Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH

O objetivo geral deste procedimento é visualizar diretamente a hipóxia tecidual microrregional no córtex de camundongos in vivo. Isso é feito preparando primeiro uma janela craniana do crânio aberta em um camundongo anestesiado. Em seguida, o corante fluorescente é injetado por via intravenosa para marcar os vasos sanguíneos cerebrais.

Finalmente, é realizada concomitantemente à imagem de fótons da fluorescência intrínseca do NADH e da microvasculatura cortical marcada com fluorescência. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram hipóxia funcional em microrregiões do parênquima cerebral por meio da visualização da presença da forma reduzida de nicotinamida, o dinucleotídeo adenina. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como os eletrodos estilo Clark, é que ela oferece uma alta resolução especial sobre o grande campo de visão e também é menos invasiva.

Este método pode ser conduzido em um sistema padrão de duas fotos aplicado com dois canais fluorescentes. Olá, sou Steve Hurst, professor e presidente de microbiologia e imunologia da Universidade de Rochester, demonstrando que o procedimento hoje será o filho de Anita do Laboratório Kishka, bem como Oxana Paulka, professora assistente de pesquisa do meu laboratório, Dr.Kishka, que foi pioneiro na técnica de imagem NADH, não pode estar aqui hoje porque ele se mudou recentemente para a Alemanha. Depois de preparar o local cirúrgico com os instrumentos necessários que foram autoclavados ou desinfetados com etanol a 70% e o camundongo foi anestesiado com 5% de flúor, coloque-o em uma almofada de aquecimento e aplique uma máscara facial para fornecer 1,3 a 1,5% de flúor no ar.

Verifique o nível de anestesia realizando um beliscão de cauda. Em seguida, insira uma sonda retal e meça continuamente a temperatura corporal do animal durante todo o procedimento. Aplique gel lacrimal artificial nos olhos do rato para evitar que sequem.

Em seguida, retire o cabelo da cabeça e ambas as coxas aplique removedor de cabelo na coxa por dois minutos para remover o cabelo restante, a coxa será usada para oximetria. Por fim, desinfete o couro cabeludo com uma solução de iodopovidona a 10% e etanol a 70%. Para fazer uma janela craniana começando cinco milímetros mimada no crânio com uma tesoura.

Faça uma incisão no couro cabeludo e avance um centímetro. Mova a pele para os lados para expor o crânio Para remover as membranas na parte superior do crânio. Aplique solução de cloreto férrico a 10%.

Limpe o excesso de solução e raspe as membranas com um ângulo de 45 graus. Número cinco, pinças Usando um microscópio de dissecação, identifique a área de interesse. Aplique uma fina camada de cola rápida ao redor das bordas da janela da placa de cabeça.

Posicione a placa de cabeça de forma que a área de interesse fique exposta na janela e aplique uma leve pressão na placa de cabeça. Aplique uma pequena quantidade de cimento dental para polimerizar a cola rapidamente. Segure por 10 segundos enquanto a cola está polimerizando.

Aplique uma pequena quantidade de cola rápida nas bordas da janela para selar a placa da cabeça e o crânio. Em seguida, aparafuse a placa da cabeça ao suporte do animal sob o escopo de dissecação. Usando o micro torque dois conjunto de brocas a 6.000 RPM e a broca IRF 0 0 5.

Remova toda a cola extra do crânio e da placa da cabeça. Em seguida, ajuste a broca a mil RPM e comece a perfurar o crânio fazendo um círculo dentro da janela da placa da cabeça com um diâmetro de cerca de cinco milímetros. Use movimentos leves de varredura como se estivesse desenhando com um lápis muito macio.

Pare de perfurar a cada 20 a 30 segundos e use ar comprimido para remover a poeira óssea. À medida que a perfuração avança, uma toca é formada ao redor do crânio intacto no centro. Tome cuidado para não cutucar o crânio fino, mas certifique-se de que essa toca tenha uma espessura uniforme.

Além disso, tenha muito cuidado com os grandes vasos sanguíneos. Eles não devem ser comprometidos e, se possível, nem mesmo tocados Com uma pinça, retire o osso no centro da janela e aplique uma gota de líquido cefalorraquidiano artificial na janela. Usando o canto de um lenço Kim, limpe suavemente o líquido espinhal cerebral artificial usando um ângulo de 45 graus.

Número cinco, pinças. Localize uma região de dura-máter danificada ao longo da borda da janela e levante-a para removê-la. Se ocorrer sangramento, aplique uma gota de LCR artificial e aguarde de dois a três minutos para que o sangramento menor pare.

Em seguida, prepare 10 mililitros de aero de baixo ponto de fusão a 0,07% dissolvido no líquido cefalorraquidiano artificial. Leve os aeros derretidos à temperatura corporal. Limpe o excesso de líquido cefalorraquidiano artificial da superfície do cérebro.

Despeje o aeros na janela e cubra-o com uma lâmina de vidro. Em seguida, pressione o vidro suavemente para fazer contato entre o vidro e a placa da cabeça e aguarde de 10 a 20 segundos até que o aero esteja sólido. Usando uma pinça e lenços de papel macios, remova o excesso de aerodinâmica da tampa de vidro.

Coloque uma pequena quantidade de cola rápida ao redor do vidro para colá-lo na placa da cabeça. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de cimento dental para solidificar a cola para injetar na veia femoral. Vire o animal parcialmente para expor a parte interna da coxa esquerda.

Use fita adesiva para prender o animal. Nesta posição, aplique esfoliante anti-séptico e, em seguida, cem por cento de etanol na pele. Em seguida, faça uma incisão ao longo da coxa medial, do joelho até a síntese púbica.

Se necessário, separe os tecidos moles por dissecção romba. Encha uma seringa de um mililitro com 130 microlitros de vermelho Texas. Anexe uma nova agulha de calibre 30 e dobre-a cuidadosamente em um ângulo de 30 graus, mantendo o chanfro para cima.

Encha a agulha com Texas Red Solution sob um microscópio de dissecação, insira a agulha na veia femoral e injete cem microlitros de Texas red. Remova a agulha e pressione levemente a veia com gaze para estancar o sangramento. Feche a pele usando quatro pontos para monitoramento contínuo da saturação de oxigênio no sangue.

Coloque a sonda do oxímetro na coxa direita da qual os pelos foram removidos anteriormente. Para iniciar a geração de imagens, transfira o mouse preparado cirurgicamente para o estágio do microscópio. Tire uma foto inicial do local da janela craniana usando a iluminação de campo brilhante com ampliação de quatro x para usar como um mapa de referência para registro com maior ampliação para fótons.

Aumente o zoom na área de interesse usando uma ampliação de 10x. Selecione uma área de interesse nas camadas corticais. Um ou dois começam a registrar as séries temporais.

Recomendamos usar uma média de três a cinco quadros para aumentar a qualidade da imagem. Em seguida, induza a hipoxemia adicionando 50% de nitrogênio ao ar que o animal está respirando. Isso trará o nível de oxigênio para 10%Verifique a hipoxemia monitorando os dados do oxímetro.

Continue a registrar a série temporal por meio da hipoxemia por cerca de 30 segundos e após o nível normal de oxigênio ser restaurado. Coletar dados para o cálculo da distribuição de oxigênio, detectando, medindo e quantificando a área de hipóxia e cilindros de tecido oxigenado ao redor dos vasos sanguíneos. Para determinar o raio do cilindro de tecido coaxado R, meça a distância entre o centro do vaso sanguíneo e o limite no qual a alta fluorescência de NADH é detectada.

Consulte o protocolo escrito para métodos de processamento de dados. Esta figura mostra imagens NADH e geografia simultâneas de vídeo gravadas durante a hipoxemia transitória, a concentração inspirada de oxigênio foi reduzida de 21% para 10% por um período de três minutos. Este nível de hipoxemia induzida experimentalmente é suficiente para induzir hipóxia grave no córtex cerebral.

A hipóxia levou a um aumento na fluorescência do NADH mostrada em verde inicialmente nas áreas mais distantes do suprimento sanguíneo arterial. Observe os limites nítidos do tecido NADH, que representam os limites observáveis do tecido da difusão de oxigênio da microcirculação cortical mostrados em vermelho. Aqui está uma imagem simultânea dos microvasos marcados com fluorescência do córtex em vermelho, e a fluorescência intrínseca do NADH da substância cinzenta do córtex em verde, a distribuição da intensidade de fluorescência do NADH é binária.

Existem áreas com fluorescência de NADH uniformemente baixa e áreas com fluorescência de NADH uniformemente alta. As linhas amarelas representam os limites do tecido entre as áreas com fluorescência de NADH baixa e alta. Esses limites de tecido exibem uma relação espacial com os microvasos próximos.

Essa relação é determinada pela difusão de oxigênio dos microvasos para o tecido. Em alguns casos, a natureza cilíndrica ou o cilindro de tecido CRO desses limites de tecido podem ser reconhecidos diretamente, conforme indicado pelas linhas azuis. Aqui, o limite do tecido é de forma circular com um vaso sanguíneo central concêntrico Uma vez dominado.

Esta técnica pode ser feita em 1,5 horas se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de colar a lamínula na placa de metal para evitar o movimento vertical da superfície cortical devido ao edema. Após esse procedimento, análises adicionais podem ser realizadas, como medidas de hiperemia funcional, com o objetivo de abordar questões adicionais, como a relação entre hipóxia tecidual e acoplamento cerebrovascular.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar a hipóxia tecidual microrregional no córtex de camundongos.