Name: Derramando e executando um gel de proteína através da reutilização Cassetes comerciais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Aprenda a reutilizar cassettes de gel comerciais para preparar géis de poliacrilamida económicos em laboratório. Este método reduz custos e resíduos plásticos, permitindo armazenar géis a 4°C por várias semanas.

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Os autores agradecem ao Instituto Médico Howard Hughes para uma ciência UF para a concessão de Vida para AH

1. Preparando os cassetes <ol><li> Frente e verso limpo placas de um Nupage Invitrogen usado Novex cassete minigel, ou cassete minigel outro comercial. </li><li> Preparar ml aproximadamente 1-3 de epóxi de plástico e misturar bem de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Aplicar o epoxi para o bordo interior da placa frontal, onde as duas placas irá entrar em contacto quando a cassete é montado. </li><li> Deslizar um pedaço de papel de filtro ou de papelão através da fenda inferior da placa traseira, quando a montagem da cassete para evitar excesso de epóxi de selagem da abertura. Remover o papel de filtro, logo que as duas placas são montados. </li><li> Coloque grampos da pasta ao longo das bordas para uma perfeita vedação, e deixar que as cassetes sentar-se durante a noite para o epóxi para curar completamente. </li><li> Selar a fenda na parte inferior da placa traseira com fita isolante. </li></ol> 2. Verter o gel resolver <ol><li> Para um frasco de 125 ml braço lado, adicione o seguinte:2,25 ml de Tris-Base de Dados de 4X Resolving gel tampão de pH 8,70, 3,50 ml de acrilamida 30,8% / bisacrilamida, 3,25 ml de Tipo I de água grau reagente (GIR-H2O) para um volume total de 9 ml. </li><li> De-gás a solução durante 10 min, anexando o braço lateral do balão a um aparelho de vácuo, e colocando uma rolha invertido sobre o topo do frasco. </li><li> Transferir a 9 ml de isentos de gases solução para um tubo de centrífuga de 50 ml descartável de polipropileno e adicionar 30 uL de persulfato de ammounium 10% (EPA) e 6 uL de N, N, N ', N', N-tetrametiletilenodiamina (TEMED) e misturar bem agitando a solução para evitar a introdução de bolhas. </li><li> Imediatamente despejar a solução na cassete, permitindo que a correr para baixo do lado da cassete para evitar quaisquer bolhas de formar entre as placas de gel. Encher a cassete para cerca de 2 cm a partir da borda superior da placa (mais curto) da frente. </li><li> Suavemente adicionar 0,5 ml de 1-butanol saturado com 1X tampão de gel de resolução e deixar que o gel polimerizar durante 1horas. </li></ol> 3. Verter o gel de empilhamento <ol><li> Adicionar o seguinte para um balão de 125 ml braço lateral: 0,75 ml de 4X tampão Tris pH-empilhamento de bases de gel de 6,80, 0,40 ml de acrilamida 30,8% / bisacrilamida, 1,85 ml de O 2 IRG-H para um volume total de 3 ml. </li><li> De-gás a solução durante 10 min, como descrito no passo 2. </li><li> Enquanto a solução de gel de empilhamento é desgaseificação, despeje o 1-butanol saturado com 1X tampão de gel de Resolving a partir do topo do gel de resolução. Lavar o topo do gel resolver uma vez com O. 2-H IRG Decantar a água e usar um papel absorvente ou filtro Whatman para absorver qualquer líquido remanescente. </li><li> Remover 3 ml da sua solução desgaseif içada e adicionar 9 ul de APS 10% e 2 ul de TEMED e misturar bem. </li><li> Rapidamente despejar a solução na cassete, permitindo que a correr para baixo do lado da cassete até que seja perto da borda superior da placa frontal curta de gel. </li><li> Inserir um pente gel limpo no topo da cassete de gel,colocar um clipe de ligante sobre a cassete sobre o pente para manter no lugar. Deixe a gel de empilhamento polimerizar durante 1 hora para durante a noite. </li></ol> 4. Armazenar o gel <ol><li> Quando o gel foi completamente polimerizado, remover os grampos da pasta e colocar a cassete dentro de uma bolsa de calor-selável, plástico ou um saco de plástico re-selável. </li><li> Introduzir 20 ml de 1X tampão de gel de empilhamento que contém azida de sódio a 0,1% para a bolsa. </li><li> Sele a bolsa por 5 segundos e verifique se não existem vazamentos no saco. </li><li> Armazenar o gel a 4 ° C. </li></ol> 5. Preparação das amostras <ol><li> Num tubo de microcentrífuga de paredes finas, adicionar até 6,5 uL de amostra de proteína, 7,5 ul de tampão de amostra 2x Novex Tris-Glicina de SDS, 1 ul de 100 mM de ditiotreitol (DTT) e IRG-H2O (se necessário) para uma volume total de 15 uL. </li><li> Misturar a amostra em vórtice, e brevemente centrifugar a amostra para trazer o conteúdo para o fundo do tubo. </li> &lt;li&gt; desnaturar a amostra a 70 ° C durante 10 min. </ol> 6. Executando o gel <ol><li> Configure o aparelho de gel Novex. </li><li> Adicionar 200 ml de Tris-Glicina tampão de corrida que contém 500 uL de antioxidante Nupage para a câmara interior, e 300 ml de Tris-Glicina O tampão de corrida para a câmara exterior. </li><li> Carregar as amostras de proteína desnaturadas (15 uL) para os poços, utilizando uma carga de gel ponta da pipeta. </li><li> Executar o gel a 200 V durante 60-70 min. </li></ol> 7. A coloração do gel <ol><li> Remova a cassete do aparelho de gel e quebrar o selo epóxi por erguer as duas placas de gel de plástico separados utilizando uma faca de gel ou de uma espátula rígida. Cuidadosamente separar o gel a partir das placas, tendo o cuidado de não rasgar o gel. </li><li> Lavar o gel com IRG-H2O três vezes com agitação suave. </li><li> Corar o gel com Invitrogen SimplyBlue SafeStain durante 1 hora com agitação suave. </li><li> Decantar a solução de coloração edestain o gel com O. 2-H IRG </li></ol> 8. Limpando as gavetas <ol><li> Use uma espátula de metal para raspar ou descascar todo o epóxi sobre as cassetes para que possam ser reutilizadas. </li><li> Lava-se cada uma das placas de gel de plástico com uma solução de detergente suave, e lavar bem com água da torneira seguida por água destilada. </li></ol> 9. Os resultados representativos Devido epoxi irá formar uma vedação estanque a água, (Figura 1), as cassetes não irá vazar quando a solução é vertida em acrilamida-los. Além disso, as cassetes de gel pode ser facilmente aberto para recuperar o gel para a coloração, eo epóxi pode ser retirada das cassetes para permitir a sua continuação reutilização. Como mostrado na Figura 2, o gel mostra nítida separação de marcadores proteicos e bandas amostra adequada para a electroforese de proteínas de rotina. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Aplicaçãocatião de epoxi para selar cassetes minigel. Uma fina camada de epóxi é aplicada à extremidade de uma das cassetes antes da montagem. Para realçar o epóxi, que era falso-cor vermelha nesta imagem. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Separação de proteínas sobre um gel de SDS-Tris-glicina vertida usando re-utilizados cassetes minigel. SDS-PAGE foi realizada como descrito acima. Após electroforese o gel foi removido do cassete minigel, coradas em SimplyBlue SafeStain como por instruções do fabricante, e fotografados utilizando luz transmitida branco. Pista M contém SeeBlue Plus2 padrões pré-corados de proteína. Os pesos moleculares das proteínas em pista M são indicados no lado direito do gel em quilodaltons (kDa). As outras pistas mostram as proteínas a partir de um lisado limpo a partir de bactérias que expressam uma glutationa-S-transferase de proteínas (GST)-etiquetado. As proteínas são indicados os lavada a partir do ggrânulos lutathione antes da eluição da proteína GST-etiquetado.

<ol><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Raymond, S., Weintraub, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide+gel+as+a+supporting+medium+for+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis.</a> Science. 130, 711-711 (1959).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Eletroforese em gel de proteína é um método indispensável para laboratórios de biologia molecular mais. Minigels comercialmente disponíveis fornecer um elevado nível de conveniência, mas pode ser caro. Aqui nós mostramos como reutilizar as fitas minigel de uma popular marca de minigels disponíveis comercialmente. Este método retém a conveniência de ter uma fonte pronta de géis, mas a uma fracção do custo de minigels comercialmente disponíveis. Um passo chave neste processo está a aplicar a quantidade correcta de epoxi p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Invitrogen Nupage Novex Cassete minigel (1,0 mm) </td><td> Invitrogen </td><td> NC2010 </td><td> Disponível em 2, 5, 10, 12, 15 e os poços 2D </td></tr><tr><td> Epoxy plástico </td><td> Loctite </td><td> 108771 </td><td></td></tr><tr><td> Fita elétrica </td><td> Escocês </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 125 mL frasco braço lateral </td><td> Pyrex </td><td> 5360 </td><td></td></tr><tr><td> 4X Tris-Base Resolving tampão de gel </td><td></td><td></td><td> 1,5 M pH 8,7 Tris-base </td></tr><tr><td> acrilamida </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01065-500 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-acrilamida </td><td> Biomedicals MP, Inc. </td><td> 800173 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de acrilamida 30,8% </td><td></td><td></td><td> 30:0.8 acrilamida: bis-acrilamida em O 2-H IRG </td></tr><tr><td> APS 10% </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP179-25 </td><td> 0,1 g de persulfato de amónio em 1 ml IRG-H2O, preparado imediatamente antes da utilização </td></tr><tr><td> Temed </td><td> Organics Arcos </td><td> 138450500 </td><td></td></tr><tr><td> 1-butanol saturado com 1X tampão de gel de Resolving </td><td></td><td></td><td> 05:02 1-butanol a 1X tampão de gel de Resolving </td></tr><tr><td> 4X Tris-Base de Dados de tampão de gel de empilhamento </td><td></td><td></td><td> 1,5 M pH 6,8 Tris-base </td></tr><tr><td> Pente Gel </td><td> Invitrogen </td><td> NC3015 </td><td> 15 assim, 1,0 mm de espessura </td></tr><tr><td> Sealer Impulse </td><td> TEW aparelhos eléctricos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bolsa selável calor </td><td> Kapak / Scotchpak </td><td></td><td> 1 litro tamanho (6,5 &quot;x 8&quot;) </td></tr><tr><td> Gel de tampão de armazenamento </td><td></td><td></td><td> 1X tampão de gel de empilhamento com azida de sódio a 0,1% </td></tr><tr><td> Novex tampão de amostra SDS Tris-Glicina (2X) </td><td> Invitrogen </td><td> LC2676 </td><td></td></tr><tr><td> TDT </td><td> FisherBiotech </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> 10X tampão de corrida Tris-Gylcine </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td> 1L de estoque 10X: 29,0 g Tris-Base, 144,0 g Glicina, 10,0 g SDS </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td></td></tr><tr><td> Faca Gel </td><td> Invitrogen </td><td> EI9010 </td><td></td></tr><tr><td> SimplyBlue Seguro Mancha </td><td> Invitrogen </td><td> LC6065 </td&gt; <td></td></tr></tbody></table>

derramando e executando um gel de proteína através da reutilização cassetes comerciais

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

A avaliação de proteínas utilizando dodecil sulfato de sódio em gel de poliacrilamida a análise de electroforese (SDS-PAGE) é uma técnica comum utilizado por pesquisadores Bioquímica e Biologia Molecular 1-4. Para laboratórios que realizam análises diárias de proteínas, o custo de géis de poliacrilamida comercialmente disponível (~ $ 10/gel) pode ser considerável ao longo do tempo. Para reduzir este custo, alguns pesquisadores preparar seus próprios géis de poliacrilamida. Os métodos tradicionais de verter estes geles tipicamente utilizar equipamento especializado e placas de vidro de gel que podem ser caros e impede vertendo géis muitos e armazená-los para uso futuro. Além disso, a manipulação de placas de vidro durante a limpeza ou gel vertendo pode resultar em quebra acidental criar um risco de segurança, que pode impedir o seu uso em classes de laboratório de graduação. Nosso protocolo demonstra como colocar o gel de proteínas simultaneamente pela reciclagem Invitrogen Nupage cassetes Novex minigel, e ma baratariais comprado em uma loja da melhoria home. Este método económico e simplificado inclui uma forma de armazenar os géis a 4 ° C durante algumas semanas. Ao re-utilizando as cassetes de gel de plástico de géis disponíveis no mercado, laboratórios que funcionam géis de proteína freqüentes podem economizar custos significativos e ajudar o meio ambiente. Além disso, cassetes de gel de plástico são extremamente resistentes à quebra, o que os torna ideal para salas de aula de laboratório de graduação.

Nosso protocolo demonstra como colocar o gel de proteínas múltiplas em um momento de reciclagem Invitrogen Nupage cassetes Novex minigel e materiais baratos comprados em uma loja da melhoria home. Este método económico e simplificado inclui uma forma de armazenar os géis a 4 ° C durante algumas semanas. Ao re-utilizando as cassetes de gel de plástico de géis disponíveis no mercado, laboratórios que funcionam géis de proteína freqüentes podem economizar custos significativos e ajudar o meio ambiente.

Derramando e executando um gel de proteína através da reutilização Cassetes comerciais

A avaliação de proteínas por meio da análise de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) é uma técnica comum utilizada na bioquímica...

Meu nome é David Oppenheimer e trabalho no Departamento de Biologia da Universidade da Flórida. Comprar géis de poliacrilamida pré-montados para eletroforese rotineira de proteínas é conveniente porque você sempre pode ter géis disponíveis e prontos para uso. No entanto, géis comerciais podem ser caros se o seu laboratório realizar muitos géis.Além disso, géis comerciais são normalmente confeccionados em cassetas de plástico projetadas para serem descartadas após o uso, gerando assim resíduos plásticos que geralmente acabam em aterros sanitários. Hoje vamos mostrar como reutilizar essas cassetas de plástico para preparar seus próprios géis de poliacrilamida, que podem ser armazenados por semanas, fornecendo ao seu laboratório uma fonte de géis prontos de baixo custo para eletroforese rotineira de proteínas. Pronto, vamos começar.Prepare uma nova página limpa com Vitrogen, cassetes de gel mini Novak. Remova cerca de uma colher de chá de epóxi e misture completamente a solução com a ponta de uma pipeta. Quando terminar de misturar o epóxi, aplique-o na parte traseira da cassete frontal, onde a frente e a parte traseira entrarão em contato.Quando terminar de aplicar o epóxi, certifique-se de que não há interrupções na linha. Insira uma folha de papel com espessura aproximada à da abertura inferior e coloque a parte traseira da cassete por cima. Mova o papel para evitar que qualquer epóxi entre na abertura inferior do suporte.Recorte as bordas para obter um selo hermético e deixe o cassete em repouso durante a noite para uma cura completa. Para preparar o gel de resolução, adicione 2,25 mL do tampão para gel de resolução Forex triase com pH de 8,7 em um frasco com braço lateral. Em seguida, adicione 3,50 mL de acrilamida a 30,8%.Em seguida, adicione 3,25 mililitros de água destilada duas vezes para um volume total de nove mililitros. Desgaseifique a solução por 10 minutos. Quando a solução terminar de desgaseificar, retire nove mililitros da solução de acrilamida para um tubo de 50 mililitros com tampa laranja.Em seguida, adicione 30 microlitros de PS a 10% com seis microlitros de temid. Para iniciar o processo de polimerização, certifique-se de misturar bem antes de começar a despejar o gel de corrida. Certifique-se de cobrir a abertura inferior com fita isolante.Em seguida, despeje a solução dentro da cassete, permitindo que escorra pela lateral para evitar a formação de bolhas. Pare de despejar quando faltar cerca de um centímetro para o topo. Em seguida, despeje 0,5 mL de butanol saturado com tampão de gel de corrida 1x para cobrir completamente a parte superior.Prepare o gel de empilhamento da mesma forma que prepara o gel de corrida. Em um frasco com braço lateral, adicione o tampão do gel de empilhamento à base de tris Forex com acrilamida a 30,8% e o dobro de água destilada, perfazendo um volume total de três mililitros. Desgaseifique por 10 minutos e adicione nove microlitros de APS a 10% e dois microlitros de TEMED.E certifique-se de misturar bem após uma hora. O al. 1. Deixe o gel de resolução polimerizar em uma linha reta.Derrame cuidadosamente o al e enxágue o gel com água destilada duplamente. Remova a água e use papel absorvente para absorver qualquer líquido remanescente. Despeje rapidamente a solução do gel de empilhamento na cassete e preencha-a o máximo possível.Em seguida, insira cuidadosamente um pente para gel e use um clipe de papel grande para manter o pente no lugar. Deixe o gel repousar por uma hora até um dia para armazená-lo em um saco selável a quente. Despeje 20 mils de tampão de empilhamento 1x com 0,1% de azida de sódio. Sobre o saco completamente e certifique-se de que não haja vazamentos.Armazene o gel a quatro graus Celsius. Para preparar suas amostras de proteína, adicione uma quantidade apropriada de proteína em um tubo microcêntrifuga de parede fina. Aqui usamos 6,5 microlitros.Em seguida, adicione 7,5 microlitros do tampão amostral no vx trix glicina SCS. Em seguida, adicione 1 microlitro de DTT 100 milimolar e, se necessário, duplique a quantidade de água destilada para um volume total de 15 microlitros para desnaturar sua proteína. Incube suas amostras a 70 graus Celsius por 10 minutos.Monte o equipamento para gel e despeje 200 ml de tampão de eletroforese de tris-glicina 1x com 500 microlitros de antioxidante NewAge na câmara interna. Em seguida, despeje 300 ml de tampão de eletroforese de glicina 1x na câmara externa. Adicione cuidadosamente sua amostra proteica de 15 microlitros em um poço utilizando uma ponteira para carregamento de gel.Quando terminar de carregar suas amostras, execute o gel a 200 volts por 60 a 90 minutos. Quando iniciar a eletroforese, a proteína começará a migrar através do gel de poliacrilamida com base no tamanho. Proteínas menores correrão mais rápido do que proteínas maiores.Remova cuidadosamente o gel da cassete e lave o gel três vezes com água destilada duplamente por cinco minutos com agitação suave. Após a terceira lavagem, cora o gel com corante in vitro gin, azul seguro, e agite suavemente por uma hora. Descarte o corante residual e detenha o gel com água destilada duplamente.Se você deseja faixas mais curtas e escuras, deve executar o gel por um período de tempo mais curto. Mas, se deseja alongar as bandas, execute-o por mais tempo. Para remover o epóxi para que as cassete possam ser reutilizadas, use uma faca para gel e retire o epóxi restante.Hoje mostramos a você como reutilizar as cassetes de plástico que acompanham géis de poliacrilamida disponíveis comercialmente. É importante usar epóxi apropriado para plástico para selar as cassetes de gel. Além disso, utilize reagentes de alta qualidade e use sempre luvas ao manipular acrilamida não polimerizada.Obrigado e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos um método para separação eletroforética de proteínas usando poli-acrylimide eletroforese em gel (PAGE).

Separação eletroforética de proteínas

Neste vídeo, descrevemos a caracterização de complexos multiprotein (PPM) por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE). Em uma primeira dimensão, dialisadas lisados ​​celulares são separados por BN-PAGE para identificar PPM individual. Em uma segunda dimensão SDS-PAGE, PPM de interesse são subdivididos para analisar os seus constituintes por immunoblotting.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados ​​Celular

Membros do género Burkholderia são patógenos de importância clínica. Nós descrevemos um método para extração de proteínas bacterianas, usando ruptura mecânica, e eletroforese em gel 2-D para a análise proteômica subseqüente.

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