2. shRNA produção de vírus e revestimento em chapas de ensaio (Tempo necessário: 6 dias) <ol><li> Crescer stocks glicerol bacteriana contendo os vetores shRNA (Open Biosystems, TRC1) durante a noite em 2ml de mídia Luria-Bertani meio contendo 100 mg / ml de ampicilina (Sigma-Aldrich). </li><li> Extrato de plasmídeos seguindo o protocolo do fabricante (Promega Assistente MagneSil TFX). </li><li> Produzir vírus usando o RNAi Consórcio de Produção de Alto Throughput Lentivirus (96 placa bem) o protocolo 24. Trabalhando com lentivírus é relativamente seguro, pois as partículas do vírus utilizado para a transdução de replicação são deficientes e split-estratégias de embalagem gene são usados ​​para a sua produção. No entanto, quando se trabalha com lentivírus, procedimentos adicionais de biossegurança são necessárias para minimizar o risco para si mesmo e os outros 25. Todos os experimentos devem ser realizados em um laboratório de nível MLII ou BSL2 segurança. Todos os plásticos (pipetas, pratos de plástico, mídia) que tenham estado em contacto com partículas de lentivírus devem ser incubadas com água sanitária por 24 horas antes da eliminação. </li><li> Calcular a multiplicidade de infecção (MOI) do lentivírus por determinação da percentagem de células GFP positivas usando o GFP pLKO.1 plasmídeo (Sigma-Aldrich). </li><li> Lentivírus placa em placas de ensaio, com uma MOI de 3. </li></ol> 3. Transdução lentiviral e diferenciação neuronal de células SH-SY5Y (Tempo necessário: 6 dias) <ol><li> Células são adicionados às placas de ensaio (ver passo 1.7). Carregar placas de ensaio contendo lentivirus shRNA no sistema automatizado de cultura de células. </li><li> Após 24 horas, os meios de comunicação sobre oplacas de ensaio será alterado para Opti-MEM contendo 0,5% de SFB e 0,1 mM de ácido retinóico para iniciar o processo de diferenciação. Diferenciação de células SH-SY5Y permite a visualização de estruturas neuríticas e sincroniza a divisão celular. </li><li> Continue a incubação das placas de ensaio na mídia diferenciação por 5 dias. Isso garante knockdown máxima da expressão do gene alvo. </li><li> No dia 5, adicionar 50 mM H 2 O 2 a metade das placas de ensaio por 24 horas para estimular a translocação de DJ1 para as mitocôndrias. </li><li> No dia 6, adicione CmxROS Mitotracker (Invitrogen) para as células, a uma concentração final de 200 nM por poço e incubar a 37 ° C por 30 minutos. </li><li> Pode-se instruir o sistema para placas de imagem diretamente usando o gerador de imagens HC ou placas podem ser exportados a partir do sistema para processamento posterior. </li></ol> 4. Imunocoloração automatizada de placas de ensaio (Tempo necessário: 2 dias) Qualidade da imagem é paramount para a realização de uma HCS sensível e confiável. Danos à monocamada celular devido à pipetagem imprecisa pode levar à má qualidade de imagem e os resultados irreproduzíveis. A fim de minimizar os danos camada de células, a imunocoloração foi realizado usando uma estação robótica. O procedimento é similar ao que foi descrito anteriormente 26, mas foi customizado para aumentar o rendimento e reduzir o uso de consumíveis. <ol><li> Fix células com 100 l de paraformaldeído 4% pré-aquecido a 37 ° C. Incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células com 200 mL de PBS por 5 minutos, 3 vezes. </li><li> Incubar as placas de ensaio com 200 mL de PBS contendo Triton 0,1% (PBST) por 10 minutos. </li><li> Lavar as células com 200 mL de PBS por 5 minutos, 3 vezes. </li><li> Incubar as placas de ensaio com 200 mL de buffer do bloco (PBST com 5% de FBS) por 1 hora em temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células com 200 mL de PBS por 5 minutos, 3 vezes. </li><li> Incube com o exerdevido anticorpos primários durante a noite a 4 ° C: <ol><li> Cabra DJ1 N20 (Santa Cruz, 5 mg / ml) </li><li> Tubulina coelho β-III (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) </li></ol></li><li> No dia seguinte, lave as células com 200 mL de PBS por 5 minutos, 3 vezes. </li><li> Incubar as placas de ensaio com os seguintes anticorpos secundários 1 hora em temperatura ambiente: <ol><li> AlexaFluor burro anti-cabra 488 (Invitrogen, 2 mg / ml) </li><li> AlexaFluor cabra 647 anti-coelho (Invitrogen, 2 mg / ml </li></ol></li><li> Lavar as células com 200 mL de PBS por 5 minutos, 3 vezes. </li><li> Células incube com Hoechst (Invitrogen, 1 mg / ml) por 10 minutos. </li><li> Lavar as células com 200 mL PBS por 5 minutos, 3 vezes. </li><li> Placas armazenar a 4 ° C até que possam ser trabalhada. </li></ol> 5. Alto teor de análise de imagem e de aquisição de imagem (Tempo requerido: 5 dias) <ol><li> Imagem um total de 30 campos por bem usar a lente objetiva de 20x. Visualize DJ1 com o FITC conjunto de filtros, a mitocôndria com o conjunto TRITC filtro, β-tubulina III com o conjunto Cy5 filtro e os núcleos usando o conjunto de filtro UV (Figura 3). </li><li> Analisar as imagens usando o Bioapplication Análise compartimental (Cellomics, ThermoFisher) para determinar a intensidade média do sinal Mitotracker dentro da mitocôndria. (Figura 4B, F). </li><li> Para determinar o coeficiente médio de sobreposição entre DJ1 e as mitocôndrias, analisar as imagens usando o bioapplication Colocalisation Cellomics (Cellomics, ThermoFisher). Definir regiões de interesse (ROI) da seguinte forma: ROI A - núcleo (Figura 4A, E), ROI B - mitocôndria (Figura 4 B, F). A partir de excluir ROI ROI B para garantir a análise de apenas o citoplasma. Definir as mitocôndrias como região alvo I e DJ1 como alvo região II (Figura 4C, G). </li><li> Analisar as imagens usando o bioapplication Profiling Neuronal (Cellomics, Thermofisher) para rastrear os comprimentos médios das neurites da coloração tubulina β-III (Figura4D, H). </li><li> Placas de imagem usando o Opera LX automático confocal leitor (Perkin-Elmer). Imagem um total de 30 campos por bem usar a lente objetiva 60x com imersão em água. Visualize mitocôndrias com o laser 561 nM e núcleos com excitação UV. </li><li> Analisar as imagens usando o ponto-Edge-Ridge (SER) algoritmo características de textura. O filtro SER-Ridge transmite intensidade em pixels formando cume-como testes padrões. Quanto mais fragmentada a mitocôndria, quanto maior a pontuação do SER-Ridge (Figura 8). </li></ol> 6. Normalização de dados e análise <ol><li> Importar os dados do software de análise de imagem no pacote BioConductor CellHTS2 para o ambiente de software R (R versão 2.11.1, versão BioConductor 2.6). </li><li> Logaritmo base (2) transformar os dados antes de por a placa normalização mediana base 27, 28. Não aplicar o ajuste variância por placa. </li><li> Para identificar modificadores de um fenótipo, use uma ANOVA de duas vias entre o diferetratamento nt grupos ou seja, as células infectadas sem tratamento Scrambled vs mexidos células toxina tratada versus células-alvo gene não tratada versus células-alvo gene tratados (Figuras 5-7). </li></ol> 7. Resultados representativos Mutações dentro DJ1 dar origem ao início-início recessive parkinsonismo 21, mas não está claro como a perda de DJ1 dá origem ao fenótipo da doença. Sabe-se que as células deficiente de DJ1 são mais suscetíveis à morte celular induzida pelo estresse oxidativo e na resposta ao estresse oxidativo, DJ1 transloca do citoplasma para a mitocôndria 29, 30. Através da construção de ensaios HC para monitorar esses fenótipos, podemos identificar genes que regulam fenótipos ou afetar associados DJ1. Essa abordagem pode ajudar a decifrar os caminhos em que DJ1 funções e que poderiam estar envolvidos na patogênese da doença. Exemplo de uma interação com epistasia DJ1 (Figura 5): Knockdown de DJ1 em células expostasaos resultados da toxina em uma maior perda de viabilidade celular (BAR-B: image-B) em comparação com as células infectadas com lentivirus mexidos (BAR-A: image-A). Knockdown do gene-alvo A tem um efeito similar ao observado em células com um knockdown DJ1 (BAR-C: image-C). Knockdown de ambos DJ1 e gene-alvo A resulta em uma perda significativamente maior de viabilidade celular do que a perda de qualquer gene sozinho (BAR-D: image-D). Isso sugere uma interação entre epistáticos DJ1 e alvo gene A. Exemplo de um gene regulador DJ1 translocação (Figura 6): Quando as células são expostas a uma toxina, DJ1 transloca do citoplasma para a mitocôndria, que é quantificada por um coeficiente maior sobreposição entre DJ1 e as mitocôndrias (BAR-A: Uma imagem em relação BAR-C: image C). Nas células onde B gene-alvo tem sido silenciada, menos DJ1 transloca para as mitocôndrias, quando as células são expostas à toxina. Isto sugere que B gene-alvo está envolvida no transporte de DJ1 para as mitocôndrias. (BAR-B: imagem B e BAR-D: D imagem) Exemplo de um gene envolvido na conseqüência neuronal (Figura 7): Knockdown do gene C-alvo no tipo selvagem resultados SH-SY5Y células em um aumento significativo no comprimento neurite (BAR-B: image-B) em comparação com as células infectadas com lentivirus expressar scrambled shRNA (BAR-A: Uma imagem). Este efeito é perdido em células incubadas com a toxina (BAR-C e D). Exemplo de um gene envolvido na morfologia mitocondrial (Figura 8): Infecção do tipo selvagem SH-SY5Y células com shRNA visando resultados gene D em uma diminuição no valor segmentação mitocondrial SER-Ridge (Figura 8, Imagem C e D) quando comparado com células infectadas com lentivirus mexidos (Figura 8, Image A e B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig1_lg.jpg"><img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1."></a> Figura 1 Esboço de protocolo automatizado de cultura de células.: ntent "&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig2_lg.jpg"><img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2."></a> Figura 2 Visão esquemática do processo de seleção, análise de imagem e métodos estatísticos utilizados durante o processo de triagem:. I) As células são cultivadas até que sejam confluentes e, posteriormente, banhado nas placas de ensaio contendo o shRNA lentivírus. As células são diferenciadas por 5 dias e toxina é então adicionado as placas por 24 horas. Placas de ensaio estão de saída do sistema e histoquímica. A quantidade de tempo necessário para cada um dos processos está indicado entre parênteses. ii) Os dados são adquiridos utilizando um gerador de imagens HC (a viabilidade celular, a translocação de proteínas e crescimento neuronal) e um sensor de imagem confocal automatizado (morfologia mitocondrial). Os dados são exportados para o pacote dentro CellHTS2 R, base (2) log transformados e normalizados. Two-way ANOVA é usado para identificar interações significativas entre as diferentes variáveis. Figura 3. Composite imagens de células adquiridas pela HC imagem. A) As células não tratadas, B) As células tratadas com H 2 O 2. DJ1 é rotulada de verde, as mitocôndrias em vermelho e os núcleos em azul. Neuritos coloração não é destacada. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4."> Figura 4. Quantificação de várias características celulares obtidos de uma HCS. AD) não tratada SH-SY5Y células. EH) H 2 O 2 tratados SH-SY5Y células. A, E segmentação Núcleos) e definição de ROI A, B, F) Identificação e quantificação das mitocôndrias, ROI B, C, G) Identificação de DJ1, Target canal II; D, G) Identificação e cálculo de comprimento neurite média. Células perto da borda da imagem são excluídos da análise. Inset imagens são imagens antes da análise. <imgalt src='"/' files></imgalt> Figura 5. Identificação de um gene em epistasia com DJ1 (letras nas barras correspondem às letras na imagem). Imagens de A a D são SH-SY5Y células marcadas com Mitotracker CMXRos (vermelho) que foi usado para quantificação de células de saúde. <img alt="Figura 6." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 6."> Figura 6. Identificação de um gene regulador DJ1 translocação (letras nas barras correspondem às letras na imagem). Imagens de A a D são SH-SY5Y células marcadas para DJ1 (verde), mitocôndrias (vermelho) e núcleos (azul) que foram utilizados para quantificação de DJ1 translocação para a mitocôndria. <img alt="Figura 7." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig7.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 7."> Figura 7. Identificação de um gene envolvido na conseqüência neuronal (letras nas barras correspondem às letras na imagem). Imagens de A a D são SH-SY5Y células marcadas para a β-tubulina III (verde) e núcleos (azul) que foram utilizadas para a quantificação de comprimento neurite. <img alt="Figura 8." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig8.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 8."> Figura 8. Identificação de um gene envolvido na regulação da morfologia mitocondrial. Uma imagem e C são imagens compostas de SH-SY5Y células infectadas com shRNA mexidos ou um shRNA alvo gene D, respectivamente. Mitocôndrias são coloridas em vermelho, enquanto os núcleos são coloridos em azul. Imagem B e D são visualizações da quantificação SER-Ridge.

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Não temos nada a divulgar

Com os custos decrescentes de HT / HC sistemas de rastreamento de celular, combinado com a disponibilidade de poderosos genome-wide ferramentas para modificar a função do gene, HT / HC telas estão se tornando comuns na academia. A abordagem já foi aplicado com sucesso em diversas áreas de pesquisa, como a identificação de alvos terapêuticos no câncer 9, 31-33 e 34-36 desenvolvimento embrionário e ainda tem potencial para aplicação em decifrar os caminhos envolvidos em distúrbios neuropsiquiátricos 37,38. No entanto a implementação de tal sistema exige um investimento significativo de tempo e esforço com otimização de processos, muitas vezes tendo um mínimo de 6 meses. Todas as etapas, tais como tripsinização vezes, velocidades e densidades de semeadura pipetagem tem que ser ajustado, para garantir que as células são saudáveis ​​e crescem de forma consistente. Prevenção da contaminação bacteriana é um dos desafios mais difíceis enfrentados cultura de células automatizado semanalmente com os protocolos de limpeza em combination com a constante lavagem de todas as linhas de rolamento líquido com etanol 70% é necessário para a cultura livre de contaminação. Será igualmente necessário melhorar a robótica de forma que instrumentos adicionais, como microscópios confocal de alta resolução e -80 ° C freezers para armazenamento de composto pode ser integrado. Há também limitações que precisam ser tratadas para melhorar a velocidade, sensível e utilidade deste método para estudar redes de gene e identificar genes envolvidos em vias patogênicas molecular. Para conduzir uma tela HT / HC e assegurar que dados confiáveis ​​são coletados, vários aspectos precisam ser otimizados. Primeiro, a confiabilidade da medição é primordial e é dependente da robustez e da sensibilidade do ensaio. Por exemplo, os ensaios acima descritos são adequados para telas menores, mas são difíceis de implementar em uma escala genoma de largura, devido ao número de passos de processamento necessária antes da aquisição da imagem.Assim, seria necessário construir linhas celulares estáveis ​​expressando o gene repórter, o que permitiria a imagem direta e levar a variação diminuiu devido ao número reduzido de etapas de processamento. No presente, projetando um ensaio que retrata com precisão e confiabilidade quantifica um fenótipo de interesse é o principal entrave para o processo de triagem HC. Muitas telas são realizados em células de mamíferos utilizando diferentes bibliotecas RNAi, que sofrem de efeitos fora do alvo, eficiência limitada silenciamento de genes do genoma e cobertura incompleta. Thus bibliotecas precisam ser feitas, que são mais específicos, potentes e têm uma melhor cobertura. Estão em curso esforços para criar tal espera-se tais empreendimentos irão melhorar a reprodutibilidade de HT / HC scre<html> en hits. A limitação de muitas telas de grande escala à base de células é que eles são realizados em células de neuroblastoma, porque eles podem ser manipulados geneticamente e cultivadas para grandes números com relativa facilidade. No entanto, a relevância dos &#39;hits&#39; identificadas na ex vivo modelos de cultura de células para função in vivo é questionável, especialmente porque o cérebro é composto de tipos de células altamente especializadas que formam uma rede densa e complicada de conexões sinápticas funcionar como uma unidade altamente integrado. Como conseqüência, é comum que atinge identificados utilizando a abordagem de triagem descrito acima, são validados em telas secundárias usando técnicas adicionais e mais fisiológico modelos relevantes 39. Para melhorar a tradução de visitas identificadas durante HCS, os modelos mais representativo e sofisticadas, tais como pilhas e células-tronco diferenciadas ou co-cultura sistemas precisam ser desenvolvidos e adaptados para HT / HC abordagens. &gt; ntent &quot;Com uma combinação de cultura de células automatizado e imagem HC pode rapidamente obter novos insights sobre como os neurônios de função e determinar quais as vias são importantes para o desenvolvimento da doença. Combinando HCS / HTS dados com informações geradas a partir de outras abordagens a genómica, que vai então, ser possível construir uma visão de biologia de sistemas de doenças cerebrais, facilitando assim o desenvolvimento terapêutico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número Catálogo </td></tr><tr><td> AI.CELLHOST </td><td> HAMILTON </td><td> <a href="http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/">http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/</a> </td></tr><tr><td> OPTI-MEM </td><td> INVITROGEN </td><td> 31985-054 </td></tr><tr><td> Ácido Retinóico </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> PLACAS OMNITRAY </td><td> NUNC </td><td> 465219 </td></tr><tr><td> 96 BEM placas de cultura </td><td> GRENIER </td><td> 655086 </td></tr><tr><td> DJ1 ANTICORPO N20 </td><td> SANTA CRUZ </td><td> SC27004 </td></tr><tr><td> BETA-III ANTICORPO tubulina </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> T3952 </td></tr><tr><td> CMXROS MITOTRACKER </td><td> INVITROGEN </td><td> M-7512 </td></tr><tr><td> HOECHST-33342 </td><td> INVITROGEN </td><td> H1399 </td></tr><tr><td> PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> 216763-100ML </td></tr><tr><td> TRIPSINA </td><td> INVITROGEN </td><td> 25050014 </td></tr><tr><td> FOSFATO Dulbecco Tampão Salina </td><td> INVITROGEN </td><td> 14190086 </td></tr><tr><td> PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX </td><td> PROMEGA </td><td> A2380 </td></tr><tr><td> Plasmideo CLONES </td><td> Open Biosystems </td><td> <a href="http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/TRCLibraryDetails/">http://www.openbiosystems</a>.com / RNAi / shRNALibraries / TRCLibraryDetails / </td></tr><tr><td> BIOAPPLICATIONS CELLOMICS </td><td> THERMO FISHER- </td><td> <a href="http://www.thermo.com/hcs">http://www.thermo.com/hcs</a> </td></tr></tbody></table>

screening alto teor em doenças neurodegenerativas

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

A anotação funcional de genomas, construção de redes e identificação molecular romance alvo da droga, são desafios importantes que precisam ser tratadas como uma questão de grande urgência 1-4. Múltiplas abordagens complementares a genómica forneceram pistas sobre os fatores de risco genéticos e mecanismos patogênicos subjacentes inúmeras doenças neurodegenerativas, mas a maioria dos achados ainda necessitam de validação funcional 5. Por exemplo, um recente estudo de associação genômica ampla para a Doença de Parkinson (DP), identificou muitos loci novos fatores de risco para a doença, mas a variante subjacente causal (s) ou mecanismo patogênico não é conhecida 6, 7. Como cada região associada pode conter vários genes, a avaliação funcional de cada um dos genes em fenótipos associados com a doença, utilizando técnicas de biologia celular tradicional levaria muito tempo. Há também uma necessidade de compreender as redes moleculares que apontammutações genéticas para os fenótipos que elas causam. Espera-se que fenótipos da doença são o resultado de múltiplas interações que foram rompidas. Reconstrução dessas redes usando os tradicionais métodos moleculares seria demorado. Além disso, as previsões de rede de estudos independentes de componentes individuais, a abordagem reducionista, provavelmente subestimam a complexidade da rede 8. Essa subestimação poderia, em parte, explicar a baixa taxa de sucesso de aprovação da droga devido aos efeitos colaterais indesejáveis ​​ou tóxicos. Ganhando uma perspectiva de rede de vias de doenças relacionadas com HT / HC abordagens de triagem celular, e identificar os nós-chave dentro dessas vias, poderiam levar à identificação de alvos que são mais adequados para a intervenção terapêutica. High-throughput screening (HTS) é uma metodologia ideal para abordar estas questões 9-12. mas os métodos tradicionais foram unidimensional ensaios de todo o bem celular, que usava simplistic leituras de processos biológicos complexos. Eram incapazes de quantificar simultaneamente os fenótipos observados em muitas doenças neurodegenerativas, tais como déficits de transporte axonal ou alterações nas propriedades morfologia 13, 14. Esta abordagem não poderia ser usado para investigar a natureza dinâmica de processos celulares ou eventos patogênicos que ocorrem em um subconjunto de células. Para quantificar tais características tem de se mudar para multi-dimensional fenótipos denominado de alto teor de triagem (HCS) 4, 15-17. HCS é a quantificação baseada em células de vários processos simultaneamente, o que fornece uma representação mais detalhada da resposta celular a perturbações diversas em relação ao HTS. HCS tem muitas vantagens sobre HTS 18, 19, mas a realização de um high-throughput (HT) de alta o conteúdo da tela (HC) em modelos neuronal é problemático devido ao alto custo, a variação ambiental e erro humano. A fim de detectar respostas celulares em uma escala &#39;phenomics&#39;usando uma imagem HC tem que reduzir a variação e erro, enquanto aumentando a sensibilidade e reprodutibilidade. Aqui nós descrevemos um método para realizar com precisão e confiabilidade telas shRNA utilizando cultura de células automatizado 20 e HC de imagem em modelos celulares neuronais. Descrevemos como nós usamos esta metodologia para identificar moduladores de uma determinada proteína, DJ1, que quando mutado causa parkinsonismo autossômica recessiva 21. Combinando a versatilidade do HC de imagem com métodos de HT, é possível quantificar com precisão um grande número de fenótipos. Esta situação pode ser utilizada para fazer avançar a nossa compreensão do genoma, os caminhos envolvidos na patogênese da doença, bem como identificar potenciais alvos terapêuticos.

Nós descrevemos uma metodologia que combina cultura de células automatizado com alto conteúdo de imagem para visualizar e quantificar vários processos celulares e estruturas, de uma forma de alto rendimento. Tais métodos podem auxiliar na anotação de genomas ainda mais funcional, bem como identificar redes de doença genética e alvos terapêuticos potenciais.

Screening alto teor em Doenças Neurodegenerativas

A anotação funcional de genomas, a construção de redes moleculares e a identificação de novos alvos terapêuticos são desafios importantes que precisam ser...

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar ensaios de alto conteúdo em modelos celulares de doenças para quantificar vias afetadas em doenças neurodegenerativas. Para isso, um modelo celular do fenótipo da doença é inserido no sistema automatizado de cultura celular, e as células são incubadas até que o número celular necessário seja atingido. Em seguida, as células são divididas, contadas e distribuídas em placas de 96 poços contendo lentivírus que expressam diversos RNAs de interferência (SH RNAs).Após seis dias de diferenciação celular, as células são coletadas do sistema para imunomarcação e imagem de alto conteúdo. Por fim, as imagens são analisadas utilizando uma variedade de algoritmos de análise para quantificar características relacionadas à saúde celular, crescimento neuronal e função mitocondrial.Os resultados também são analisados por meio de ANOVA de dois fatores no Novas para identificar efeitos de interação significativos. Este método pode acelerar a obtenção de respostas para questões fundamentais sobre a função de genes relacionados a doenças e as vias nas quais eles atuam no geral. Isso levará então a uma melhor compreensão dos mecanismos patogênicos envolvidos nas doenças neurodegenerativas.Para iniciar o processo de cultura celular, prepare o sistema automatizado de cultura celular para a entrada de placas de cultura celular. Carregue os consumíveis, como ponteiras de pipeta, placas de cultura celular e placas de ensaio, no sistema. Além disso, verifique manualmente se há quantidade suficiente de meio de cultura celular, PBS e tripsina no sistema.Seme duas placas de bandeja omni com dois vezes 10 elevado a seis células por placa da linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y. Mantenha as células em meio ideal com 10% de soro bovino fetal (FBS) e coloque as placas na prateleira de entrada do robô de cultura celular. Utilizando a interface gráfica do usuário (GUI), selecione o protocolo de cultura de células aderentes A e ajuste os arquivos de parâmetros específicos da linhagem celular aderente para que o limite de confluência seja definido em 70%.Tempo total de preparação para dois minutos. Instrua o sistema a preparar novas placas omni tray com um número de células de assentamento de duas vezes 10 elevado à sexta células por placa. Instrua o sistema a preparar placas de ensaio por placa omni tray com um total de 5.000 células por poço, incubando as células a 37 graus Celsius e 5% de CO₂.Os seguintes passos estão envolvidos neste protocolo de cultura celular de aderência. As placas são incubadas e monitoradas até que as células atinjam o limiar predefinido de confluência. Se as células não atingirem o limiar de confluência dentro de cinco leituras, as placas são removidas do sistema.Após atingir o limiar de confluência definido pelo usuário, as células são lavadas, tripsinizadas e contadas. Um número predeterminado de células é adicionado a novas placas omni trait, e, se houver número suficiente de células, um número especificado de placas de ensaio é transportado para a plataforma e um número definido de células é dispensado em cada poço. Por fim, as placas de ensaio podem ser diretamente imageadas usando o microscópio integrado ou retiradas do sistema para processamento adicional, iniciando o procedimento de produção de vírus.Inocule o meio LB contendo ampicilina com estoques glicerinados bacterianos contendo os vetores HRNA, deixe crescer durante a noite e, no dia seguinte, centrifugue as células e remova o sobrenadante; extraia os plasmídeos utilizando o sistema de purificação de plasmídeos Wizard Magnus. O DNA plasmidial final contendo E EIT é coletado em placas de 96 poços. O lentivírus S-H-R-N-A é produzido utilizando o consórcio RNAi, por meio de produção lentiviral em placas de 96 poços; todos os experimentos devem ser realizados em um laboratório de segurança LA nível ML dois ou BSL dois, e todos os reagentes e consumíveis utilizados devem ser descontaminados com cloro a 30% após o uso.O procedimento para produção de lentivírus não será demonstrado neste vídeo, mas leva quatro dias e consiste nas seguintes etapas. Primeiro, as células empacotadoras são semeadas no dia zero na tarde seguinte. No dia um, as células empacotadoras são transfectadas com três plasmídeos de lentivírus 18 horas após a transfeção.No segundo dia, o meio é substituído por meio fresco com alta concentração de BSA ou soro. Após 24 horas da troca do meio. No terceiro dia, o vírus é coletado e o meio é novamente substituído por meio fresco com alta concentração de BSA ou soro.Por fim, 24 horas após a primeira coleta do vírus, no quarto dia, o vírus é coletado novamente e as células empacotadoras são descartadas para calcular a multiplicidade de infecção ou MOI do lentivírus. Transduza células SHSY5Y com diluições seriadas do vírus, incube as células a 37 graus Celsius e, 72 horas após a transdução, visualize a expressão de GFP em microscópio e determine a porcentagem de células positivas para GFP. Plaque o lentivírus S-H-R-N-A em placas de ensaio com um MOI de três. Após o plaqueamento do lentivírus SHRNA nas placas de ensaio, carregue as placas no sistema automatizado de cultura celular para transdução lentiviral.Após 24 horas, o meio nos placas do ensaio será substituído por meio ótimo contendo 0,5% de FBS e 0,1 micromolar de ácido retinóico. Para iniciar o processo de diferenciação, continue a incubação das placas do ensaio no meio de diferenciação por cinco dias para garantir a redução máxima da expressão do gene alvo no quinto dia; adicione H2O a metade das placas do ensaio por 24 horas para estimular a translocação da proteína DJ1 para as mitocôndrias no sexto dia. Adicione MIT tracker às células numa concentração final de 200 nanomolares por poço e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos.Após isso, as placas podem ser transportadas para o sistema de imagem de alto conteúdo ou HC para aquisição de imagens. Alternativamente, as placas podem ser exportadas do sistema para processamento adicional, como imunomarcação. Para a aquisição de imagens de alto conteúdo, um total de 30 campos por poço será imageado utilizando a lente objetiva de 20 x visualizada DJ um com o conjunto de filtros fitzy mitocôndrias com o conjunto de filtros trixy beta três tubulina com o conjunto de filtros S cinco e núcleos com o conjunto de filtros UV.Este é um exemplo de imagens compostas de células adquiridas por meio de imagem de alto conteúdo. A figura mostra três células não tratadas no painel A e células tratadas com H2O2 no painel B. DJ1 é marcado em verde, mitocôndrias em vermelho e núcleos em azul. Para determinar o coeficiente médio de sobreposição entre DJ1 e as mitocôndrias, analise as imagens utilizando o aplicativo bio de colocalização.Defina as regiões de interesse. ROI da seguinte forma: ROIA, núcleo, figura quatro A e E; e ROIB, mitocôndrias, figura quatro B e F. Exclua ROIA de ROIB. Para garantir a análise apenas do citoplasma, defina as mitocôndrias como região-alvo um e DJ um como região-alvo dois, figura quatro C e G. Analise as imagens utilizando o aplicativo bio de análise compartimental para determinar a intensidade média do sinal do rastreador MIT dentro das mitocôndrias.Figura quatro B e F para rastrear os comprimentos médios dos neuritos a partir da coloração da tubulina beta três. Analise as imagens utilizando a aplicação bioinformática de perfilamento neuronal, figura quatro D e H, nas próximas placas de imagens usando o leitor confocal automatizado opera lx.Visualize as mitocôndrias com o laser de 561 nanômetros e os núcleos com imagem de excitação UV. Um total de 30 campos por poço utilizando a lente objetiva de 60 x com imersão em água. Por fim, analise as imagens utilizando o algoritmo de características texturais de borda de ponto ou SER.O filtro de crista SER transmite a intensidade em pixels formando padrões semelhantes a cristas. Quanto mais fragmentada for a mitocôndria, maior será a pontuação de crista SER. Neste vídeo, ensaios de alto conteúdo ou ensaios HC foram utilizados para identificar moduladores da proteína DJ-1A, cuja perda causa parkinsonismo autossômico recessivo.Este primeiro resultado representativo ilustra uma interação epistática com DJ1. O gráfico de barras à esquerda mostra unidades de fluorescência normalizadas e as imagens à direita mostram células SH-SY5Y marcadas em vermelho com MitoTracker para quantificação da viabilidade celular.Observou-se que o silenciamento de DJ um em células expostas à toxina resultou em uma perda maior da viabilidade celular em comparação com células infectadas com lentivírus aleatório. O silenciamento do gene alvo A teve um efeito semelhante ao observado em células com silenciamento de DJ um. No entanto, o silenciamento de ambos DJ um e o gene alvo A resultou em uma perda significativamente maior da viabilidade celular do que a perda de qualquer um dos genes isoladamente, o que sugere uma interação epistática entre DJ um e o gene alvo A. Este próximo exemplo é de um gene regulando a translocação de DJ um.O gráfico de barras mostra o coeficiente de sobreposição normalizado entre DJ1 e as mitocôndrias, o que reflete a translocação de DJ1 do citoplasma para as mitocôndrias. Os painéis de A a D são imagens de células SHSY5Y marcadas em verde para DJ1, em vermelho para mitocôndrias e em azul para núcleos. Quando as células são expostas a uma toxina, DJ1 se transloca do citoplasma para as mitocôndrias, o que é quantificado por um coeficiente de sobreposição maior entre DJ1 e as mitocôndrias.Em células onde o gene alvo B foi silenciado, menos DJ um transloca para as mitocôndrias quando as células são expostas à toxina, o que sugere que o gene alvo B está envolvido no transporte de DJ um para as mitocôndrias. Um exemplo de um gene envolvido no crescimento neuronal é mostrado aqui. Os comprimentos normalizados dos neuritos são apresentados no gráfico de barras, e as células utilizadas para a quantificação dos comprimentos dos neuritos são mostradas nas imagens com beta três tubulina em verde e núcleos em azul.O silenciamento do gene alvo C em células SHSY cinco Y do tipo selvagem resulta em um aumento significativo no comprimento dos neuritos em comparação com as células infectadas com lentivírus que expressam RNA de interferência aleatório. Esse efeito é perdido em células incubadas com toxina. Por fim, esses resultados mostram um exemplo de um gene envolvido na morfologia mitocondrial.Valores médios de segmentação das cristas mitocondriais SER em células SHSY cinco Y infectadas com HRNA aleatório ou A-S-H-R-N-A direcionado ao gene D são mostrados no gráfico. A imagem A e a imagem C são imagens compostas de células SHSY cinco Y infectadas com HRNA aleatório ou A-H-R-N-A direcionado ao gene D, respectivamente. As mitocôndrias são coloridas em vermelho, enquanto os núcleos são coloridos em azul.As imagens B e D são visualizações da quantificação da crista SER observada aqui. A infecção de células SHSY cinco Y do tipo selvagem com HRNA direcionado ao gene D resulta em um aumento no valor de segmentação da crista mitocondrial SER quando comparado às células infectadas com lentivírus aleatório. Essa abordagem pode abrir caminho para pesquisadores na área de neurodegeneração explorarem e anotarem as vias envolvidas na patogênese da doença de maneira oportuna.Isso então levará a alvos melhores para o desenvolvimento terapêutico.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este artigo descreve um protocolo de romance e de reagente conjunto projetado para a medição sensível de efeitos neurotóxicos de compostos e tratamentos em co-culturas de neurônios e astrócitos usando análise de conteúdo de alta. Resultados demonstram que a análise de conteúdo de alta tecnologia representa um romance empolgante para a avaliação de neurotoxicidade.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

Fonte: Bétemps, D., et al.,  Detecção de α-sinucleína associada à doença por ELISA aprimorado no cérebro de camundongos transgênicos que superexpressam α-sinucleína com mutação A53T humana. J. Vis. Exp. (2015). Este vídeo demonstra o procedimento para detectar a proteína α-sinucleína associada a doenças neurodegenerativas no tecido cerebral de camundongos transgênicos usando ELISA. As etapas incluem homogeneização tecidual, centrifugação e detecção ELISA da proteína α-sinucleína para...

Detecção de proteína associada a doenças neurodegenerativas α-sinucleína usando ELISA

Apresentamos um método de triagem rápida e de baixo custo para a identificação de reguladores de transcrição usando de alto rendimento transfections robóticos e um ensaio de luciferase dual-brilho caseiro. Este protocolo gera rapidamente dados funcionais diretos side-by-side para milhares de genes e é facilmente modificável para atingir qualquer gene de interesse.

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Nós descrevemos um de alto rendimento, multiplex, e ensaio de líquido cefalorraquidiano proteômica alvo (CSF) desenvolvido com potencial para a tradução clínica. O teste pode quantificar potenciais marcadores e os factores de risco para a neurodegeneração, tais como as variantes de apolipoproteína E (E2, E3 e E4), e medir a sua expressão alélica.

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Descreve-se aqui uma abordagem de rastreio comportamental escalonada que pode ser utilizada para pesquisar compostos que exibem eficácia in vivo sobre comportamentos motores cognitivos e funcionais em modelos de ratinho transgénicos de β-amiloidose e tauopatia. Esses métodos são otimizados para pesquisar compostos para atividades em tarefas de memória de curto prazo e de trabalho.

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Nós apresentamos um protocolo usando uma aproximação genética para a frente à tela para os mutantes que exibem a neurodegeneração no melanogaster de Drosophila. Incorpora um ensaio de escalada, uma análise da histologia, um mapeamento do gene e um sequenciamento do ADN para identificar finalmente genes novos relativos ao processo de neuroprotection.

In vivo Forward genética Screen para identificar novos genes neuroprotetores em Drosophila melanogaster

Descrevemos a produção de culturas mistas de astrócitos e células precursoras oligodendrocytes derivadas de células-tronco neurais fetais ou adultas se diferenciando em oligodenrócitos maduros, e modelagem in vitro de estímulos nocivos. O acoplamento com uma técnica de triagem de alto conteúdo baseada em células constrói um sistema de triagem de drogas confiável e robusto.

Análise de diferenciação e maturação de rastreamento de alto conteúdo das culturas celulares precursoras do Oligodendrocyte, derivadas de células-tronco-tronco-tronco-de-alto teor

Fibroblastos de pacientes portadores de mutações no causadores de doenças de Parkinson genes representam um facilmente...

A utilização de recursos primários fibroblastos humanos de Monitoramento Fenótipos mitocondriais no Campo da Doença de Parkinson

Aprenda ensaios de alto conteúdo para quantificar vias afetadas em doenças neurodegenerativas usando células SH-SY5Y e imagem automatizada. Este método acelera a identificação de alvos terapêuticos.

Screening alto teor em Doenças Neurodegenerativas

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