Screening alto teor em Doenças Neurodegenerativas

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar ensaios de alto conteúdo em modelos celulares de doenças para quantificar vias afetadas em doenças neurodegenerativas. Para isso, um modelo celular do fenótipo da doença é inserido no sistema automatizado de cultura celular, e as células são incubadas até que o número celular necessário seja atingido. Em seguida, as células são divididas, contadas e distribuídas em placas de 96 poços contendo lentivírus que expressam diversos RNAs de interferência (SH RNAs).

Após seis dias de diferenciação celular, as células são coletadas do sistema para imunomarcação e imagem de alto conteúdo. Por fim, as imagens são analisadas utilizando uma variedade de algoritmos de análise para quantificar características relacionadas à saúde celular, crescimento neuronal e função mitocondrial.

Os resultados também são analisados por meio de ANOVA de dois fatores no Novas para identificar efeitos de interação significativos. Este método pode acelerar a obtenção de respostas para questões fundamentais sobre a função de genes relacionados a doenças e as vias nas quais eles atuam no geral. Isso levará então a uma melhor compreensão dos mecanismos patogênicos envolvidos nas doenças neurodegenerativas.

Para iniciar o processo de cultura celular, prepare o sistema automatizado de cultura celular para a entrada de placas de cultura celular. Carregue os consumíveis, como ponteiras de pipeta, placas de cultura celular e placas de ensaio, no sistema. Além disso, verifique manualmente se há quantidade suficiente de meio de cultura celular, PBS e tripsina no sistema.

Seme duas placas de bandeja omni com dois vezes 10 elevado a seis células por placa da linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y. Mantenha as células em meio ideal com 10% de soro bovino fetal (FBS) e coloque as placas na prateleira de entrada do robô de cultura celular. Utilizando a interface gráfica do usuário (GUI), selecione o protocolo de cultura de células aderentes A e ajuste os arquivos de parâmetros específicos da linhagem celular aderente para que o limite de confluência seja definido em 70%.

Tempo total de preparação para dois minutos. Instrua o sistema a preparar novas placas omni tray com um número de células de assentamento de duas vezes 10 elevado à sexta células por placa. Instrua o sistema a preparar placas de ensaio por placa omni tray com um total de 5.000 células por poço, incubando as células a 37 graus Celsius e 5% de CO₂.

Os seguintes passos estão envolvidos neste protocolo de cultura celular de aderência. As placas são incubadas e monitoradas até que as células atinjam o limiar predefinido de confluência. Se as células não atingirem o limiar de confluência dentro de cinco leituras, as placas são removidas do sistema.

Após atingir o limiar de confluência definido pelo usuário, as células são lavadas, tripsinizadas e contadas. Um número predeterminado de células é adicionado a novas placas omni trait, e, se houver número suficiente de células, um número especificado de placas de ensaio é transportado para a plataforma e um número definido de células é dispensado em cada poço. Por fim, as placas de ensaio podem ser diretamente imageadas usando o microscópio integrado ou retiradas do sistema para processamento adicional, iniciando o procedimento de produção de vírus.

Inocule o meio LB contendo ampicilina com estoques glicerinados bacterianos contendo os vetores HRNA, deixe crescer durante a noite e, no dia seguinte, centrifugue as células e remova o sobrenadante; extraia os plasmídeos utilizando o sistema de purificação de plasmídeos Wizard Magnus. O DNA plasmidial final contendo E EIT é coletado em placas de 96 poços. O lentivírus S-H-R-N-A é produzido utilizando o consórcio RNAi, por meio de produção lentiviral em placas de 96 poços; todos os experimentos devem ser realizados em um laboratório de segurança LA nível ML dois ou BSL dois, e todos os reagentes e consumíveis utilizados devem ser descontaminados com cloro a 30% após o uso.

O procedimento para produção de lentivírus não será demonstrado neste vídeo, mas leva quatro dias e consiste nas seguintes etapas. Primeiro, as células empacotadoras são semeadas no dia zero na tarde seguinte. No dia um, as células empacotadoras são transfectadas com três plasmídeos de lentivírus 18 horas após a transfeção.

No segundo dia, o meio é substituído por meio fresco com alta concentração de BSA ou soro. Após 24 horas da troca do meio. No terceiro dia, o vírus é coletado e o meio é novamente substituído por meio fresco com alta concentração de BSA ou soro.

Por fim, 24 horas após a primeira coleta do vírus, no quarto dia, o vírus é coletado novamente e as células empacotadoras são descartadas para calcular a multiplicidade de infecção ou MOI do lentivírus. Transduza células SHSY5Y com diluições seriadas do vírus, incube as células a 37 graus Celsius e, 72 horas após a transdução, visualize a expressão de GFP em microscópio e determine a porcentagem de células positivas para GFP. Plaque o lentivírus S-H-R-N-A em placas de ensaio com um MOI de três. Após o plaqueamento do lentivírus SHRNA nas placas de ensaio, carregue as placas no sistema automatizado de cultura celular para transdução lentiviral.

Após 24 horas, o meio nos placas do ensaio será substituído por meio ótimo contendo 0,5% de FBS e 0,1 micromolar de ácido retinóico. Para iniciar o processo de diferenciação, continue a incubação das placas do ensaio no meio de diferenciação por cinco dias para garantir a redução máxima da expressão do gene alvo no quinto dia; adicione H2O a metade das placas do ensaio por 24 horas para estimular a translocação da proteína DJ1 para as mitocôndrias no sexto dia. Adicione MIT tracker às células numa concentração final de 200 nanomolares por poço e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Após isso, as placas podem ser transportadas para o sistema de imagem de alto conteúdo ou HC para aquisição de imagens. Alternativamente, as placas podem ser exportadas do sistema para processamento adicional, como imunomarcação. Para a aquisição de imagens de alto conteúdo, um total de 30 campos por poço será imageado utilizando a lente objetiva de 20 x visualizada DJ um com o conjunto de filtros fitzy mitocôndrias com o conjunto de filtros trixy beta três tubulina com o conjunto de filtros S cinco e núcleos com o conjunto de filtros UV.

Este é um exemplo de imagens compostas de células adquiridas por meio de imagem de alto conteúdo. A figura mostra três células não tratadas no painel A e células tratadas com H2O2 no painel B. DJ1 é marcado em verde, mitocôndrias em vermelho e núcleos em azul. Para determinar o coeficiente médio de sobreposição entre DJ1 e as mitocôndrias, analise as imagens utilizando o aplicativo bio de colocalização.

Defina as regiões de interesse. ROI da seguinte forma: ROIA, núcleo, figura quatro A e E; e ROIB, mitocôndrias, figura quatro B e F. Exclua ROIA de ROIB. Para garantir a análise apenas do citoplasma, defina as mitocôndrias como região-alvo um e DJ um como região-alvo dois, figura quatro C e G. Analise as imagens utilizando o aplicativo bio de análise compartimental para determinar a intensidade média do sinal do rastreador MIT dentro das mitocôndrias.

Figura quatro B e F para rastrear os comprimentos médios dos neuritos a partir da coloração da tubulina beta três. Analise as imagens utilizando a aplicação bioinformática de perfilamento neuronal, figura quatro D e H, nas próximas placas de imagens usando o leitor confocal automatizado opera lx.

Visualize as mitocôndrias com o laser de 561 nanômetros e os núcleos com imagem de excitação UV. Um total de 30 campos por poço utilizando a lente objetiva de 60 x com imersão em água. Por fim, analise as imagens utilizando o algoritmo de características texturais de borda de ponto ou SER.

O filtro de crista SER transmite a intensidade em pixels formando padrões semelhantes a cristas. Quanto mais fragmentada for a mitocôndria, maior será a pontuação de crista SER. Neste vídeo, ensaios de alto conteúdo ou ensaios HC foram utilizados para identificar moduladores da proteína DJ-1A, cuja perda causa parkinsonismo autossômico recessivo.

Este primeiro resultado representativo ilustra uma interação epistática com DJ1. O gráfico de barras à esquerda mostra unidades de fluorescência normalizadas e as imagens à direita mostram células SH-SY5Y marcadas em vermelho com MitoTracker para quantificação da viabilidade celular.

Observou-se que o silenciamento de DJ um em células expostas à toxina resultou em uma perda maior da viabilidade celular em comparação com células infectadas com lentivírus aleatório. O silenciamento do gene alvo A teve um efeito semelhante ao observado em células com silenciamento de DJ um. No entanto, o silenciamento de ambos DJ um e o gene alvo A resultou em uma perda significativamente maior da viabilidade celular do que a perda de qualquer um dos genes isoladamente, o que sugere uma interação epistática entre DJ um e o gene alvo A. Este próximo exemplo é de um gene regulando a translocação de DJ um.

O gráfico de barras mostra o coeficiente de sobreposição normalizado entre DJ1 e as mitocôndrias, o que reflete a translocação de DJ1 do citoplasma para as mitocôndrias. Os painéis de A a D são imagens de células SHSY5Y marcadas em verde para DJ1, em vermelho para mitocôndrias e em azul para núcleos. Quando as células são expostas a uma toxina, DJ1 se transloca do citoplasma para as mitocôndrias, o que é quantificado por um coeficiente de sobreposição maior entre DJ1 e as mitocôndrias.

Em células onde o gene alvo B foi silenciado, menos DJ um transloca para as mitocôndrias quando as células são expostas à toxina, o que sugere que o gene alvo B está envolvido no transporte de DJ um para as mitocôndrias. Um exemplo de um gene envolvido no crescimento neuronal é mostrado aqui. Os comprimentos normalizados dos neuritos são apresentados no gráfico de barras, e as células utilizadas para a quantificação dos comprimentos dos neuritos são mostradas nas imagens com beta três tubulina em verde e núcleos em azul.

O silenciamento do gene alvo C em células SHSY cinco Y do tipo selvagem resulta em um aumento significativo no comprimento dos neuritos em comparação com as células infectadas com lentivírus que expressam RNA de interferência aleatório. Esse efeito é perdido em células incubadas com toxina. Por fim, esses resultados mostram um exemplo de um gene envolvido na morfologia mitocondrial.

Valores médios de segmentação das cristas mitocondriais SER em células SHSY cinco Y infectadas com HRNA aleatório ou A-S-H-R-N-A direcionado ao gene D são mostrados no gráfico. A imagem A e a imagem C são imagens compostas de células SHSY cinco Y infectadas com HRNA aleatório ou A-H-R-N-A direcionado ao gene D, respectivamente. As mitocôndrias são coloridas em vermelho, enquanto os núcleos são coloridos em azul.

As imagens B e D são visualizações da quantificação da crista SER observada aqui. A infecção de células SHSY cinco Y do tipo selvagem com HRNA direcionado ao gene D resulta em um aumento no valor de segmentação da crista mitocondrial SER quando comparado às células infectadas com lentivírus aleatório. Essa abordagem pode abrir caminho para pesquisadores na área de neurodegeneração explorarem e anotarem as vias envolvidas na patogênese da doença de maneira oportuna.

Isso então levará a alvos melhores para o desenvolvimento terapêutico.