Name: Anotação da função do gene da planta através de Genômica combinados, metabolômica e Informática (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a anotar funções gênicas em plantas através de genômica combinada, metabolômica e bioinformática. Este método integra perfilamento de metabolitos e análise de co-expressão para identificar genes candidatos em vias metabólicas.

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Agradecemos ao Prof Kazuki Saito em RIKEN PSC e Bjoern Dr. Usadel em MPIMP para discussões úteis. TT é apoiado por uma bolsa da Fundação Alexander von Humboldt.

1. Preparação da Amostra <ol><li> Materiais de plantas são colhidas e imediatamente congelados. </li><li> Materiais vegetais congelados são pulverizados por moinho misturador (ou argamassa) e armazenados em Falcon tubo ou tubo Eppendorf a -80 ° C. </li></ol> 2. Extração de perfil metabólico <ol><li> Aliquota congelada material de planta em um tubo Eppendorf 2 ml. </li><li> Adicionar 5 uL de tampão de extracção por miligrama de peso fresco de material vegetal congelado. </li><li> Adicionar um metal (ou gilconia) bola e homogeneizar de pó congelado com o moinho oscilante durante 2 min a 25 ls @ 1. </li><li> Centrifugar 10 min a 12.000 rpm. </li><li> Transferir o sobrenadante para NANOSEP filtro centrífugo. </li><li> Centrifugar 2 min a 4.000 rpm. </li><li> Transferir o sobrenadante para novo tubo Eppendorf, e armazenar a -20 ° C até à utilização. </li></ol> 3. Perfil metabólico por LC-MS <ol><li> Configure HPLC e verificar a temperatura do forno da coluna e bandeja de amostra. </li><li> Configure condição MS e verificar o estado de vácuo e aquecimento capilar. </li><li> Realizar m / z calibração do detector de MS. </li><li> Transferência de 50 uL de extractos de frasco de vidro para LC-MS. </li><li> Injectar 5 uL de extractos de LC-MS. </li></ol> 4. Análise de Dados <ol><li> Configurar Xcalibur ou Metalign 4 e seleccionar a análise dos dados a serem processados. </li><li> Prepare uma tabela de picos detectados de seu interesse, de acordo com classe de compostos na Tabela I. </li><li> Identificar os picos por co-eluição de compostos padrão. </li><li> Anotar detectados picos usando MS análise 2, pesquisa bibliográfica, pesquisa de banco de dados metabolito (Figura 2, 12,13). </li></ol> 5. Previsão da via metabólica <ol><li> Construir um caminho possível com compostos detectados. Predição da via usando anotações pico deve basear-se na estrutura química do composto detectados, prevendo ligando funções enzimáticas da via metabólica 13. Etapas biossintéticas estruturantes devem ser conduzidas com anotação de pico precisa. Mas a determinação da estrutura química detalhada, por exemplo porção de açúcar, não é indispensável, neste passo, porque a predição de porção de açúcar e posição aduzido é muito difícil identificar por análise de MS. Determinação do tipo de açúcar, tais como hexoside e pentoside será identificada pelo ensaio enzimático de dador de açúcar no último passo de projecto. Principalmente construção de predição da via deve ser realizado como molécula pequena é intermediário de molécula maior, excepto nos casos alguns tais como reacção de desidratação. Lista de peso molecular atómica, por exemplo 16 m / z para diferença entre-H e-OH porção (oxidação), 14 m / z (átomo de carbono) para a diferença entre-OH e-OMe (metilação) e 162 m / z ( MW-H2O) para hexose (glicosilação), é útil para a predição. Determinação dotipo de modificação com a análise de correlação de especificidades tecidos ajuda a previsão da via metabólica. Banco de dados da via metabólica geral, tais como KEGG banco de dados ( <a href="http://www.genome.jp/kegg/" target="_blank">http://www.genome.jp/kegg/</a> ) e PlantCyc ( <a href="http://plantcyc.org/" target="_blank">http://plantcyc.org/~~V</a> ), é muito eficaz para a previsão de via metabólica de seu interesse. </li></ol> 6. Preparação da lista com Gene ID Gene Arabidopsis ortólogos <ol><li> Baixe lista de identificação de genes de banco de dados genômicos. </li><li> Adicionar ID gene Arabidopsis do gene ortólogos, em caso de sua planta não é alvo de Arabidopsis. </li><li> Prepare uma lista de genes em seu caminho de interesse. Anotação de dados via Arabidopsis e dados da família de genes estão disponíveis no site TAIR ( <a href="http://www.arabidopsis.org/" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/~~V</a> ). Se você preparou uma lista de genes ortólogos de Arabidopsis, você pode, posteriormente, combine-los. </li></ol> 7. Co-expressa Análise Gene <ol><li> Teste usando a lista de identificação de gene preparado para procurar o melhor banco de dados para o seu caminho, verificando a correlação usando pares de genes bem conhecidos em seu caminho de interesse (Quadro II). Se for co-expressão banco de dados ou a expressão do gene não estão disponíveis na planta de seu interesse, base de dados de co-expressão de Arabidopsis deve ser usado com uma lista de Arabidopsis genes ortólogos. No caso de cevada, arroz, choupo, trigo, Medicago e soja, a co-expressão de análise de espécies de plantas pode ser utilizado (Tabela II). </li><li> Construa o quadro para o seu destino de rede co-expressão com base nas conexões dos genes bem conhecidos em seu caminho de interesse. </li><li> Adicionar genes candidatos correlação (r &lt;0,4 ~ 0,90, no valor aproximado de valor do coeficiente entre as conexões dos genes bem conhecidos em seu caminho de interesse) e verificar a sua anotação de genes em seu prfamílias edicted para as conexões desta rede para encontrar genes candidatos melhores (Figura 3). Limite de valor do coeficiente deve ser coordenada de acordo com a estrutura de rede e densidade de genes correlatos. </li><li> Faça lista de genes que você é capaz de diminuir como sendo especializado para o seu caminho de destino. </li><li> Verifique a expressão gênica das especificidades de órgãos e as respostas de estresse de seus genes candidatos. </li></ol> 8. Integração de todas as informações para prever Novos Caminhos <ol><li> Adicionar genes bem caracterizados que têm sido utilizados para consulta de co-expressão de análise para predito via metabólica. </li><li> Verifique se as peças descaracterizados por essa via, por exemplo descaracterizados etapas enzimáticas, proteínas de transporte e fatores de transcrição. </li><li> Prever anotação gene mais adequado para estes passos em falta não caracterizadas. </li><li> Combinar os resultados de perfil metabólico e genes candidatos de in silico gene expressão com base no percurso previsto. </li><li> Dispor genes candidatos seus na via predito de acordo com a função do gene, por exemplo, acetiltransferase para acetilado metabolito, glicosiltransferase para glicósido, P450 para o composto oxidado. A análise filogenética árvore de sequências de aminoácidos é útil para alguns família de genes de largura, tais como citocromo P450 e glicosiltransferase. </li><li> Verifique a consistência das especificidades do tecido ou respostas de estresse entre acúmulo de metabólitos e níveis de expressão gênica de genes candidatos. </li><li> Verifique as conexões para o metabolismo outro para fornecer substrato e estresse genes responsivos. </li></ol> 9. Experimentos para identificação de genes usando Bio-recursos <ol><li> Verifique a disponibilidade de recursos biológicos para a facilitação de experimento para identificação de genes candidatos. </li><li> Realizar um experimento para identificação da função do gene usando recursos biológicos, tais como KO biblioteca mutante e full-length biblioteca de cDNA. Tele experimentos para identificação funcional de genes com a preparação de plantas superexpressão e mutantes knockout, ensaio e ensaio enzimático promotor de ligação, tem que ser feita para os melhores genes candidatos na sua previsão. Ensaio de proteína recombinante para a caracterização das propriedades da proteína e preparação de plantas superexpressão melhor ser realizada após a confirmação do perfil dos metabolitos usando KO mutante uma vez que leva muito mais tempo para preparar a proteína recombinante e clonagem de genes para a transformação. </li></ol> 10. Os resultados representativos O procedimento de análise integrada descrito neste protocolo tem muitas possibilidades, dependendo finalidade experimental especificado e escolha de combinações biológicas e analíticas. Escolha dos procedimentos e desenho experimental deve ser efectuada adequadamente na base da sua via de alvo, os compostos e as espécies de plantas. A estratégia de integração descritos neste protocolo é foc usado em anotação da função do gene vegetal ea descoberta de funções de genes novos com um uso eficiente de vários bio-e os dados de recursos. Resultado esperado é prometido para fornecer com o único caso de previsão conclusivo. Este facto indica que se evidências suficientes não pode ser dada por perfis de combinação, experiência não deve ser iniciado. Por esta razão, em qualquer dos casos, experiências preliminares adicionais tais como o perfil alvo expressão do gene por RT-PCR, pode suportar a sua previsão da função do gene. Precisão e exatidão da previsão correlaciona maior dependendo diferença qualitativa e número de variação de combinação. Além disso, bons candidatos e os resultados válidos só pode vir de previsão acurada das vias. Anotação de pico deve ser conduzida pela combinação de várias abordagens, por exemplo, levantamento da literatura, extrato vegetal de referência, a análise MS n, a especificidade do órgão e análise mutante 13. 1 "src =" / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg "/&gt; Figura 1. Descrição geral do fluxo experimental de anotação gene através da abordagem combinada. Em alguns casos, os projectos começar com a descoberta de um novo pico o qual é detectado em condições especiais ou tecidos, eo desejo de compreender o seu papel no seu metabolismo. Em outros casos, o objetivo do projeto é a identificação de genes ou descoberta dos principais fatores de regulação, tais como fatores de transcrição. Concepção de experiência deve ser aplainada com um conjunto de dados que mostra diferenças claras de níveis de metabolitos no seu caminho alvo, utilizando uma grande variedade de amostras de tecido a partir de diferentes órgãos, e para as plantas cultivadas diferencialmente ou plantas expostas a condições de stress, e sujeitando o material para perfil metabólico. As plantas mutantes e transgénicos, bem como material de reprodução QTL guarida também representam o material genético apropriado para estes estudos. Previsão da nova via deve ser realizada com cuidado e com precisãoanotação de pico e aproximação da combinação com diferentes tipos de metabolotype como títulos de órgãos e as respostas de estresse de acordo com dados de expressão gênica do seu percurso de interesse. Na última etapa, o perfil metabolito e transcrição deve ser realizada que eventualmente, quando combinado com análise in silico de web-recursos e caracterização in vitro da expressão de genes através de expressão heteróloga, conduzir à confirmação do gene candidato e elucidação da sua função ea posição dentro de uma via metabólica. Abreviaturas: QTL, locos de características quantitativas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fluxo de trabalho do abordagem combinatória para a anotação de pico. Um procedimento para a identificação de pico e anotação pelo composto padrão, a comparação de tipo selvagem e mutantes knock out, multi-dimensional de espectrometria de massa do pico alvo referindo-se a espectros de massa de COM puroquilos a partir dos 12 bancos de dados. Abreviaturas: DB, banco de dados; KO, knock-out; 1-D, unidimensional; 2-D, bidimensional, RMN, ressonância magnética nuclear; IR, infra-vermelho, MS n, a massa de massa spectrometries. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Exemplo de análise de rede de co-regulação da via antocianina. Análises foram realizadas utilizando a co-expressão do PRIME ( <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> ) com base nos dados constantes da versão 3 ATTEDII 8,2 com a Pajek programa ( <a href="http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/" target="_blank">http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/</a> ). Correlações positivas (r &lt;0,5) são usados ​​para fazer conexões de rede. Red nó: doze genes antocianinas enzimáticos (At5g13930, caps, TT4 chalcona sintase; At3g55120, CHI, TT5, chalcona isomerise; At3g51240, F3H, TT6, flavanona 3-hidroxilase; At5g07990, F3'H, TT7, flavonóides 3'-hidroxilase; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonóide 3 - O-glicosiltransferase; At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, diidroflavonol redutase; At4g22880, ANS / LDOX, TT18, Synthese anthocyanidin; At4g14090, A5GT, antocianinas 5 - O-glicosiltransferase; At5g54060, A3G2 "XT, antocianina putativo 3 - O glicosídeo-2" - O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, antocianinas 5 - O glicosídeo-6'' '- O-malonyltransferase; At1g03940, A3GCouT, antocianina 3 - O glicosídeo-6 "- O - p-coumaroyltransferase) e dois fatores de transcrição para a produção de antocianina (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) foi usado para procurar genes candidatos genes candidatos foram encontrados por uma "interseção de conjuntos de" pesquisa com um valor limiar, com um coeficiente de r &lt;./ Em &gt;&gt; 0,50 consultado por interseção de conjuntos de todos os genes consultadas (Quatorze genes de biossíntese de antocianina). Uma rede de co-expressão, incluindo genes candidatos correlatas (68 genes) e genes consultados (14 genes), foi re-construída por uma "interligação de conjuntos de" pesquisa com r&gt; 0,50 utilizando o banco de dados PRIME. Os arquivos de saída que foram formatados com um arquivo 'net'. Do banco de dados PRIME e redes foram desenhadas usando um software Pajek. Nó azul indica genes candidatos que se relacionaram com genes de antocianinas. <table border="1"><tbody><tr><td> espécies </td><td> Maior metabólito secundário </td></tr><tr><td> Arabidopsis thaliana </td><td> Glucosinolatos, flavonóis, antocianinas, derivado sinapoyl </td></tr><tr><td> Populus trichocarpa </td><td> Flavonóides, antocianinas, derivado salicilato </td></tr><tr><td> Vitis vinifera </td><td> Flavonóides, antocianinas, tanino, estilbeno </td></tr><tr><td> Solanum lycopersicum </td><td> Flavonóides, antocianinas, glicoalcalóide, chrologenate relacionado, </td></tr><tr><td> Nicotiana tabacum </td><td> Flavonóides, antocianinas, nicotianamide, chrologenate relacionado, acilaçúcar </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td> Glycoflavone, antocianina, derivados de esterol </td></tr><tr><td> Zea maio </td><td> Glycoflavone, antocianina, benzoxazinona, derivados de esterol </td></tr><tr><td> Medicago truncatula </td><td> Isoflavonas, antocianinas, saponinas, </td></tr><tr><td> Lotus japonica </td><td> Isoflavonas, flavonóides, antocianinas, saponinas, </td></tr></tbody></table> Tabela I. Os principais metabolitos secundários em espécies de plantas do modelo. <table border="1"><tbody><tr><td> Co-expressão banco de dados </td><td> Endereço </td></tr><tr><td> Planta de cruz especificaçãos </td><td></td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V</a> </td></tr><tr><td> PlaNet </td><td> <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> As espécies de plantas </td><td></td></tr><tr><td> ATEED-II </td><td> <a href="http://atted.jp/" target="_blank">http://atted.jp/</a> </td></tr><tr><td> BAR </td><td> <a href="http://142.150.214.117/welcome.htm" target="_blank">http://142.150.214.117/welcome.htm</a> </td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop</a> </td></tr><tr><td> GeneCAT </td><td> <a href="http://genecat.mpg.de/" target="_blank">http://genecat.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Arabidopsis </td><td></td></tr><tr><td> ACT </td><td> <a href="http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser" target="_blank">http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser</a> </td></tr><tr><td> AthCoR@CSB.DB </td><td> <a href="http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html" target="_blank">http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html</a> </td></tr><tr><td> CressExpress </td><td> <a href="http://cressexpress.org/" target="_blank">http://cressexpress.org/~~V</a> </td></tr><tr><td> PRIME </td><td> <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td></td></tr><tr><td> RiceArrayNet </td><td> <a href="http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/" target="_blank">http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V</a> </td></tr><tr><td> Banco de Dados da Matriz de arroz </td><td> <a href="http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml" target="_blank">http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml</a> </td></tr></tbody></table> Tabela II. Banco de dados de expressão disponível gene para análise in silico co-expressão.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Dado que Transcritômica e tecnologias metabolómica têm sido utilizados desde há vários anos, o processo de integração de dados para metabolômica assistidas anotação gene geralmente começa com a identificação de um novo pico representando um metabolito desconhecido. Este facto leva a que a fase seguinte é o de avaliar a variância quantitativa em picos metabolito ou os genes candidatos a novos pensados ​​para ser responsável pela sua biossíntese. A estratégia descrita neste protocolo, no entanto, tem três grandes problemas i) dificuldade de anotação de pico, ii) a complexidade da previsão caminho, III), resolução de informação genética e qualidade de dados de expressão gênica. Para contrariar o primeiro problema, anotação pico deve ser realizado com a co-eluição de compostos-padrão ou de informação abordagem combinatória utilizando a partir do MS N da análise, o extracto de referência, a análise de mutante, a pesquisa do banco de dados metabolito e pesquisa da literatura (Figura 2, 12). Para a second problema, a previsão de caminho só pode ser obtido pela anotação correta de pico. No entanto, o perfil de especificidade de tecido metabolito também pode ser anotação pico suporte, porque a acumulação metabolito devem ser correlacionados com as expressões de genes de genes relacionados. Portanto perfis de combinação de diferentes tecidos e condições de crescimento podem ser úteis para este segundo problema. O terceiro problema diz respeito à resolução de informação gene depende do progresso de dados de sequência. No caso da planta modelo sem conclusão da sequência do genoma, a co-expressão de análise usando genes ortólogos em plantas outro modelo é útil. Comparação alinhamento e análise detalhadas árvore filogenética da seqüência de aminoácidos pode suportar para se conectar organismos modelo para outras espécies. Este protocolo é adequada para todos os metabolismos. É mais eficiente na análise de metabolismos intermediários e secundário, que estão bem caracterizados para ser sujeito a transcrição c forteONTROLO 1,5,11,16. Em alguns exemplos, a co-expressão de análise conseguiu ser realizada na assimilação de enxofre, os genes para β-oxidação, de cadeia ramificada degradação do ácido amino, repartição de clorofila, eo catabolismo da lisina 3, o metabolismo da parede celular 10,7 e luz cascata de sinalização 14. Anotação da função dos genes através de genômica combinados, metabolômica e informática não é apenas para o gene biossintético e regulador direto de fator de transcrição, mas também para compreender o processo fisiológico e resposta (ver Figura exemplo 3. 14). Para desenvolver essa abordagem a partir de plantas modelo para as espécies cultivadas, a comparação metabólico de diferentes espécies vegetais é poderosa abordagem em alguns metabolismos gerais. Por exemplo, se mesmo composto é detectada em diferentes espécies de plantas, e alguns genes ortólogos são encontrados nestas espécies de plantas, entre espécies análise de co-expressão usando ortólogos genes pode fornecer strong suporte para sua previsão. Esta abordagem pode ser realizada em Arabidopsis, choupo, Medicago, além culturas importantes, tais como a cevada, arroz, trigo e soja, por co-expressão de análise de espécies de plantas (6, PlaNet: <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg . de /</a> ,; 9, COP: <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/</a> ; ver um exemplo, 15).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Água destilada ULC / MS grad </td><td> BIOSOLVE </td><td> 23214102 </td></tr><tr><td> Acetonitrila (ACN) ULC / MS grau </td><td> BIOSOLVE </td><td> 01204102 </td></tr><tr><td> Metanol (MeOH) ULC / MS grau </td><td> BIOSOLVE </td><td> 13684102 </td></tr><tr><td> Ácido fórmico (HCOOH) grau ULC / MS para cromatografia líquida </td><td> BIOSOLVE </td><td> 06914131 </td></tr><tr><td> Compostos padrão </td><td> EXTRASYNTHESE </td><td></td></tr><tr><td> Ion trap linear (TI) ESI-MS sistema Finnigan-LTQ </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> HPLC Surveyor sistema </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> Analytical Luna coluna C18 (2), 2,0 mm de diâmetro, 150 mm de comprimento, 100 poro Åtamanho e partículas esféricas de 3 milímetros </td><td> Phenomenex </td><td> 00F-4251-B0 </td></tr><tr><td> Xcalibur software </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr></tbody></table>

anotação da função do gene da planta através de genômica combinados, metabolômica e informática

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Dado o crescente número de espécies de plantas modelo para os quais seqüências genômicas completas estão disponíveis ea abundância de recursos biológicos, tais como mutantes knockout, adesões e as populações selvagens de criação avançados, há um crescente fardo para anotação gene funcional. Neste protocolo, a anotação da função planta gene através da análise combinada gene co-expressão, metabolômica e informática é fornecida (Figura 1). Esta abordagem é baseada na teoria da utilização de genes alvo de função conhecida para permitir a identificação de genes não-anotadas susceptível de ser envolvido num certo processo metabólico, com a identificação de compostos alvo através de metabolômica. Estratégias são propostas para aplicar essa informação sobre as populações geradas por ambas as abordagens direta e inversa genética, apesar de nenhum deles é fácil. Por corolário esta abordagem pode também ser usado como uma abordagem para caracterizar picos desconhecidos que representam si novo ou específicametabólitos condary nos tecidos limitados, espécies vegetais ou de tratamento de estresse, que é actualmente o julgamento importante para a compreensão do metabolismo da planta.

Combinação de genômica, co-expressão de genes de análise e identificação de compostos-alvo através do metabolismo dar anotação gene funcional.

Anotação da função do gene da planta através de Genômica combinados, metabolômica e Informática

Dado o número cada vez maior de espécies de plantas modelo para as quais sequências genômicas completas estão disponíveis e a abundância de bio-recursos, tais como...

O objetivo geral do experimento a seguir é descobrir e caracterizar novas funções gênicas utilizando anotação gênica por meio da análise combinada de perfis de metabólitos e análise de coexpressão. Isso é alcançado por meio da consideração do delineamento experimental com foco em vias metabólicas específicas e espécies vegetais. Como segundo passo, abordagens analíticas são utilizadas para construir a via metabólica completa com base nas estruturas químicas dos compostos detectados.Em seguida, a estrutura da via predita é integrada à análise de coexpressão para restringir os genes candidatos, os quais indicam putativamente os genes-chave do metabolismo. Por fim, os resultados são obtidos mediante um número mínimo de experimentos com uso eficiente de diversos recursos biológicos, a fim de caracterizar a identificação funcional dos genes. Tivemos inicialmente a ideia deste método ao observar uma correlação muito alta entre os genes cístico-bio Abosi OID na base de dados de coexpressão denominada ate.Consideramos que esta estratégia é uma das formas mais rápidas de identificar as funções de novogenes com os dados disponíveis publicamente em bancos de dados e com o uso eficiente de recursos bioinformáticos. Para iniciar a extração, colete os materiais vegetais e congele imediatamente em nitrogênio líquido. Uma vez congelado em pó, triture os materiais vegetais utilizando um moinho de mistura, alíquota o material vegetal congelado em um tubo EOR de dois mililitros e, em seguida, adicione uma esfera de metal ao tubo.Adicione 250 microlitros de tampão de extração por 50 miligramas de amostra. O tampão de extração contém o padrão interno para normalização. Em seguida, homogeneíze o pó congelado com o moinho de mistura por dois minutos.Em uma frequência de 25, centrifugue a amostra a 12.000 RPM por 10 minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante para um filtro centrífugo. Após realizar uma segunda rodada de centrifugação, transfira o sobrenadante para um novo tubo einor.Em seguida, prepare a CLAE verificando primeiro se a temperatura do forno da coluna está a 35 graus Celsius e se a da bandeja de amostras está a 10 graus Celsius. Configure as condições de espectrometria de massas e verifique o estado do vácuo e da cápsula aquecida. Realize uma calibração de massa por carga do detector de EM por injeção por infusão da mistura da solução de calibração.Utilizando o aplicativo de calibração automática no software. Em seguida, transfira 50 microlitros dos extratos para um frasco de vidro. Para HPLC, realize pelo menos cinco injeções do tampão de extração antes de realizar a análise da primeira amostra, conforme descrito no procedimento escrito.Após configurar uma ferramenta de análise de espectrometria de massas, selecione os dados a serem processados. Prepare uma tabela com os picos detectados de interesse de acordo com a classe de compostos indicada no protocolo escrito. Identifique os picos por coeluição com compostos padrão e anote os picos detectados utilizando análise por Ms.Ms, literatura, levantamento e busca em banco de dados de metabólitos nesta etapa.A previsão da via metabólica deve ser baseada nas estruturas químicas, associando a função enzimática na via metabólica. Assim, essas etapas devem ser realizadas mediante a identificação precisa dos compostos detectados. Bancos de dados de vias metabólicas gerais, como o banco de dados KEGG e o PlantCyc, são muito eficazes para a previsão da via metabólica de interesse.Para preparar uma lista de genes com genes ortólogos de Arabidopsis, primeiro baixe uma lista de identificadores de genes a partir do banco de dados genômico. Adicione o identificador de gene de Arabidopsis dos genes ortólogos caso a planta-alvo não seja Arabidopsis. Em seguida, prepare uma lista de genes na via de interesse.A anotação dos dados de vias do Arabidopsis e dados de famílias gênicas estão disponíveis no site do TAAR. As listas de genes ortólogos do Arabidopsis podem subsequentemente ser combinadas. Realize análise de rede de coexpressão utilizando a lista de identificadores gênicos preparada para pesquisar o melhor banco de dados para a via predita.Verificando a correlação de pares de genes bem conhecidos na via de interesse. Se o banco de dados de coexpressão ou o banco de dados de expressão gênica não estiverem disponíveis. No plano de interesse, deve-se utilizar o banco de dados de coexpressão de Arabidopsis com uma lista de genes autólogos de Arabidopsis.Em seguida, construa a estrutura da rede de coexpressão alvo. Com base nas conexões dos genes bem conhecidos na via de interesse, adicione os genes candidatos correlacionados e verifique sua anotação gênica nas famílias previstas em relação às conexões dessa rede para identificar o melhor candidato.O limiar dos genes para o valor do coeficiente deve ser coordenado de acordo com a estrutura da rede e a densidade dos genes correlacionados. Agora, elabore uma lista de genes que possam ser reduzidos por serem especializados na via alvo. Com base nesta lista, verifique a expressão gênica nas especificidades orgânicas e nas respostas a estresses dos genes candidatos.Inicie a integração das informações adicionando genes bem caracterizados, que foram utilizados na consulta de análise de coexpressão, ao caminho metabólico previsto. Realize uma busca na literatura para verificar se as partes não caracterizadas deste caminho são novas, incluindo etapas enzimáticas não caracterizadas, proteínas de transporte e fatores de transcrição. Neste momento, preveja a anotação gênica mais adequada para essas etapas ausentes e não caracterizadas.Combinar os resultados do perfilamento de metabólitos e dos genes candidatos de expressão gênica in silico com base na via predita. Em seguida, organizar os genes candidatos na via predita de acordo com a função gênica. Por exemplo, acetiltransferase para metabólito acetilado, glicosiltransferase para glicosídeo e P450 para composto oxidado.Verifique a consistência das especificidades teciduais ou das respostas ao estresse entre o acúmulo de metabólitos e o nível de expressão gênica de genes candidatos. Também verifique as conexões com outros metabolismos para fornecimento de substratos e genes responsivos ao estresse. Como etapa final, realize um experimento para identificação da função gênica utilizando bio-recursos, como biblioteca de mutantes com deleção e biblioteca de CD NA de comprimento completo. Mostrado.Aqui está um exemplo de análise de rede de co-regulação da via das antocianinas. As análises de coexpressão foram realizadas utilizando o índice de coexpressão PRAM com base no conjunto de dados da versão três adicionada, com o programa PX exibido como nós vermelhos; 12 genes enzimáticos de antocianinas e dois fatores de transcrição para a produção de antocianinas foram utilizados na busca por genes candidatos. Uma rede de coexpressão contendo 68 genes candidatos correlacionados e 14 genes consultados foi reconstruída por meio de uma busca interconectada utilizando a base de dados prime, resultando em arquivos de saída T net que foram desenhados usando o software PX.Os nós azuis indicam os genes candidatos que se correlacionaram com os genes de antocianina após seu desenvolvimento. Essa estratégia nos dará uma boa indicação para prever e identificar novas funções gênicas em metabolismos vegetais.

annotation-plant-gene-function-via-combined-genomics-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve a aplicação de metabolômica irrelevantes, transcriptomics e análise estatística multivariada para transcrições baga da uva e metabolitos, a fim de ter uma visão sobre o conceito terroir, ou seja, o impacto do meio ambiente sobre características de qualidade de baga.

O Conceito Terroir Interpretado através da baga da uva Metabolomics e transcriptómica

Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

Este artigo descreve o procedimento para a identificação e caracterização de uma família de gene em videira aplicada à família de Arabidopsis Tóxicos em Levadura (ATL) E3 ubiquitina ligases.

Fluxo de trabalho abrangente para a identificação de todo o genoma e Meta-análise da expressão da ATL E3 ubiquitina Ligase Gene família em videira

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