Pré-sináptica de dopamina Dynamics em fatias de cérebro estriado com Fast-scan voltametria cíclica

O objetivo geral deste procedimento é ilustrar um protocolo geral para a telemetria cíclica rápida por varredura de fatias. Isso é realizado primeiramente preparando o tecido cerebral para corte coronal. Em seguida, eletrodos são posicionados na região cerebral discreta de interesse.

O próximo passo é aplicar uma tensão na forma de uma onda triangular por meio do eletrodo para detectar dopamina. Por fim, um agente farmacológico de interesse é aplicado ao fragmento de cérebro e seu efeito sobre a dinâmica pré-sináptica da dopamina é observado. Em última análise, este protocolo mostra alterações na dinâmica pré-sináptica da dopamina, como a liberação estimulada de dopamina e as taxas de captação de dopamina por meio da voltametria cíclica de varredura rápida Telemetry.

Embora este método possa fornecer informações sobre a dinâmica dopaminérgica pré-sináptica, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, incluindo animais e neurotransmissores, tais como ratos e moscas-das-frutas, e serotonina e noradrenalina, respectivamente. Quem demonstrará o procedimento serão Francis Mena, MEA Khalid e Erin oo, os estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, de acordo com o manuscrito anexo, prepare três tipos de soluções de fluido céfalo-raquidiano artificial: solução de sacarose A-CSF-A-CSF para gravações voltamétricas e uma solução ACSF modificada para calibração do eletrodo. Em seguida, transfira 10 mililitros da solução de sacarose ACSF para um béquer pequeno e coloque-o em um balde de gelo. Depois, coloque o adesivo instantâneo Loctite em um balde de gelo.

Em seguida, prepare uma lâmina de barbear e as ferramentas necessárias para a dissecação, como pinça, espátula e tesoura, limpando-as com um lenço umedecido com álcool. Em seguida, sacrifique um camundongo por decapitação e remova rapidamente seu cérebro. Coloque o cérebro em um béquer contendo sacarose fria a 4 °C por aproximadamente 10 minutos.

Enquanto isso, prepare o VIBRAM para o corte. Coloque um pouco de gelo triturado na cuba do espécime. Em seguida, posicione a câmara do espécime no Vibram e fixe-a firmemente.

Adicione mais gelo ao redor da câmara de espécime para preencher as lacunas e certifique-se de que nenhum gelo entre na câmara. Em seguida, coloque uma lâmina de barbear limpa no suporte da lâmina. Depois, encha a câmara de espécime com sacarose fria a 4 °C em LCR.

Posteriormente, despeje um pouco da solução de sacarose A CSF fria sobre um pedaço de papel-toalha colocado em uma placa de Petri virada para baixo. Transfira o cérebro de camundongo recém-dissecado para o papel com uma pinça. Em seguida, remova o cerebelo cortando ao longo do eixo medial lateral com uma lâmina de barbear.

Isso cria uma base plana que pode ser fixada ao estágio vibram. Em seguida, adicione uma gota do adesivo Loctite sobre o estágio da amostra. Fixe imediatamente a extremidade plana do cérebro preparado ao estágio, mantendo-o o mais vertical possível.

Em seguida, coloque a platina na câmara de espécimes e aperte o parafuso. Certifique-se de que o cérebro esteja completamente imerso na solução de sacarose A CSF na câmara. Depois disso, ajuste a platina com o controle para que a lâmina de barbear fique alinhada com o topo do cérebro.

Os parâmetros ideais para o vibrátomo são obtidos ajustando a frequência e a velocidade para o nível baixo. Em seguida, ajuste a espessura dos cortes para 400 micrômetros. Os primeiros cortes geralmente não contêm o estriado.

Repita o corte até obter as fatias contendo o estriado. Uma vez alcançada a região AAL do estriado, use um pincel para levantar a fatia e colocá-la em um béquer com solução salina equilibrada com oxigênio à temperatura ambiente.

Tipicamente, pode-se obter três a quatro fatias contendo o complexo estriatal no qual estão incluídos o putâmen caudado e o núcleo accumbens. Deixe as fatias aclimatarem-se em um ACSF borbulhado com 95%O₂ 5%CO₂ à temperatura ambiente por pelo menos uma hora antes de prosseguir com o experimento. Para iniciar este procedimento, conecte a tubulação à câmara de gravação por imersão.

Em seguida, perfunda o A CSF oxigenado à temperatura ambiente à taxa de um mililitro por minuto. Ajuste o controlador de temperatura para 32 graus Celsius após o A CSF ter preenchido o suporte personalizado para lâminas. Remova quaisquer bolhas de ar sob a malha utilizando uma seringa com agulha.

Crie pressão negativa no tubo de saída com uma seringa para iniciar o fluxo e controlar o transbordamento do tampão. Coloque uma toalha de papel Kim na borda do suporte de fatias para atuar como um pavio. Em seguida, transfira uma fatia para o suporte de fatias na câmara de registro, que é continuamente perfundida com A CSF oxigenado à temperatura ambiente.

Mergulhe o eletrodo de referência de cloreto de prata na câmara de fatias e conecte-o ao estágio de cabeçote com um clipe de jacaré. Fixe o microeletrodo de fibra de carbono ao micromanipulador e conecte-o ao estágio de cabeçote com um clipe de jacaré. Em seguida, posicione o eletrodo estimulador de tungstênio e o microeletrodo de fibra de carbono sobre a superfície da fatia cerebral sal.

O eletrodo estimulante será usado para aplicar um único pulso ou múltiplos pulsos de estimulação elétrica ao fragmento, a fim de provocar a liberação de neurotransmissores e medir a dopamina evocada eletricamente por meio da voltametria cíclica de varredura rápida ou FSCV, aplicando uma tensão em forma de onda triangular ao eletrodo. Mantenha o potencial do microeletrodo de fibra de carbono em menos 0,4 volts. Aumente-o até um limite positivo de 1,2 volts.

Em seguida, retorne-o para menos 0,4 volts com uma taxa de varredura de 400 volts por segundo. Estimule a fatia a cada cinco minutos e realize a medição volumétrica do FLX da dopamina resultante durante 15 segundos cada vez, após pelo menos três. Gravações estáveis de liberação de dopamina estimulada eletricamente definidas como menos de 10% de diferença entre as alturas dos picos.

Altere para a perfusão da fatia com um LCR contendo o agente farmacológico de interesse a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto durante 30 minutos para obter o efeito máximo semelhante ao registro basal. Realize a liberação elétrica de dopamina a cada cinco minutos durante a perfusão farmacológica. A Figura A é um exemplo da medição da liberação de dopamina evocada eletricamente utilizando FSCV, após estimulação por pulso único no corpo estriado.

A figura B mostra um gráfico tridimensional de pseudocores que combina as informações dos rastros de corrente versus tempo e da voltametria cíclica de Graham. De forma semelhante, as figuras A e C mostram a liberação de dopamina induzida por um único pulso de estimulação elétrica no núcleo e na concha do núcleo accumbens, respectivamente, e os gráficos tridimensionais de pseudocores para o núcleo e a concha do núcleo accumbens são indicados nas figuras B e D, respectivamente. São apresentados aqui traços representativos após o corte ter sido tratado com um agente farmacológico por 30 minutos, seguido por estímulos de pulso único para induzir a liberação de dopamina no putâmen caudado.

Os agentes utilizados nos experimentos são quinol, metanfetamina e fator neurotrófico derivado do cérebro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar fatias coronais do cérebro de camundongo para obter e medir a dinâmica dopaminérgica pré-sináptica utilizando telemetria rápida e provavelmente.