Campo elétrico controlado de migração dirigida de células progenitoras neurais em ambientes 2D e 3D

O objetivo geral deste procedimento é registrar o efeito dos campos elétricos aplicados na migração de células progenitoras neurais em cultura 2D e modelos 3D ex vivo. Isso é feito primeiro isolando e expandindo as células progenitoras neurais dos neurônios in vitro. O segundo passo é preparar uma suspensão de célula única de células progenitoras neurais.

Em seguida, para a preparação da cultura 2D, as células progenitoras neurais são revestidas em câmaras eletrotáticas personalizadas. Alternativamente, para a preparação do modelo 3D ex vivo, as células progenitoras neurais são marcadas com ganchos 3, 3, 3, 4, 2 e injetadas em um modelo organotípico de fatia da medula espinhal. Em última análise, um campo elétrico é aplicado às câmaras elétricas e o registro de lapso de tempo é realizado para mostrar que as células progenitoras migram em direção ao cátodo do campo elétrico em ambientes 2D e 3D.

A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um novo método para o rastreamento ao vivo da migração induzida por campo elétrico de células individuais após o transplante em um modelo organotípico 3D, muito semelhante ao ambiente natural. Este método pode não só fornecer inserção na técnica elétrica, migração de células neuro entais transplantadas para fatia da medula espinhal, mas também pode ser aplicado a outros sistemas que, como modelos de fatia de cérebro pequenos. Para iniciar este procedimento, prepare tiras de vidro de 22 por 11 milímetros dividindo a autoclave em 22 por 22 milímetros.

A espessura número um cobre as lamínulas ao meio usando uma caneta de diamante. Em seguida, crie um poço de vidro independente de dimensões internas, 22 por 10 milímetros, colando quatro verticalmente, colocando tiras de 22 por 11 milímetros junto com graxa de silicone de alto vácuo, deixe o poço secar completamente e endurecer durante a noite. No dia seguinte, prenda 2 tiras de vidro de 22 por 11 milímetros paralelas umas às outras, deixando um espaço de 10 milímetros na base de uma placa de cultura de 100 milímetros usando graxa de silicone.

Em seguida, sele a região entre essas tiras anexando uma lamínula de 22 por 22 milímetros com graxa de silicone. Coloque bem o vidro nas lamínulas de cobertura para que as paredes internas criem um espaço confinado para semear as células. Impermeabilize todas as juntas com graxa de silicone.

Cubra esta região confinada sequencialmente com poli de licina, seguido de laminina conforme descrito no manuscrito anexo. Neste procedimento, obtenha os cérebros dos camundongos E 14 a E 16 e coloque-os em meio basal D-M-E-M-F 12 frio. Em seguida, remova as meninges sob um microscópio anatômico.

Depois disso, transfira os cérebros para uma placa de Petri de 35 milímetros. Use o fórceps fino para dissociar os cérebros em fragmentos de tecido. Em seguida, transfira-os para uma centrífuga de tubo de 15 mililitros.

As amostras a 800 RPM por três minutos para remover os detritos D. Em seguida, A-D-M-E-M-F 12 contendo BFDF e DGF para as amostras. Tritrate os comeu com uma pipeta de um mililitro.

Em seguida, obtenha a suspensão de célula única com um filtro de célula. Colocar as células nos balões a 20 000 a 50 000 células por mililitro. Em seguida, execute uma troca completa do meio a cada três dias, o que envolve centrifugar as células a 1.300 RPM por cinco minutos.

Descartar o Resus supinado, suspender o TP em meio fresco e retornar as células ao frasco a cada seis dias após pelo menos cinco. Transferir as NEUROSPHERES para uma centrífuga de tubo de 15 mililitros a 1.500 RPM por cinco minutos. Descarte o supinado.

Ressuspenda o pellet em viagens em EDTA para produzir uma suspensão de célula única. Antes de realizar uma contagem de células, prepare um mililitro de suspensão contendo 10.000 células. Em seguida, remova bem a laminina do vidro e deixe secar completamente.

Substitua-o por um mililitro de suspensão celular. Depois disso, coloque o prato na incubadora a 37 graus Celsius por no mínimo quatro horas para permitir a fixação. Quando as células estiverem suficientemente cofluentes, remova o meio da câmara.

Remova cuidadosamente o vidro. Bem, então, forme um telhado sobre as células prendendo cuidadosamente uma autoclave de 22 por 22 milímetros de lamínula de vidro entre 2 22 por 11 milímetros tiras com graxa de silicone. Lembre-se de cobrir as células com algumas gotas de meio para evitar o ressecamento.

Em seguida, forme um reservatório de meio isolado em cada extremidade da câmara, criando duas barreiras de graxa de silicone à prova d'água que vão de uma extremidade da placa à outra. Encha a câmara com meio fresco, garantindo um fluxo de um reservatório de meio para o outro. Depois, devolva o prato à incubadora por 12 horas para permitir a recuperação celular.

Na próxima etapa, prepare uma tampa para cobrir o prato fazendo dois furos, um posicionado sobre cada reservatório da câmara de migração. Em seguida, substitua o meio na câmara por meio cultivado contendo tampão hippies de 25 milímetros. Depois disso, transfira o prato para o sistema de imagem com temperatura controlada.

Defina os parâmetros experimentais para lapso de tempo e gravação em várias posições. Alinhe a câmara de modo que o cátodo e o ânodo fiquem à esquerda e à direita, respectivamente, para garantir que o vetor do campo elétrico corra horizontalmente conforme visto ao microscópio e registrado no sistema de imagem. Em seguida, encha dois copos.

Com a solução de Steinberg. Conecte um béquer separado a cada reservatório de meio usando as pontes de vidro pré-preparadas preenchidas com solução de ágar 2%Steinberg. Em seguida, coloque os eletrodos de prata conectados a uma fonte de alimentação CC na solução Steinberg.

Em cada copo, coloque o botão de tensão na fonte de alimentação em zero e ligue-o. Meça a tensão na câmara eletrotática com um medidor de tensão enquanto aumenta o dial de tensão. Em seguida, ajuste a tensão para atender aos requisitos experimentais.

Depois disso, inicie a gravação de lapso de tempo. Execute uma mudança de meio e reajuste a tensão conforme necessário. A cada hora, drogas frescas, médias ou agentes químicos podem ser adicionados aos reservatórios, conforme necessário.

Usando orifícios adicionais perfurados na tampa do prato de cultura, um situado sobre cada reservatório médio. Nesta etapa, disseque a medula espinhal lombar de camundongos com duas semanas de idade. Em seguida, corte a medula espinhal em seções de 500 mícrons de espessura com um cortador de tecido machel sob um microscópio anatômico.

Separe as fatias e selecione aquelas com estrutura da medula espinhal axial sagital intacta. Em seguida, coloque as fatias em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 30 microlitros de gel MA. Coloque-os o mais próximo possível do centro.

Mantenha-os em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Para que as proteínas do gel matri se auto-montem, para produzir uma película fina que cubra a superfície das fatias da medula espinhal, é muito importante que o gel matri tenha sido montado completamente. Incube a placa de Petri a 37 graus Celsius por mais 30 minutos, se necessário, em seguida, adicione quatro a seis mililitros de meio D-M-E-M-F 12 contendo 25 milimolares de tampão heis e 15 a 20% de soro fetal de bezerro.

Muito suavemente para evitar o fluxo do meio diretamente nas fatias, certifique-se de que as fatias não fiquem totalmente submersas no meio, deixando a superfície das berinjelas bem exposta ao ar. Troque o meio duas vezes por semana. Agora incube a suspensão de células progenitoras neurais no meio com cinco ganchos micromolares.

3, 3, 3, 4, 2 por 30 minutos. Sob um microscópio, use um tubo de vidro capilar para microinjetar dois microlitros de suspensão na fatia da medula espinhal. Lentamente, certifique-se de que o tubo de vidro capilar passe pelo matrigel e alcance o interior da fatia da medula espinhal.

Mantenha o tubo de vidro dentro da fatia da medula espinhal por pelo menos 30 segundos para evitar a suspensão celular. Atropele, coloque a placa de Petri contendo a fatia da medula espinhal na incubadora a 37 graus Celsius com 5 centavos de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, construa uma câmara eletrotática ao redor da fatia da medula espinhal contendo ganchos 3 3 3 4 2 células de neurogênese marcadas antes de aplicar um campo elétrico medindo 500 milivolts por milímetro.

Aqui, as células progenitoras neurais mostram migração altamente direcionada para o cátodo quando expostas aos campos elétricos, linhas vermelhas e setas azuis representam as trajetórias e a direção do movimento celular, respectivamente. E aqui está o gráfico dos caminhos de migração mostrados. Aqui estão as células progenitoras neurais marcadas com ganchos 3, 3, 3, 4, 2.

Eles foram transplantados para a fatia organotípica da medula espinhal no ponto de partida do tratamento com campo elétrico. Depois que as células progenitoras neurais migraram direcionalmente em direção ao cátodo por 2,5 horas, a polaridade do campo elétrico foi invertida. A alteração da polaridade do campo elétrico desencadeou uma reversão acentuada de axxis em direção ao novo cátodo.

Aqui está uma imagem das células progenitoras neurais transplantadas dentro da fatia da medula espinhal. No final da gravação de lapso de tempo e uma reconstrução 3D das células progenitoras neurais transplantadas dentro da fatia da medula espinhal é mostrada aqui. Missa dominada.

Esta técnica pode ser feita em duas semanas se for realizada corretamente após seu desenvolvimento. Essa técnica agora abre caminho para pesquisadores no campo da biologia celular explorarem a migração de células progênicas neurais em sistemas de cultura 2D e 3D em resposta e aplicar ao campo elétrico.