Anotação da função do gene da planta através de Genômica combinados, metabolômica e Informática

O objetivo geral do experimento a seguir é descobrir e caracterizar novas funções gênicas utilizando anotação gênica por meio da análise combinada de perfis de metabólitos e análise de coexpressão. Isso é alcançado por meio da consideração do delineamento experimental com foco em vias metabólicas específicas e espécies vegetais. Como segundo passo, abordagens analíticas são utilizadas para construir a via metabólica completa com base nas estruturas químicas dos compostos detectados.

Em seguida, a estrutura da via predita é integrada à análise de coexpressão para restringir os genes candidatos, os quais indicam putativamente os genes-chave do metabolismo. Por fim, os resultados são obtidos mediante um número mínimo de experimentos com uso eficiente de diversos recursos biológicos, a fim de caracterizar a identificação funcional dos genes. Tivemos inicialmente a ideia deste método ao observar uma correlação muito alta entre os genes cístico-bio Abosi OID na base de dados de coexpressão denominada ate.

Consideramos que esta estratégia é uma das formas mais rápidas de identificar as funções de novogenes com os dados disponíveis publicamente em bancos de dados e com o uso eficiente de recursos bioinformáticos. Para iniciar a extração, colete os materiais vegetais e congele imediatamente em nitrogênio líquido. Uma vez congelado em pó, triture os materiais vegetais utilizando um moinho de mistura, alíquota o material vegetal congelado em um tubo EOR de dois mililitros e, em seguida, adicione uma esfera de metal ao tubo.

Adicione 250 microlitros de tampão de extração por 50 miligramas de amostra. O tampão de extração contém o padrão interno para normalização. Em seguida, homogeneíze o pó congelado com o moinho de mistura por dois minutos.

Em uma frequência de 25, centrifugue a amostra a 12.000 RPM por 10 minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante para um filtro centrífugo. Após realizar uma segunda rodada de centrifugação, transfira o sobrenadante para um novo tubo einor.

Em seguida, prepare a CLAE verificando primeiro se a temperatura do forno da coluna está a 35 graus Celsius e se a da bandeja de amostras está a 10 graus Celsius. Configure as condições de espectrometria de massas e verifique o estado do vácuo e da cápsula aquecida. Realize uma calibração de massa por carga do detector de EM por injeção por infusão da mistura da solução de calibração.

Utilizando o aplicativo de calibração automática no software. Em seguida, transfira 50 microlitros dos extratos para um frasco de vidro. Para HPLC, realize pelo menos cinco injeções do tampão de extração antes de realizar a análise da primeira amostra, conforme descrito no procedimento escrito.

Após configurar uma ferramenta de análise de espectrometria de massas, selecione os dados a serem processados. Prepare uma tabela com os picos detectados de interesse de acordo com a classe de compostos indicada no protocolo escrito. Identifique os picos por coeluição com compostos padrão e anote os picos detectados utilizando análise por Ms.Ms, literatura, levantamento e busca em banco de dados de metabólitos nesta etapa.

A previsão da via metabólica deve ser baseada nas estruturas químicas, associando a função enzimática na via metabólica. Assim, essas etapas devem ser realizadas mediante a identificação precisa dos compostos detectados. Bancos de dados de vias metabólicas gerais, como o banco de dados KEGG e o PlantCyc, são muito eficazes para a previsão da via metabólica de interesse.

Para preparar uma lista de genes com genes ortólogos de Arabidopsis, primeiro baixe uma lista de identificadores de genes a partir do banco de dados genômico. Adicione o identificador de gene de Arabidopsis dos genes ortólogos caso a planta-alvo não seja Arabidopsis. Em seguida, prepare uma lista de genes na via de interesse.

A anotação dos dados de vias do Arabidopsis e dados de famílias gênicas estão disponíveis no site do TAAR. As listas de genes ortólogos do Arabidopsis podem subsequentemente ser combinadas. Realize análise de rede de coexpressão utilizando a lista de identificadores gênicos preparada para pesquisar o melhor banco de dados para a via predita.

Verificando a correlação de pares de genes bem conhecidos na via de interesse. Se o banco de dados de coexpressão ou o banco de dados de expressão gênica não estiverem disponíveis. No plano de interesse, deve-se utilizar o banco de dados de coexpressão de Arabidopsis com uma lista de genes autólogos de Arabidopsis.

Em seguida, construa a estrutura da rede de coexpressão alvo. Com base nas conexões dos genes bem conhecidos na via de interesse, adicione os genes candidatos correlacionados e verifique sua anotação gênica nas famílias previstas em relação às conexões dessa rede para identificar o melhor candidato.

O limiar dos genes para o valor do coeficiente deve ser coordenado de acordo com a estrutura da rede e a densidade dos genes correlacionados. Agora, elabore uma lista de genes que possam ser reduzidos por serem especializados na via alvo. Com base nesta lista, verifique a expressão gênica nas especificidades orgânicas e nas respostas a estresses dos genes candidatos.

Inicie a integração das informações adicionando genes bem caracterizados, que foram utilizados na consulta de análise de coexpressão, ao caminho metabólico previsto. Realize uma busca na literatura para verificar se as partes não caracterizadas deste caminho são novas, incluindo etapas enzimáticas não caracterizadas, proteínas de transporte e fatores de transcrição. Neste momento, preveja a anotação gênica mais adequada para essas etapas ausentes e não caracterizadas.

Combinar os resultados do perfilamento de metabólitos e dos genes candidatos de expressão gênica in silico com base na via predita. Em seguida, organizar os genes candidatos na via predita de acordo com a função gênica. Por exemplo, acetiltransferase para metabólito acetilado, glicosiltransferase para glicosídeo e P450 para composto oxidado.

Verifique a consistência das especificidades teciduais ou das respostas ao estresse entre o acúmulo de metabólitos e o nível de expressão gênica de genes candidatos. Também verifique as conexões com outros metabolismos para fornecimento de substratos e genes responsivos ao estresse. Como etapa final, realize um experimento para identificação da função gênica utilizando bio-recursos, como biblioteca de mutantes com deleção e biblioteca de CD NA de comprimento completo. Mostrado.

Aqui está um exemplo de análise de rede de co-regulação da via das antocianinas. As análises de coexpressão foram realizadas utilizando o índice de coexpressão PRAM com base no conjunto de dados da versão três adicionada, com o programa PX exibido como nós vermelhos; 12 genes enzimáticos de antocianinas e dois fatores de transcrição para a produção de antocianinas foram utilizados na busca por genes candidatos. Uma rede de coexpressão contendo 68 genes candidatos correlacionados e 14 genes consultados foi reconstruída por meio de uma busca interconectada utilizando a base de dados prime, resultando em arquivos de saída T net que foram desenhados usando o software PX.

Os nós azuis indicam os genes candidatos que se correlacionaram com os genes de antocianina após seu desenvolvimento. Essa estratégia nos dará uma boa indicação para prever e identificar novas funções gênicas em metabolismos vegetais.