Name: Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda a detectar hipóxia microrregional no córtex cerebral de camundongos usando imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH. Esta técnica permite visualização em alta resolução do suprimento de oxigênio tecidual.

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Agradecemos ao Dr. Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) para o design da placa cabeça. O trabalho foi suportado por concessões do NIH para SD (R01DA026325 e P30AI078498 e subsídios da Fundação para o KK (DANA Cérebro fundação e programa Immunoimaging, American Heart Association 0635595T ea Associação ALS [# 1112)]).

1. Preparação do animal para imagiologia Nota: Nós usamos adultas camundongos C57BL. Diferentes linhagens transgênicas podem ser utilizados dependendo da questão de pesquisa. Cirurgias microvasculares e oximetria de pulso são facilitadas em camundongos com pele branca (por exemplo, estirpe FVB). <ol><li> Preparar o sítio cirúrgico na bancada. Todos os instrumentos cirúrgicos precisam de ser autoclavada ou desinfectado com etanol a 70%. </li><li> Inserir uma sonda rectal, e medir continuamente a temperatura corporal do animal ao longo do procedimento </li><li> Anestesiar o mouse utilizando inicialmente 5% isoflurano. Em 15-30 s, quando o animal não estiver em movimento, coloque-o sobre uma almofada de aquecimento (37 ° C), e aplicar uma máscara facial para o fornecimento contínuo de ar contendo 1,3-1,5% de isoflurano). Certifique-se que o animal não está respondendo a um estímulo da dor (por exemplo pitada cauda). </li><li> Use gel de lágrima artificial para cobrir os olhos do rato, para evitar a exposição ao ar seco. </li><li> Usando um barbeador elétrico, remova f cabelorom da cabeça e de ambas as coxas. Aplique removedor de pêlos (por exemplo, Nair) na coxa por 2 minutos, e, em seguida, limpe-a com cuidado para remover os pêlos restantes. Este coxa será usado para a oximetria. </li><li> Desinfectar o couro cabeludo usando um 10% de solução de povidona-iodo e etanol a 70%. </li></ol> 2. Preparação da janela aberta crânio craniana <ol><li> Começando 5 milímetros caudal do crânio, fazer uma incisão no couro cabeludo com uma tesoura, e avançar um centímetro. Mover pele para os lados para expor o crânio. </li><li> Para remover as membranas no topo do crânio aplicar solução de cloreto de 10% férrico para o topo do crânio. Limpe o excesso de solução, e raspe as membranas acabar com 45 ° de ângulo # 5 pinças. É importante para preparar o local com cuidado, de modo a assegurar que a placa de cabeça pode ser firmemente ligado ao crânio (passos # 4-6). </li><li> Usando um microscópio de dissecção, identificar a área de interesse. Note-se que as suturas cranianas deve ser evitado porque o crânio cuma quebra de forma imprevisível ao longo destas linhas. </li><li> Aplicar uma fina camada de cola rápida (por exemplo, locktite 454) em torno das bordas da janela da placa de cabeça (Figura 1). Posicionar a placa de cabeça de tal maneira que a área de interesse está exposta na janela. Aplique uma leve pressão sobre a placa de cabeça. Aplicar uma pequena quantidade de cimento dental para polimerizar a cola-se rapidamente. Mantenha por 10 segundos, enquanto a cola é polimerização. </li><li> Aplicar uma pequena quantidade de cola rápida para as bordas da janela para selar a placa de cabeça e do crânio. Aparafuse a placa de cabeça para o detentor de animais no âmbito da dissecção. </li><li> Usando o Microtorque broca II fixado em 6000 rpm e uma IRF broca 005, remover toda a cola extra do crânio e da placa de cabeça. Qualquer cola restante sobre a placa de cabeça deve ser removido, uma vez que, de outro modo interferir com a fixação da tampa de vidro. </li><li> Definir a broca a 1000 rpm, e iniciar a perfuração do crânio, fazendo um círculo dentro da janela de placa de cabeça, diâmetro ~ 5 mm. Use leves movimentos radicais como se você estivesse desenhando com um lápis muito macio. Pare de perfuração a cada 20-30 segundos para remover o pó de osso que usa ar comprimido. Nota: A forma da abertura na placa de cabeça permite o acesso adicional para a broca (por cirurgião esquerda e destro), o que torna mais fácil para criar uma janela circular craniana. Além disso, os dois furos em forma de ímpares proporcionar o espaço necessário para inserir um eléctrodo de Clark-eléctrodo ou vidro-no tecido cerebral sob a janela do crânio para medições adicionais polarográficas ou electrofisiológico. </li><li> À medida que a perfuração progride, uma toca é formado em torno do crânio intacto no centro. Tenha cuidado para não picar através do crânio diluído, mas para fazer isso toca da mesma espessura. Tenha cuidado extra em torno de grandes vasos de sangue, que não deve ser comprometida e, se possível, nem sequer tocou. </li><li> Use uma "perna" de pinças # 3 para levantar ("flick off") do osso no centro da janela. Aplicar uma gota de artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) sobre a janela. </li><li> Wipe aCSF suavemente, utilizando um canto do papel de tecido mole (por exemplo, Kimwipe). Geralmente a dura-máter é danificado em um ou mais locais em torno da borda da janela. A partir de um destes locais, levante cuidadosamente e depois remover a dura-máter a partir da superfície do cérebro, utilizando pinças 45 ° ângulo # 5. Ao escolher o local em que começar a remover a dura-máter, evitar as áreas adjacentes às grandes vasos sanguíneos. Se ocorrer sangramento, aplicar uma gota de aCSF e esperar por 2-3 min para o sangramento menor para parar. </li><li> Preparar 0,07% de agarose de baixo ponto de fusão dissolvido em aCSF) Traga a agarose fundida à temperatura do corpo. Enxugar o excesso de aCSF a partir da superfície do cérebro. Despeje a agarose na janela, e cubra com uma lâmina de vidro. Pressione o vidro suavemente para fazer um contacto entre o vidro ea placa de cabeça, e esperar 10-20 seg até que a agarose é sólido. </li><li> Remover o excesso de agarose a tampa de vidro, usando uma pinça e papel de tecido mole. </li><li> Coloque uma pequenaquantidade de cola rápida em torno do vidro para colar o vidro para a placa de cabeça. Aplicar uma pequena quantidade de cimento dental para solidificar a cola (Figura 1). </li></ol> 3. A injeção intravenosa e monitorização da oxigenação arterial Nota: Foram utilizados rotineiramente na veia femoral para aplicação intravenosa de Texas Red, em vez de na veia da cauda. Isto é porque injecções na veia femoral fornecer injecções de bolus seguras e reprodutível do corante. <ol><li> Ligue o animal parcialmente sobre a expor o interior da coxa esquerda. Use fita adesiva para prender o animal nesta posição. </li><li> Aplicar esfrega anti-séptico e, em seguida etanol a 100% para a pele. </li><li> Faça uma incisão ao longo da coxa medial do joelho até a sínfise púbica. Separados tecidos moles por dissecção romba, usando uma pinça # 5. </li><li> Encher seringa de 1 ml com 130 uL de Texas Red (2,5 mg / ml). Coloque uma nova agulha (calibre 30), e dobre-o cuidadosamente a 30 °, mantendo o bisel para cima. Preencha o wi agulhath Texas Red solução. </li><li> Sob um microscópio de dissecção, inserir a agulha na veia femoral e injectar 100 uL de Texas Red. Remova a agulha e pressione levemente a veia com uma gaze para parar o sangramento. </li><li> Feche a pele usando sutura 4-0. </li><li> Para o monitoramento contínuo de sangue SpO 2 (para garantir a oxigenação adequada do sangue) coloque a sonda do oxímetro na coxa direita (de que o cabelo foi previamente removido). </li></ol> 4. Dois fótons de imagem Nota: Nós usamos uma Olympus Fluoview1000 multifotônica sistema de imagem (vertical) com um Spectra-Physics Maitai HP femtosegundo DeepSee Ti: Sa laser como uma fonte de excitação. Para imagem, usamos × 10 NA 0,45 (Zeiss C Apochromat-), ou × 25 NA 1,05 (Olympus XLPlan N) imersão em água objectivos. Tomamos imagens em 12-bit de profundidade em uma resolução de 512 × 512 pixels com um pixel tempo de permanência de 2 mS. O NADH e Texas-Vermelho-dextran são simultaneamente excitado a 740 nm, e fluorescence é separada da luz de excitação utilizando um espelho dicróico / perto-IR-bloqueio combinação de filtro (FF665-DI01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, EUA), dividido em dois canais utilizando um espelho dicróico (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, EUA), e passa-banda filtrada (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Laser de energia medido após o objectivo era 10-20 mW para imagens em camada I e 20-50 mW para a imagem latente na camada II. <ol><li> Transferir o rato cirurgicamente preparado para a fase de microscópio. Tome uma visão inicial do site janela craniana com uma iluminação de campo claro com ampliação de 4x para usar como um mapa de referência para o registro com maior ampliação de dois fótons angiografias. </li><li> Amplie a área de interesse utilizando magnificação de × 10. Seleccionar uma área de interesse, em camadas corticais I ou II (até 150 um abaixo da superfície pial). Se ampliação maior for desejado, utilizar × 25 objectivo </li><li> Iniciar gravar a série temporal (Figurasre 2). Sugerimos utilizando uma média de 3-5 quadros para aumentar a qualidade da imagem. </li><li> Induzir hipoxemia adicionando N2 50% para o ar que o animal está respirando. Isto trará o nível de O2 a 10%. Verifique hipoxemia através do monitoramento de dados do oxímetro. </li><li> Continuar a gravar a série tempo através de hipoxemia (por exemplo, durante 30 segundos) e, após o nível de O2 normal é restaurado. </li><li> Recolher dados para o cálculo da distribuição de oxigénio através da detecção, medição e quantificação da área de cilindros de tecido hipóxia e oxigenado em torno dos vasos sanguíneos. </li></ol> 5. Informática <ol><li> Determinar o cilindro de tecido Krogh raio R. Isto pode ser feito manualmente (Figura 3) através da medição da distância entre o centro do vaso sanguíneo e do limite em que a fluorescência de NADH elevada for detectada. </li><li> Alternativamente, use o computacional investigador independente determinação semi-automatizada do raio R tecido cilindro eo blo Centralod r vaso que foi descrito anteriormente 1 em forma complementar e resumidos na secção discussão deste protocolo. </li><li> Determinar a área de hipóxia usando open-access software de análise de imagem, por exemplo, ImageJ. Para fazer isso, usar o sinal de NADH, definir um limite que delineia a área de alta intensidade NADH e, em seguida medir a área com fluorescência elevada tecido NADH. </li></ol> 6. Os resultados representativos A Figura 2 mostra um vídeo de NADH / angiografia imagens durante a hipoxemia transitória (para a versão em PDF desta Figura, selecionadas imagens estáticas foram usados). A concentração de oxigénio inspirado foi diminuída de 21% a 10% durante um período de 3 min. Este nível de hipoxemia induzida experimentalmente é suficiente para induzir hipóxia grave no córtex cerebral. Hipóxia conduziu a um aumento na fluorescência de NADH, inicialmente nas superfícies que são mais afastada do fornecimento de sangue arterial. Observe o tecido NADH afiadafronteiras, que representam limites de tecido observáveis ​​de difusão de oxigênio da microcirculação cortical. A imagem da Figura 3 mostra a geometria dos limites de oxigénio de difusão circundantes vasos cerebrais. É possível deduzir Krogh diâmetros dos cilindros a partir destes limites, tal como descrito anteriormente 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) do rato com a janela craniana preparado para geração de imagens. (B) Dimensões da placa de cabeça. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Endógena NADH fluorescência verde visualizado com dois fotões de imagem através da janela craniano, aproximadamente 50 um abaixo da superfície pial. Os vasos sanguíneos são visualizados com Texas Red dextrano. Oxigénio no ar inalado foi reduzida para 10% durante 3 min, e então restaurado para 21%. Barra de escala: 50 ìm. &lt;img alt = "Figura 3" src = "files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg /" /&gt; Figura 3. Geometria do NADH limites de fluorescência. Contorno amarelo mostra limite de hipóxia funcional; círculos azuis mostram projetadas oxigenados (Krogh) cilindros. As linhas azuis mostram raios cilindro; números mostram raios em micrômetros.

<ol><li>Kasischke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+NADH+imaging+exposes+boundaries+of+oxygen+diffusion+in+cortical+vascular+supply+regions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood.+Flow.+Metab%22%5BJournal%5D)">Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).</li>
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<li>Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+theoretical+studies+of+oxygen+gradients+in+rat+pial+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood.+Flow.+Metab%22%5BJournal%5D)">Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Informações de alta resolução espacial sobre a difusão do oxigênio é importante para entender como o fluxo de sangue no cérebro é regulado para fornecer oxigênio para as células cerebrais, e para atender à demanda metabólica. Tradicionais medições de oxigênio polarografia utilizando eletrodos de Clark estilo de vidro são altamente invasivos e têm baixa resolução espacial 2-3 e tempo de resposta significativa (segunda faixa). Até agora, o método não invasivo apenas para medir a pO 2 no tecido cerebral é têmpera fosforescência, onde a taxa de decomposição da sonda animado é proporcional à concentração de oxigénio 4. Este método proporciona concentrações de oxigênio precisos, mas requer um corante de propriedade e um sofisticado sistema de imagens tecnicamente fosforescência vida. Aqui, nós demonstrar uma abordagem direta e simples que podem ser realizados em um sistema de imagem padrão de dois fótons com dois canais flurescence. Nossa abordagem tira proveito de um sinal de tecido intrínseco 5 and só requer visualização contrastante da microcirculação cortical. Devido ao aumento não-linear, essencialmente binária de NADH fluorescência a funcionalmente limitando concentrações de oxigénio 1, o aumento da fluorescência intrínseca NADH é observada apenas em áreas com significativo, hipoxia metabolicamente limitante. Uma implicação importante é que os limites de tecido de difusão de oxigênio a partir de microvasos corticais são diretamente observáveis ​​por mudanças de intensidade de fluorescência de forma cilíndrica NADH endógeno. Referimo-nos a estas estruturas como as garrafas de Krogh, porque o conceito de estruturas de forma cilíndrica que definem o volume oxigenado de tecido circundante de um vaso sanguíneo foi introduzido por agosto Krogh e foi recentemente observada experimentalmente usando dois fotões NADH imagem 1. Imagens cilindros Krogh podem ser coletadas em 3D, tendo uma pilha z-de quadros de imagem. Eles são especialmente proeminente na vizinhança das arteríolas penetrantes e eles são wit congruenteh capilar esgotados cilindros 1,4 tecidos periarteriolares. Para proporcionar uma determinação objectivo do raio R Krogh tecido do cilindro (ver Secção 5.2) foram medidos os seus valores de intensidade de pixel radiais dentro de um segmento bem definida entre o centro do cilindro e do limite exterior usando a função de Matlab &quot;improfile&quot;. O limite exterior do segmento deve ser escolhido para estender com uma margem de segurança para além do limite visível. Para melhorar o nível de sinal-para-ruído que averageed sobre todas as linhas radiais necessários para cobrir o segmento de cilindro visível em passos de 1 °. O resultante perfil de intensidade média radial dentro do segmento exibiram um aumento acentuado que correspondia ao R visível do tecido de limite. O que se encaixam uma função sigmoidal (por exemplo, a função de Boltzmann) para o perfil de intensidade média radial e utilizou o seu ponto de inflexão (também conhecido como x 0) como uma definição de R. O correspondente dois-pHoton microangiography (Texas-vermelho) revelou a secção transversal de um vaso sanguíneo central solitário no centro do cilindro. O diâmetro do vaso sanguíneo central pode ser aplicada directamente para determinar r. Dois fótons NADH imagem fornece a mesma resolução espacial que a imagem de alta resolução simultânea do microangiography cortical. Uma característica importante para a aplicação quantitativa deste método é que p 50 do aumento de fluorescência de NADH foi medido como sendo de 3,4 ± 0,6 mm Hg 1 e que a intensidade de fluorescência de NADH como uma função do tecido microrregional pO 2 pode ser descrito matematicamente com uma função sigmoidal. . Nós mostramos que esta técnica permite um para identificar áreas do cérebro que são mais vulneráveis ​​a hipoxia (diminuindo o teor de oxigénio no ar a 10%). Mostramos também que a difusão do oxigênio segue um padrão perivascular geométrica simples. Um critpasso ical para este método é a qualidade da preparação janela craniana. A cirurgia deve produzir danos mínimos de modo a não perturbar o fluxo sanguíneo para a área exposta. Uma preocupação é que, em uma preparação cirurgicamente comprometida, o córtex sob a janela pode ser hipóxico para começar, impedindo qualquer experiências significativas. Uma janela bem preparado craniana deve ter intactas vasos sangüíneos maiores e menores, com fluxo de sangue vivo em todos os tipos de navios e sem sangramento significativo ao longo das bordas. Sob condições de normóxia (PaO2 mmHg 80-100, Sp O2 97-99%), o parênquima cerebral deve apresentar uniforme, homogênea, sem fluorescência NADH conspícuos, retalhos de tecidos brilhantes com fluorescência NADH elevada. A restrição física fundamental de nossa abordagem é limitada profundidade de penetração. O azul-verde de fluorescência de NADH no cérebro é rapidamente atenuada pela absorção de hemoglobina e de espalhamento do tecido a estes comprimentos de onda. Mesmo com abertura numérica elevada de água (por exemplo, 1,05)objetivas de imersão de dois fótons NADH imagem está actualmente limitada a cortical camadas I e II. Esta limitação é cientificamente relevante porque o metabolismo da energia no, ou em proximidade à matéria branca provavelmente diferem de matéria cinzenta. No entanto, a investigação de profundas estruturas corticais tais como camadas IV-VI ou estruturas subcorticais tais como tratos de substância branca ou o corpo estriado exigiria a utilização de microlentes especializadas, tal como descritos no córtex do rato in vivo 6. NADH baseado medição dos limites de difusão de oxigénio pode ser especialmente útil quando combinado com outras medições, tais como as análises de hiperemia funcional, e detecção de taxas de fluxo capilar 7. Por exemplo, esta técnica pode ser adaptado para visualizar hipoxia em acidente vascular cerebral e doença de Alzheimer (AD) modelos. A geometria simples de difusão de oxigénio permite prever o gradiente de oxigénio em leitos microvasculares em circunstâncias em que a densidade capilar é devincado 8 (por exemplo, AD 9) e para examinar se as regiões cerebrais de tecido com densidade capilar reduzida estão em risco aumentado de dano devido à hipóxia microstrokes. A capacidade de imagem microregionally também permite que um para examinar a geometria e tamanho de microstrokes de tecido e de determinar o volume de tecido no qual ocorre a hipóxia, bem como a relação entre a hipóxia tecidual e subsequente morte neuronal ou remodelação capilar 10. Finalmente, uma vez que aumentos de fluorescência NADH endógeno são a conseqüência direta da disfunção mitocondrial aguda, esse método cria a oportunidade de usar imagens de NADH como repórter específico para o metabolismo de energia neural 11 e um proxy para a disfunção mitocondrial. Em conclusão, dois fotões de imagem de fluorescência de NADH endógena é uma ferramenta simples, pouco exigente que pode ser usado para compreender a entrega de oxigénio eo consumo no cérebro sob tanto normaise nos estados patológicos.

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Almofadas de aquecimento </td><td> Além de calor Bodi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pomada oftálmica (lágrimas artificiais) </td><td> Pfizer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Povidona-iodo solução a 10% </td><td> Betadine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solução de cloreto férrico a 10% </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cimento </td><td> Stoelting Empresa </td><td> 51456 </td><td></td></tr><tr><td> 454 cianoacrilato </td><td> Loctite </td><td></td><td></td></tr><tr><td> aCSF </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 597316 </td><td></td></tr><tr><td> Microtorque II handpiece kit </td><td> Pearson </td><td> R14-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Broca IRF 007 bits de </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 19008-07 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps # 5 </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11295 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps # 5/45 </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> # 0 lamela de vidro </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 63750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo fotomultiplicador </td><td> Hamamatsu </td><td> HC125-02 </td><td></td></tr><tr><td lang="it-IT" xml:lang="it-IT"> Ti: Sapphire laser de Mai-Tai </td><td> Spectra Physics- </td><td> &amp;nbsp; </td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de hipóxia microrregional no cortex cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena nadh

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

A capacidade do cérebro para funcionar a níveis elevados de demanda metabólica depende de suprimento contínuo de oxigênio através do fluxo sanguíneo e difusão de oxigênio nos tecidos. Aqui nós apresentamos um protocolo experimental visualizados e metodológico para visualizar diretamente hipóxia tecidual microrregional e inferir gradientes de oxigênio perivasculares do córtex mouse. Baseia-se a relação não linear entre dinucleótido adenina nicotinamida (NADH) intensidade de fluorescência endógena e da pressão parcial de oxigénio no tecido, onde o tecido observadas NADH fluorescência aumenta abruptamente a níveis de tecidos de oxigénio abaixo de 10 mmHg 1. Nós usamos dois fótons excitação a 740 nm que permite a excitação concomitante de fluorescência intrínseca tecido NADH e plasma sanguíneo em contraste com Texas Red-dextran. As vantagens deste método sobre as abordagens actuais incluem o seguinte: leva vantagem de um sinal de tecido intrínseca e pode ser realizada usando o padrão de dois fotões in vivo imenvelhecimento equipamento, que permite a monitorização contínua em todo o campo de visão com uma resolução de profundidade de aproximadamente 50 um. Nós demonstramos que as áreas cerebrais de tecido mais afastadas dos vasos sanguíneos cerebrais correspondem a áreas de mananciais vulneráveis ​​que são os primeiros a tornar-se funcionalmente hipóxica após um declínio na oferta de oxigênio vascular. Este método permite a oxigenação imagem microrregional cortical e, portanto, útil para examinar o papel da alimentação inadequada ou restrito de oxigênio nos tecidos em doenças neurovasculares e derrames.

Aqui nós descrevemos um método para visualizar diretamente hipóxia tecidual microrregional no córtex do rato<em&gt; In vivo</em&gt;. Baseia-se na imagem de dois fotões concomitante de dinucleótido adenina nicotinamida (NADH) e da microcirculação cortical. Este método é útil para a análise de alta resolução de fornecimento de oxigénio do tecido.

Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH

A capacidade do cérebro de funcionar em níveis elevados de demanda metabólica depende do suprimento contínuo de oxigênio através do fluxo sanguíneo e da difusão de oxigênio nos tecidos. ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar diretamente a hipóxia tecidual microregional no córtex de camundongos in vivo. Isso é realizado primeiramente preparando uma janela craniana com crânio aberto em um camundongo anestesiado. Em seguida, um corante fluorescente é injetado por via intravenosa para marcar os vasos sanguíneos cerebrais.Por fim, realiza-se simultaneamente a imagem de fótons da fluorescência intrínseca do NADH e da microvasculatura cortical marcada com fluoróforo. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram hipóxia funcional em micro-regiões do parênquima cerebral mediante a visualização da presença da forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleotídeo. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como os eletrodos do tipo Clark, é que ela fornece uma alta resolução espacial em um amplo campo de visão e também é menos invasiva.Este método pode ser realizado em um sistema fotográfico padrão aplicado com dois canais fluorescentes. Olá, sou Steve Hurst, professor e chefe do departamento de microbiologia e imunologia da Universidade de Rochester, e demonstrando o procedimento hoje estará o filho de Anita do Laboratório Kishka, bem como Oxana Paulka, professora assistente de pesquisa do meu laboratório. O Dr. Kishka, que foi pioneiro na técnica de imagem de NADH, não pode estar aqui hoje porque se mudou recentemente para a Alemanha. Após preparar o local cirúrgico com os instrumentos necessários, que foram autoclavados ou desinfetados com etanol a 70%, e anestesiar o camundongo com isoflurano a 5%, coloque-o sobre uma almofada aquecida e aplique uma máscara facial para fornecer isoflurano entre 1,3 e 1,5% no ar.Verifique o nível de anestesia realizando uma pinça na cauda. Em seguida, insira uma sonda retal e meça continuamente a temperatura corporal do animal durante todo o procedimento. Aplique gel lacrimal artificial nos olhos do camundongo para evitar que sequem.Em seguida, remova os pelos da cabeça e de ambas as coxas; aplique removedor de pelos na coxa durante dois minutos para remover os pelos remanescentes, pois a coxa será usada para oximetria. Por fim, desinfete o couro cabeludo utilizando uma solução de poviodona-iodo a 10% e etanol a 70%. Para fazer uma janela craniana, comece cinco milímetros afastado do crânio com uma tesoura.Feche um corte no couro cabeludo e avance um centímetro. Afaste a pele para os lados para expor o crânio. Remova as membranas localizadas na parte superior do crânio. Aplique uma solução de cloreto férrico a 10%.Remova a solução em excesso e raspe as membranas com um ângulo de 45 graus. Passo cinco, pinça: usando um microscópio de dissecação, identifique a área de interesse. Aplique uma camada fina de cola rápida ao redor das bordas da janela da placa craniana.Posicione a placa craniana de modo que a área de interesse fique exposta na janela e aplique uma leve pressão sobre a placa craniana. Aplique uma pequena quantidade de cimento dental para polimerizar rapidamente a cola. Mantenha por 10 segundos enquanto a cola estiver polimerizando.Aplicar uma pequena quantidade de cola rápida nas bordas da janela para selar a placa craniana e o crânio. Em seguida, parafusar a placa craniana ao suporte do animal sob o microscópio de dissecação. Utilizar o microtorno com conjunto de brocas ajustado a 6.000 RPM e a broca IRF 0 0 5.Remova toda a cola extra do crânio e da placa craniana. Em seguida, ajuste o torno para mil RPM e comece a furar o crânio fazendo um círculo dentro da janela da placa craniana com um diâmetro de cerca de cinco milímetros. Use movimentos leves e amplos, como se estivesse desenhando com um lápis muito macio.Interrompa a perfuração a cada 20 a 30 segundos e use ar comprimido para remover a poeira óssea. Conforme a perfuração avança, um sulco é formado ao redor do crânio intacto no centro. Tenha cuidado para não perfurar o crânio fino, mas certifique-se de que esse sulco tenha espessura uniforme.Além disso, tenha cuidado redobrado em torno de vasos sanguíneos grandes. Eles não devem ser comprometidos e, se possível, nem mesmo tocados. Com uma das pontas de uma pinça, levante o osso no centro da janela e aplique uma gota de fluido cerebroespinhal artificial sobre a janela. Usando o canto de um lenço de papel Kim, limpe suavemente o fluido cerebroespinhal artificial com um ângulo de 45 graus.Número cinco, pinça. Localize uma região de dura-máter danificada ao longo da borda da janela e levante-a para removê-la. Se houver sangramento, aplique uma gota de LCR artificial e aguarde dois a três minutos para que o sangramento leve cesse.Em seguida, prepare 10 mililitros de aero de baixo ponto de fusão a 0,07% dissolvido em fluido cerebroespinhal artificial. Aqueça o aero fundido até a temperatura corporal. Remova o excesso de fluido cerebroespinhal artificial da superfície do cérebro.Despeje o aerogel na janela e cubra-o com uma lâmina de vidro. Em seguida, pressione suavemente a lâmina para garantir o contato entre o vidro e a placa de base e aguarde de 10 a 20 segundos até que o aerogel solidifique. Com o auxílio de pinças e papel toalha macio, remova o excesso de aerogel da lamínula de vidro.Coloque uma pequena quantidade de cola rápida ao redor do vidro para colá-lo à placa craniana. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de cimento dental para solidificar a cola antes da injeção na veia femoral. Vire parcialmente o animal para expor a parte interna da coxa esquerda.Use fita adesiva para imobilizar o animal. Nessa posição, aplique uma solução antisséptica e, em seguida, etanol a cem por cento na pele. Em seguida, faça uma incisão ao longo da coxa medial, do joelho até a sínfise púbica.Se necessário, separe os tecidos moles por dissecação romba. Encha uma seringa de um mililitro com 130 microlitros de Texas red. Acople uma nova agulha de 30 graus e dobre-a cuidadosamente em um ângulo de 30 graus, mantendo o bisel para cima.Encha a agulha com a Solução Texas Red sob um microscópio estereoscópico, insira a agulha na veia femoral e injete cem microlitros de Texas Red. Remova a agulha e pressione levemente a veia com gaze para estancar o sangramento. Feche a pele usando sutura 4-0 para monitoramento contínuo da saturação de oxigênio no sangue.Coloque a sonda do oxímetro na coxa direita, da qual o pêlo foi previamente removido. Para iniciar a imagem, transfira o camundongo cirurgicamente preparado para a platina do microscópio. Tire uma imagem inicial do local da janela craniana utilizando iluminação em Campo Claro com ampliação de quatro vezes para usar como mapa de referência para o registro com maior ampliação e captura de fótons.Aproxime a área de interesse usando ampliação de 10 x. Selecione uma área de interesse nas camadas corticais. Um ou dois começam a registrar a série temporal.Recomenda-se utilizar uma média de três a cinco quadros para aumentar a qualidade da imagem. Em seguida, induza hipoxemia adicionando 50% de nitrogênio ao ar que o animal está respirando. Isso reduzirá o nível de oxigênio para 10%. Verifique a hipoxemia monitorando os dados do oxímetro.Continue registrando a série temporal durante a hipoxemia por cerca de 30 segundos e após a restauração do nível normal de oxigênio. Colete dados para o cálculo da distribuição de oxigênio detectando, medindo e quantificando a área de hipóxia e os cilindros de tecido oxigenado ao redor dos vasos sanguíneos. Para determinar o raio R do cilindro de tecido croak, meça a distância entre o centro do vaso sanguíneo e o limite no qual é detectada alta fluorescência de NADH.Consulte o protocolo escrito para os métodos de processamento de dados. Esta figura mostra imagens simultâneas de NADH e geografia obtidas por vídeo durante hipoxemia transitória, na qual a concentração de oxigênio inspirado foi reduzida de 21% para 10% por um período de três minutos. Esse nível de hipoxemia induzida experimentalmente é suficiente para provocar hipóxia grave na córtex cerebral.A hipóxia levou a um aumento na fluorescência de NADH, mostrada inicialmente em verde nas áreas mais distantes do suprimento sanguíneo arterial. Observe os limites nítidos do tecido com NADH, que representam os limites visíveis da difusão de oxigênio a partir da microcirculação cortical, mostrada em vermelho. Aqui está uma imagem simultânea dos microvasos rotulados fluorescentemente no córtex em vermelho e da fluorescência intrínseca de NADH da substância cinzenta do córtex em verde; a distribuição da intensidade da fluorescência de NADH é binária.Existem áreas com fluorescência de NADH uniformemente baixa e áreas com fluorescência de NADH uniformemente alta. As linhas amarelas representam os limites teciduais entre as áreas com fluorescência baixa e alta de NADH. Esses limites teciduais exibem uma relação espacial com os microvasos próximos.Essa relação é determinada pela difusão de oxigênio dos microvasos para o tecido. Em alguns casos, a natureza cilíndrica ou o cilindro tecidual CRO desses limites teciduais pode ser diretamente reconhecida, conforme indicado pelas linhas azuis. Aqui, o limite tecidual possui formato circular com um vaso sanguíneo central concêntrico, uma vez dominado.Essa técnica pode ser realizada em 1,5 hora se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de colar o lamínula à placa metálica para evitar o movimento vertical da superfície cortical devido ao edema. Após este procedimento, análises adicionais podem ser realizadas, como medições de hiperemia funcional com o objetivo de responder a questões adicionais, tais como a relação entre hipóxia tecidual e acoplamento cerebrovascular.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como visualizar a hipóxia tecidual microregional no córtex de camundongos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Um método para 2-Photon Imagens de Fluxo de Sangue no neocórtex através de uma janela Cranial

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NADH Fluorescência de Imagem biventricular isolado de coelho

Source:&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/53582/quantificação-da-arquitetura-vascular-cerebral-usando-microscopia-de-dois-fótons-em-um-modelo-de-camundongo-de-neuroinflamação-induzida-por-HIV'&gt; Nishimura, C. et al. Quantificação da Arquitetura Vascular Cerebral usando Microscopia de Dois Fótons em um Modelo de Camundongo de Neuroinflamação Induzida pelo HIV. J. Vis. Exp. (2016). Este vídeo demonstra a visualização in vivo de capilares corticais no cérebro de...

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