Name: Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Aprenda a determinar a posição do ciclo celular em células de mamíferos usando citometria de fluxo com marcação BRDU e iodeto de propídio. Este método permite quantificar células nas fases G1, S e G2/M com precisão.

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Os autores gostariam de agradecer ao Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e da Sociedade Canadense do Câncer de financiamento da investigação do ciclo celular em seu laboratório. MJC é um receptor de uma bolsa de MD / PhD da CIHR. MJC e MA são membros do programa de treinamento CaRTT.

1. Rotulagem e fixação de células <ol><li> Adicionar 1 mL de Reagente Labeling Proliferação Celular (BrdU) por mL de meio de cultura celular (1-1000 diluição) 1 hora antes da colheita. O período de rotulagem pode precisar ser aumentado para mais lento células de crescimento. </li><li> Às células colheita, meio de cultura aspirado e lavar cuidadosamente com tampão fosfato salino (PBS). Repita o procedimento para remover completamente os traços de médio porte. </li><li> Lavar as culturas rapidamente uma terceira vez com PBS contendo EDTA 3mm e aspirar completamente. </li><li> Adicionar um pequeno volume de PBS contendo EDTA 3mm a cada prato, 0,5 mL de um prato 6 centímetros é o ideal. Incubar a 22 ° C por aproximadamente 5 minutos para separar as células. Transferir para um tubo cônico de 15 mL. </li><li> Células Centrifugar a 500 xg por 5 minutos para pellet, remover o sobrenadante e ressuspender completamente em 100 L de PBS. </li><li> Fix células adicionando 5 mL de EtOH 95%, gota a gota, enquanto vórtex. Nesta etapa, as células podem ser armazenadas a 4 ° C durante pelo menos ummês. </li></ol> 2. Desnaturação e coloração de BrdU e DNA <ol><li> Centrifugar a 500 xg células por 5 minutos para as células pellet e remover EtOH 95%. Ressuspender em 1 ml de HCl 2N e 0,5% Tx-100, acrescentando de forma gota sábios quando vórtex. Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. </li><li> Centrífuga como antes na seção 2.1 e aspirar cuidadosamente o sobrenadante vez que as células formam um pellet muito solto nesta etapa. Delicadamente ressuspender em 1 ml de 0,1 M NAB 4 O 7 (pH 8,5) e incubados por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Células pelota como acima na seção 2.1 e ressuspender em 0,5 mL de solução de anticorpos (PBS contendo 1% de BSA e 0,2% Tween-20) com o mouse anti-BrdU anticorpos diluídos 1-50. Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. </li><li> Células de pelotas de novo e ressuspender em 50 mL de solução contendo anticorpo de coelho anti-rato anticorpos secundários conjugados com FITC diluído 1 a 25. Incubar por 30 minutos embancada e proteger da luz. </li><li> Células centrífuga vez que uma final e ressuspender em 0,5 mL de iodeto de propídio e solução de RNase (PI-RNAse solução PBS com BSA 1%, 10 mg / mL de iodeto de propídio, 0,25 mg / mL de RNase A) e incubar no escuro a 37 ° C por 30 minutos. Alternativamente RNA pode ser digerido durante a noite a 4 ° C no escuro. </li><li> Passe solução através de um filtro para remover células agregados e coletar células individuais em um tubo adequado para a captação de exemplo no seu citômetro de fluxo. Novamente, as amostras devem ser protegidas da exposição direta à luz. </li></ol> 3. A análise por citometria de fluxo <ol><li> As células devem ser analisadas por um citômetro de fluxo padrão que é capaz de discriminar doublets (duas células que passam através da célula de fluxo como um) com capacidade de detecção apropriados para propidium iodeto e FITC. Células individuais podem ser detectados no presente pedido de citometria de fluxo pela passagem para eventos baseado em dispersão para a frente e lado pop dispersãolamentos, e usando as propriedades de coloração de DNA pelo iodeto de propídio. A aparência de um gráfico de pontos doublet discriminação varia entre citómetros de fluxo e se baseia em propriedades coloração propidium iodeto, ver suas instalações citometria de fluxo locais para aconselhamento sobre a criação de um discriminador doublet em sua análise. Em geral, em uma população de maneira assíncrona proliferação de células, as células individuais são geralmente os dois picos mais abundante (2N e 4N DNA) na parcela doublet discriminar e um portão deve ser elaborado em torno deles. Isso irá selecionar os eventos única célula que são utilizados para todas as análises subseqüentes abaixo. </li><li> A primeira amostra a ser analisada deve ser uma cultura de forma assíncrona proliferando que serve como um controle positivo para a coloração e citômetro de fluxo set-up. Ajustar a sensibilidade de tubos fotomultiplicadores para propidium coloração iodeto de tal forma que os picos 2N e 4N a partir de células singlet estão centradas em 200 e 400 (unidades arbitrárias) no eixo-X. Que muitas vezes mancha uma abundante supply dessas células para garantir que todos os parâmetros do citômetro de fluxo foram ajustados de forma adequada sem usar essa amostra. Este controle positivo também é útil para os novos usuários a se familiarizar com o funcionamento do citômetro de fluxo. </li><li> Ajustar a sensibilidade do tubo fotomultiplicador para detecção FITC tais que as populações G1 e G2 / M estão acima do fundo. Células BrdU positivas devem ser aproximadamente 10 vezes mais brilhante eo eixo Y deve ser exibido como uma escala logarítmica. Às vezes é útil incluir um controle negativo para a coloração de BrdU (substituindo os anticorpos anti-BrdU com os não-específicos de IgG no passo 2.3 acima) para distinguir claramente células marcadas positivamente. </li><li> Ajustar a compensação entre propidium iodeto e FITC tal que eventos únicos capturados pelo formulário citômetro de fluxo de um arco de ferradura em forma de G1 no canto inferior esquerdo até S-fase e para baixo no canto inferior direito para o G2 / M. Por favor, consulte a seguinte referência para uma análise mais profunda discussão dos princípios e uso de citometria de fluxo e referências lá para aplicações específicas 2. </li></ol> 4. A análise dos dados <ol><li> 5 000 a 10 000 eventos única célula com a gama de conteúdo pretendido DNA devem ser coletados para cada amostra, a fim de ter a confiança que a população de células na cultura têm sido exaustivamente amostradas. </li><li> Uma vez que as células têm sido medidos para propidium iodeto e conteúdo BrdU eles precisam ser atribuídos às fases G1, S ou G2 / M. Faça isso pelo desenho portões em torno das duas populações BrdU negativos centrados em 200 e 400 (G1 e G2 / M, respectivamente). Acima de tudo estas caixas devem ser incluídos em uma única porta que mede S-fase (Fig. 1A). A porcentagem de células em cada porta representa o número relativo de células em G1, S e G2 / M (Figura 1B). </li></ol> 5. Protocolo alternativo para a análise do ciclo celular em uma população mista de células <ol><li> Este protocolo alternativo émais útil quando a transfecção de vetores de expressão rotineiramente resulta em uma baixa percentagem de células que expressam o produto do gene de interesse, ou quando o tratamento medicamentoso para selecionar uma população pura de células é impraticável. Isso resulta em uma proporção relativamente pequena de células de interesse de ser contaminada com uma grande população de células untransduced. Neste caso, co-transfecção de plasmídeos expressando seu gene ou shRNA de interesse juntamente com um plasmídeo que expressa um marcador para a detecção de células transfectadas por citometria de fluxo, como uma membrana ancorada GFP 3, ou um marcador de superfície externa de células, tais como CD19 4 ou CD20 5. </li><li> Para efeitos do presente protocolo, vamos utilizar coloração CD20 como um exemplo, no entanto, coloração para CD19 é essencialmente idêntica. No caso de transfecção com CD20, não há necessidade de rotular BrdU, simplesmente células colheita conforme descrito nas etapas 1,2-1,5 acima e mancha pela adição de 20 mL FITC conjugado anti-CD20 anticorpos para as células na ice por 20 minutos no escuro. Fix células, como descrito em 1.6 passo. Células podem novamente ser armazenados por pelo menos um mês a 4 ° C no escuro. Para a detecção de GFP, omitir a coloração de anticorpos a partir desta etapa e corrigir e armazenar células como descrito. </li><li> Re-hidratar as células por peletização na centrífuga a 500 xg por 5 minutos e ressuspensão em 5 mL de PBS contendo BSA 1%. </li><li> Re-agregar as células a 500 xg por 5 minutos e ressuspender as células em 0,5 mL de iodeto de propídio e solução de RNase, como descrito acima na seção 2.5. </li><li> Continue a seguir as instruções de preparação de células em 2,6 e análise instruções em 3.1 e 3.2. </li><li> Ajustar a sensibilidade do tubo fotomultiplicador para detecção FITC tal que não coloridas estão acima do fundo. Idealmente, CD20-FITC células positivas será 10X a 100X mais intensamente manchado do fundo eo eixo Y deste lote deve ser exibido como uma escala logarítmica (Fig. 2A). Células CD20 positivas que são mais brilhantes do que 10X background (e com coloração propidium iodeto de entre 200 e 400) devem ser selecionados para exibição em um iodeto de propídio contra a contagem de células histograma como mostrado na figura. 2C. Para linhagens de células que expressam marcadores que são facilmente coradas intensamente (10X ou seja, a 100X acima do fundo), o CD20 positivo de corte deve ser definido no fundo de 10X. Inclusão de células mais fraca coloração aumenta a variabilidade nesses experimentos, presumivelmente porque o gene de interesse também é fracamente expresso nessas células. Para linhas de celular que só o rendimento fracamente coradas CD20 positivos (ou seja, menos do que o fundo de 10X), determinação de um off corte deve ser feito usando um controle negativo composto por CD20 manchadas, as células untransfected. </li><li> Pelo menos 1000 CD20 eventos positivos devem ser coletados para cada amostra. Experimentos com menos que 1000 irá produzir eventos alta variabilidade. Pacotes de software, tais como ModFit LT (Verity Software), Multi AV Ciclo (Phoenix Sistemas de Fluxo), e Jo Flow (Árvore Star) utilizar estimativas matemáticas deas populações G1, S e G2 / M que contribuem para a forma da curva em histogramas como os mostrados na figura. 2B e C. </li></ol> 6. Resultados representativos: Nós fornecemos três exemplos de análises célula experimental, utilizando o ciclo nossas abordagens. O primeiro usa a expressão retroviral inibidor da ciclina dependente p27KIP1 quinase em fibroblastos do ratinho embrionárias. Vinte e quatro horas após a seleção da droga para a infecção viral foi completa, as células foram marcadas com BrdU pulso durante uma hora. Neste experimento expressão ectópica do inibidor é usado para prender a proliferação das células (Fig. 3A e B). Como mostrado na figura. Eventos 3B pouco BrdU positivas são evidentes no portão fase S em resposta a p27. Da mesma forma, a porcentagem de células em fase S de células que expressam p27 é bastante baixo conforme ilustrado na figura. 3C. Este tipo de análise tem sido muito eficaz na caracterização da célula defeitos ciclo de controle em células derivadas de várias cepas de gene-alvo camundongos 6, 7, 8. No segundo experimento, não transformado células epiteliais mamárias (MCF10A) foram tratadas com a citocina inibitória de crescimento, transformando beta do fator de crescimento de um (TGF-β1) por 24 horas. As células foram marcadas com BrdU por quatro horas imediatamente antes da colheita. Como mostrado na figura. 4 rotulagem BrdU na fase S-células é muito diminuída por TGF-β1 sinalização, a especificidade da nossa coloração também é validado com um controle IgG negativo (Fig. 4C). Quantificação das diferentes fases do ciclo celular confirma que TGF-β1 principalmente inibe a proliferação na fase G1 do ciclo celular, levando a um acúmulo nesta fase. Em nosso último exemplo, pRB deficiente SAOS-2 células são transfectadas com um vetor CMV-CD20 expressão e quer CMV-RB ou CMV-β-Gal como um controle. Três dias após transfecção as células foram colhidas, coradas e fixo. Análise de citometria de fluxo dessas célulass é mostrado na figura. 5. Isso demonstra a distribuição do ciclo celular de células transfectadas controle negativo (Fig. 5A), em comparação com a seguinte distribuição de 72 horas de expressão PRB (Fig. 5B). Após ajuste de curva por software Ciclo Multi, uma comparação direta da proporção de fases do ciclo celular é mostrado na figura. 5C. Isso revela o acúmulo de células em G1 expressão pRB seguinte eo esgotamento relativo de células das fases S e G2 / M. Temos usado variações sobre este ensaio para sondar mecanismos prisão G1 extensivamente 9, 10, 11, 12, 13. Estes exemplos demonstram como controle do ciclo celular pode ser medido em resposta a uma variedade de estímulos ou manipulações de células. Esta abordagem pode ser adaptada para muitas aplicações que requerem a mensuração da posição do ciclo celular em experimentos tipo de cultura. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig1.jpg"> Figura 1. Quantitção das fases do ciclo celular por iodeto de propídio combinado e coloração BrdU (PI-BrdU). (A) Este painel exibe três citometria de fluxo dimensional de iodeto de propídio e células coradas BrdU. Note-se que as células com conteúdo de DNA 2N e 4N estão centradas sobre os 200 e 400 marcas na escala do eixo X para propidium intensidade de coloração de iodeto. BrdU intensidade de coloração é medido em uma escala logarítmica no eixo Y. Observe a posição dos portões usados ​​para quantificar células nas fases G1, S e G2 / M do ciclo celular. (B) A proporção relativa de células em cada um dos portões G1, S e G2 / M de A são mostrados neste gráfico. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig2.jpg"> Figura 2. Determinação quantitativa de fases do ciclo celular em células selecionadas usando iodeto de propídio ea célula CD20 marcador de superfície. (A) Este painel mostra iodeto de propídio e CD20 coloração para uma mistura de células, algumas das quais ectopicamente expressar CD20 e pRb. Note-se que as células com2N e 4N DNA (as populações mais abundantes) estão centradas sobre os 200 e 400 marcas no eixo-X. A posição do CD20 + portão seleciona as células que estão manchadas pelo menos 10X mais brilhante do que de fundo. (B) Um gráfico de contagens de células versus propidium coloração iodeto é mostrado para CD20 células negativas no painel A que são assincronamente proliferando. (C) Um gráfico semelhante é mostrado para CD20 células positivas a partir do painel A que foram induzidos a prisão com a expressão pRB e contêm células com conteúdo de DNA principalmente 2N. Isso demonstra que um preso sub-população podem ser distinguidos de outras células nesta cultura usando esta técnica de coloração. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig3.jpg"> Figura 3. Inibição da proliferação celular por p27KIP1. (A) PI-BrdU análise é usado para medir as fases do ciclo celular em uma população de maneira assíncrona proliferação de células que foram transduzidas com um vecto pBABE vazio retroviralr. (B) Uma análise similar das células transduzidas com pBABE-p27. Observe a ausência de células na fase S e maior intensidade de eventos no G1 e G2 / M portões. (C) A determinação quantitativa de células em cada fase do ciclo celular em forma assíncrona proliferação e controle de células que expressam p27. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig4.jpg"> Figura 4. Inibição da proliferação celular por TGF-β1 (A) análise PI-BrdU de forma assíncrona proliferação de células MCF10A. (B) Análise das células tratadas com 100 pM de TGF-β1 por 24 horas. Observe o acúmulo de células principalmente na fase G1 do ciclo celular. (C) Validação de BrdU coloração, substituindo o anticorpo anti-BrdU primária com um controle de IgG não-específicas em células de forma assíncrona proliferando. (D) quantificação gráfica das fases do ciclo celular respectivos de A e B. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig5.jpg"> Figura 5. Inibição da proliferação celular por pRb. (A) A contagem de células contra coloração iodeto de propídio de CD20 e gal-ß células transfectadas é mostrado. Este é um controle importante como a transfecção pode sincronizar parcialmente as células, tornando a população untransfected (CD20 - células) como um controle inadequado para o transfectadas sub-população. Células transfectadas precisam ser comparados com outras células transfectadas de forma análoga. (B) A contagem de células contra gráfico iodeto de propídio de CD20 e pRb transfectadas células. Note a presença quase exclusiva de um pico 2N. (C) Representação gráfica de proporções de células determinada fase do ciclo de A para B e usando métodos de ajuste de curva em software Ciclo Multi.

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<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods. Mol. Biol. 699, 1-1 (2011).</li>
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<li>Isaac, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+regulates+pericentric+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein regulates pericentric heterochromatin.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 3659-3659 (2006).</li>
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<li>Hirschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overlapping+kinase+and+phosphatase+docking+site+regulates+activity+of+the+retinoblastoma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An overlapping kinase and phosphatase docking site regulates activity of the retinoblastoma protein.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1051-1051 (2010).</li>
<li>Dick, F. A., Dyson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pRB+contains+an+E2F1-specific+binding+domain+that+allows+E2F1-induced+apoptosis+to+be+regulated+separately+from+other+E2F+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">pRB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities.</a> Mol. Cell. 12, 639-639 (2003).</li>
<li>Dick, F. A., Sailhamer, E., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+of+the+pRB+pocket+reveals+that+cell+cycle+arrest+functions+are+separable+from+binding+to+viral+oncoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis of the pRB pocket reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral oncoproteins.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 3715-3715 (2000).</li>
<li>Dick, F. A., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+regions+of+the+pRB+pocket+domain+affect+its+inactivation+by+human+papillomavirus+E7+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Three regions of the pRB pocket domain affect its inactivation by human papillomavirus E7 proteins.</a> J. Virol. 76, 6224-6224 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Em nossa experiência, o sucesso com estas técnicas é dependente de alguns controles fundamentais e das condições experimentais. Uma delas é estabelecer um controle de forma assíncrona proliferando para uso nesses experimentos. Este controle serve para três propósitos importantes. Primeiro, ele garante que as condições de cultura utilizado para todas as amostras experimentais são adequados para apoiar a proliferação contínua na ausência de tratamento. Este exemplo também serve ao propósito de um controle positivo para a metodologia de coloração para garantir que BrdU ou células CD20 positivo pode ser detectado quando eles estão presentes. Por último, esta amostra é usada para calibrar o citômetro de fluxo. Esta amostra de controlo pode ser usado para ajustar a intensidade da coloração propidium iodeto para detectar células 2N e 4N, 200 e 400, respectivamente. Além disso, a sensibilidade de detecção de BrdU ou CD20 pode ser ajustado de modo que os sinais negativos e positivos estão centradas, como mostrado nas Figuras 1A e 2A. Quando todas as amostras têm uma concentração semelhante de células na PI-RNase solução, então alguns ajustes para o citômetro são necessários como amostras subseqüentes são executados. Isto é importante por razões mostrado na figura. 4B e 5B onde a acumulação G1 forte cria essencialmente um pico G1 única que pudesse ser mal interpretado como G2 / M. Os experimentos representante também fazer outros pontos importantes. Primeiro de tudo, eles demonstram que BrdU captação e rotulagem podem variar entre os tipos de células. Por esta razão, é importante determinar empiricamente o comprimento do pulso e condições coloração necessária para a boa detectar células em fase S. Em geral, os tipos de células que dupla na cultura em 24 horas ou menos podem ser rotulados com BrdU em uma hora. Tipos de células em crescimento mais lento podem exigir pulsos mais longos e as alterações às condições de anticorpos coloração e duração. MCF10A células são um excelente exemplo a este respeito como eles foram marcados com BrdU por quatro horas e corados com o dobro da concentração padrão de anticorpos para quatro vezes mais tempo. Investigadoresdeve ter cuidado para não exceder 6 horas de BrdU rotulagem mesmo com células muito lentamente crescendo como isso pode erroneamente levar a inclusão de G2 / M células na população S-fase. Em segundo lugar, ao comparar os efeitos da expressão p27KIP1 com os de TGF-β1, é claro que p27 pode induzir um acúmulo em qualquer G1 ou G2 / M fases, enquanto TGF-β1 sinalização induz uma parada G1. Meios tradicionais de detecção de proliferação, tais como incorporação de 3 H-Timidina e contagem de cintilação são incapazes de distinguir essas possibilidades. Em nosso protocolo alternativo demonstramos a detecção de uma sub-população de células em uma população maior untransfected. É importante determinar empiricamente o repórter mais adequado para a detecção de células transfectadas. Em nossa experiência, quer alguns tipos de células expressam marcadores de superfície celular mal, ou não pode corretamente o tráfego deles para a membrana plasmática, resultando em uma incapacidade de detectar células transfectadas. Likewise, nem todas as células tolerar a forma de membrana ligado de GFP. Seleção do repórter mais adequado deve ser feita através da avaliação da eficiência de transfecção do repórter, bem como a intensidade relativa de expressão comparados aos controles untransfected. Idealmente, expressão heteróloga destas moléculas será bem tolerado e este é sugestivo de que os marcadores têm pouco ou nenhum efeito sobre a distribuição do ciclo celular. Uma limitação destes tipos de abordagens de citometria de fluxo é que eles só são capazes de estabelecer abundância relativa das fases do ciclo celular em relação um ao outro. Por esta razão, é ambígua se expressão da p27 na Figura 3 realmente induz a uma prisão no G1 e G2 / M, ou se ele apenas retarda a progressão por essas fases em relação ao S-fase. Estas possibilidades podem ser investigada por tratamento de uma amostra paralela de células com um inibidor mitótico, como Nocodazol, ou G1 / S, como inibidor aphidicolin. Uma vez que estas drogas criar uma dominaçãont prisão em M-fase ou fase-S no início, respectivamente, as células proliferam lentamente irá acumular no ponto de parada induzidas por drogas. Por exemplo as células preso em G1 por causa da expressão pRB permanecerá no G1, apesar do tratamento Nocodazol enquanto as células controle irá acumular em fase de M-13. Juntas, essas abordagens experimentais oferecem uma metodologia flexível que pode ser aplicado a uma ampla gama de células de mamíferos questões de investigação ciclo. Eles podem facilmente detectar alterações na progressão do ciclo celular e quantificar as diferenças quando comparados com os controles.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente / equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comments (opcional) </th></tr><tr><td> Célula reagente Labeling Proliferação </td><td> GE Amersham </td><td> RPN201 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpos anti-BrdU </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpos Anti-Mouse FITC conjugado </td><td> Vector Labs </td><td> FI-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Strain Filtros celular </td><td> BD Falcon </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD20 Antibodies </td><td> BD Biosciences </td><td> 347673 </td><td></td></tr><tr><td> Software do Ciclo de vários </td><td> Sistemas de Fluxo de Phoenix </td><td> N / A </td><td></td></tr></tbody></table>

análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

A regulação da proliferação celular é fundamental para a morfogênese do tecido durante o desenvolvimento de organismos multicelulares. Além disso, perda de controle da proliferação celular está subjacente a patologia de doenças como o câncer. Como tal não há grande necessidade de ser capaz de investigar a proliferação celular e quantificar a proporção de células em cada fase do ciclo celular. É também de vital importância para indistinguivelmente identificar as células que replicar seu DNA dentro de uma população maior. Desde a decisão de uma célula a se proliferar é feita na fase G1, imediatamente antes de iniciar a síntese de DNA e progredindo pelo resto do ciclo celular, a detecção da síntese de DNA nesta fase permite uma determinação inequívoca do estado de regulação do crescimento em cultura de células experimentos. Conteúdo de DNA nas células podem ser facilmente quantificados por citometria de fluxo de células coradas com iodeto de propídio, um corante fluorescente intercalando DNA.Da mesma forma, a síntese de DNA ativo pode ser quantificada pela cultura de células na presença de timidina radioativa, a colheita das células, e medir a incorporação de radioatividade em uma fração insolúvel em ácido. Temos uma experiência considerável com a análise do ciclo celular e recomendar uma abordagem diferente. Nós investigamos a proliferação celular usando bromodeoxiuridina / fluorodeoxyuridine (abreviado simplesmente como BrdU) coloração que detecta a incorporação destes análogos timina no DNA recentemente sintetizado. Rotulagem e coloração das células com BrdU, combinado com coloração DNA total de iodeto de propídio e análise por citometria de fluxo oferece uma medida mais precisa das células nas várias fases do ciclo celular. É o nosso método preferido porque combina a detecção de síntese de DNA ativo, através da coloração de anticorpos base de BrdU, com conteúdo de DNA total de iodeto de propídio. Isso permite a clara separação de células em G1, da primeira fase S, ou S final da fase G2 / M.Além disso, esta abordagem pode ser utilizada para investigar os efeitos de muitas células diferentes estímulos e agentes farmacológicos sobre a regulamentação da progressão por essas fases diferentes do ciclo celular. Neste relatório nós descrevemos métodos para a rotulagem e coloração células cultivadas, bem como a sua análise por citometria de fluxo. Nós também incluímos exemplos experimental de como este método pode ser usado para medir os efeitos de sinais que inibem o crescimento de citocinas como TGF-β1, e inibidores da proliferação, tais como o inibidor da quinase ciclina dependente, p27KIP1. Nós também incluímos um protocolo alternativo que permite a análise da posição do ciclo celular em uma subpopulação de células dentro de uma cultura maior 5. Neste caso, demonstramos como detectar uma parada do ciclo celular em células transfectadas com o gene retinoblastoma, mesmo quando muito ultrapassados ​​pelas células untransfected na mesma cultura. Estes exemplos ilustram as várias maneiras que a coloração do DNA ecitometria de fluxo podem ser utilizados e adaptados para investigar questões fundamentais de controle do ciclo celular de mamíferos.

Determinar a posição do ciclo celular de uma população de células, ou a compreensão de como os sinais de afetar a proliferação, pode ser facilmente medido por citometria de fluxo usando esse protocolo. Relatamos uma abordagem simples experimental da coloração células e quantificar a sua posição no ciclo celular.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

A regulação da proliferação celular é fundamental para a morfogênese tecidual durante o desenvolvimento de organismos multicelulares. Além disso, a perda do controle de ...

O objetivo deste procedimento é determinar a proporção de células nas diferentes fases do ciclo celular. Isso é realizado primeiramente pela adição do reagente de marcação de proliferação celular BRDU a um cultivo celular viável, para incorporação ao DNA recém-sintetizado; em seguida, o BRDU nas células que incorporaram o reagente é corado, e depois o DNA é corado com iodeto de propídio. O passo final consiste em avaliar a proporção de células nas diferentes fases do ciclo celular por citometria de fluxo.Por fim, a distribuição do ciclo celular em uma população de células experimentais pode ser visualizada por meio da análise citométrica de fluxo de células marcadas com BRDU. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a incorporação de tri ao timo e a contagem por cintilação, é que, com a marcação por BRD, é possível determinar a proporção de células em cada fase do ciclo celular. A demonstração visual dessa mensagem é essencial, pois a análise citométrica associada é difícil de explicar sem imagens que acompanhem os diferentes parâmetros que precisam ser ajustados.Os estudantes de pós-graduação do meu laboratório, Matt Chii e eu, Miri, demonstrarão o procedimento. ADICIONE BRDU em uma diluição de um para 1000 aos cultivos celulares experimentais, incube por uma hora, colete as células, aspire o meio de cultura e, em seguida, lave as células completamente com PBS duas vezes para remover todos os vestígios de meio. Neste momento, utilizando PBS suplementado com três milimolares de EDTA, enxágue os cultivos rapidamente mais uma vez e, então, aspire completamente a solução de P-B-S-E-D-T-A para destacar as células.Adicione cerca de 0,5 mililitros de P-B-S-E-D-T-A a cada placa de cultura de seis centímetros e incube as placas a 22 graus Celsius por aproximadamente cinco minutos. Em seguida, transfira as culturas celulares de cada placa para tubos cónicos individuais de 15 mililitros. Agora, centrifugue as células a 500 vezes a gravidade durante cinco minutos à temperatura ambiente e, então, remova o sobrenadante, ressuspendendo as células em 100 microlitros de PBS.Por fim, fixe as células adicionando cinco mililitros de etanol 95% gota a gota, ao mesmo tempo em que vórtex a centrifugação das células a 500 vezes a gravidade durante cinco minutos à temperatura ambiente. Remova novamente o etanol e re-suspenda o pellet em um mililitro de HCl 2 normal contendo 0,5% de Triton X-100, adicionando a solução às células gota a gota sob agitação em vórtex, e então incube as células à temperatura ambiente por 30 minutos. Após centrifugar as células novamente, aspire o sobrenadante S, tomando cuidado especial, pois as células formam um pellet muito solto nesta etapa.Em seguida, ressuspenda suavemente o pellet em um mililitro de tetraborato de sódio 0,1 molar e incube as células novamente. Agora, pelletize as células mais uma vez e, desta vez, incube-as em 0,5 mililitros de solução de anticorpos contendo anticorpos anti-BRDU de camundongo diluídos na proporção de 1:50. Após pelletizar as células novamente, ressuspenda este pellet em 50 microlitros de solução de anticorpos contendo anticorpos secundários conjugados anti-US ZI de coelho, diluídos na proporção de 1:25.Em seguida, incubar as células no escuro por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação final, incubar as células em 0,5 mililitros de solução de iodeto de propídio e RNA no escuro a 37 graus Celsius por 30 minutos. Por fim, passar a solução celular digerida através de um filtro celular para remover agregados.Em seguida, transfira as células individuais para um tubo apropriado para a introdução da amostra no citômetro de fluxo, para populações celulares que proliferam de forma assíncrona, como a mostrada neste exemplo. Neste caso, posicione um portão ao redor dos dois picos mais abundantes no gráfico de discriminação de dupletos, a fim de selecionar eventos de células individuais para todas as análises subsequentes. Em seguida, analise uma amostra de cultura em proliferação assíncrona para servir como controle positivo para a coloração e para a configuração dos parâmetros do citômetro de fluxo.Ajuste a sensibilidade do tubo fotomultiplicador para a coloração com iodeto de propídio de modo que os picos de duas N e quatro N das células individuais fiquem centralizados nos valores arbitrários de 200 e 400 no eixo x. Em seguida, ajuste a sensibilidade do tubo fotomultiplicador de detecção de FXI de forma que as células negativas para FXI estejam acima dos níveis de fundo. As células positivas para BRDU devem ser aproximadamente 10 vezes mais brilhantes, e o eixo x deve ser exibido em escala logarítmica.Os eventos individuais capturados pelo citômetro de fluxo formam um arco em forma de ferradura, partindo da fase G1 no canto inferior esquerdo, passando pela fase S e retornando ao canto inferior direito para a fase G2/M. Como mostrado nesta figura representativa, colete entre 5.000 e 10.000 eventos de células individuais para alcançar a faixa desejada de conteúdo de DNA. Após medir o conteúdo de iodeto de propídio e de BrdU, atribua as células às fases G1, S ou G2/M com portas ao redor das duas populações negativas para BrdU, centradas em 200 para G1 e 400 para G2/M. Inclua todos os eventos acima dessas duas caixas em uma única porta para medir a fase S; a porcentagem de células em cada porta representará o número relativo de células nas fases G1 e G2/M, conforme demonstrado neste gráfico de barras para a figura anterior do diagrama de dispersão.Após a coloração para um marcador celular de interesse neste exemplo CD20, centrifugue as células a 500 vezes a gravidade durante 10 minutos a 22 graus Celsius e, em seguida, re-suspenda o pellet em cinco mililitros de PBS suplementado com 1% de BSA. Após a nova centrifugação das células a 500 vezes a gravidade durante cinco minutos à temperatura ambiente, utilize 0,5 mililitros da solução de iodeto de propídio e RNA para reidratar as células. Em seguida, cora e digira as células conforme acabou de ser demonstrado, delimite os picos de células simples em 2n e 4n e, então, ajuste a sensibilidade do tubo fotomultiplicador para a detecção de FXI de modo que as células não coradas estejam acima dos níveis de fundo.De preferência, as células positivas para CD 20 FXI devem apresentar coloração de 10 a 100 vezes mais intensa do que o fundo. Novamente, o eixo x deve ser exibido em escala logarítmica. Por fim, selecione as células positivas para CD 20 que sejam 10 vezes mais brilhantes que os níveis de fundo e que apresentem coloração com iodeto de propídio entre 200 e 400 para exibição em um histograma de iodeto de propídio versus contagem de células, como mostrado nesta figura de exemplo; colete pelo menos 1000 eventos positivos para CD 20 para cada amostra, a fim de limitar a variabilidade nesta figura.É exibida a análise tridimensional por citometria de fluxo de células coradas com iodeto de propídio e BRDU. Observe que as células com conteúdo de DNA 2n e 4n estão centralizadas sobre as marcas 200 e 400 na escala do eixo X. Para a intensidade da coloração com iodeto de propídio, a intensidade da coloração com BRDU é medida em uma escala logarítmica.No eixo Y, observe as posições dos gates utilizados para quantificar células nas fases G1 e G2/M do ciclo celular. A proporção relativa de células em cada um dos gates G1 e G2/M da figura anterior é mostrada aqui. Aqui, propídio, iodeto e CD20.Mostra-se a coloração de uma mistura de células, algumas das quais expressavam ectopicamente CD20 e PRB. Observe que as células com dois n e quatro NDNA, as populações mais abundantes, estão centralizadas sobre as marcas 200 e 400 no eixo x. A posição das células selecionadas positivas para CD20 que são coradas pelo menos 10 vezes mais intensamente que o fundo.Este histograma representa a contagem de células versus coloração com iodeto de propídio para células negativas para CD20 do scatterplot anterior que estão proliferando de forma assíncrona. Neste histograma, células positivas para CD20 do scatterplot anterior de CD20 que foram induzidas a parar com a expressão de pRRB e que contêm células com conteúdo predominantemente de 2N de DNA são mostradas. Esses dados demonstram que uma subpopulação parada pode ser distinguida das demais células na cultura utilizando esta técnica de coloração. Nas próximas três figuras, são apresentados dados da análise citométrica de fluxo da expressão retroviral do inibidor de quinase dependente de ciclina p27KIP1 em fibroblastos embrionários de camundongo.O iodeto de propídio e a análise de BRDU foram utilizadas para medir as fases do ciclo celular em uma população de células que proliferam de forma assíncrona e que foram transduzidas com um vetor retroviral P babe vazio, conforme mostrado aqui. Poucos eventos positivos para BRDU foram evidentes no compartimento da fase S em resposta ao P 27. Observe também a maior intensidade dos eventos nos compartimentos G um e G dois M.Da mesma forma, a porcentagem de células em fase S para células que expressam P 27 é bastante baixa, conforme esquematizado nesta figura. Esse tipo de análise tem sido muito eficaz na caracterização de déficits no controle do ciclo celular em células derivadas de diversas linhagens de camundongos com genes direcionados. Nas próximas duas figuras, células epiteliais de memória não formadas foram tratadas com a citocina inibidora do crescimento TGF beta um durante 24 horas.Como mostrado nesta primeira figura, a marcação com BRDU em células na fase S é grandemente reduzida pelo sinal do TGF beta um. Observe o acúmulo de células principalmente na fase G um do ciclo celular, conforme pode ser visto no painel central. A quantificação das diferentes fases do ciclo celular confirma que o TGF beta um inibe principalmente a proliferação na fase G um do ciclo celular, levando a um acúmulo nesta fase.Nesta última série de análises experimentais, células duplo deficientes em PRB e SAS foram transfectadas com o vetor de expressão CMV CD 20 e com CMV RB ou CMV beta GAL como controle. Esta primeira figura demonstra a distribuição do ciclo celular das células transfectadas com o controle negativo comparada à sua distribuição após 72 horas de expressão de PRB. Observe a presença quase exclusiva de um pico em dois N no painel direito; neste último gráfico, o ajuste de curva por software multicitos revelou que as células se acumularam principalmente na fase G um após a expressão de PRB.Embora as populações nas fases S e G2/M estivessem relativamente reduzidas. Uma vez dominada, esta técnica pode ser adaptada para estudar outros marcadores do ciclo celular, como histonas fosforiladas em mph. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar a distribuição do ciclo celular em uma população de células.Não se esqueça de que o ácido clorídrico normal é cáustico e o iodeto de propídio é um potencial carcinogênico. Eles podem ser perigosos em.Precauções devem sempre ser tomadas ao utilizar esses produtos químicos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Controlando mudanças subtis na progressão e cinética de fases do ciclo celular pode ser conseguida pelo uso de uma combinação de marcação metabólica de ácidos nucleicos com BrdU e coloração do ADN genómico total de via iodeto de propídio. Este método evita a necessidade de sincronização química de células de bicicleta, impedindo assim que a introdução de não-específica danos no ADN, que por sua vez afecta a progressão do ciclo celular.

Medindo a progressão do ciclo celular Cinética com marcação metabólica e Citometria de Fluxo

Metáfase para anáfase transição é disparada através anáfase-promover complexo (APC / C) dependente de ubiquitinação e subsequente destruição da ciclina B. Aqui, nós estabelecemos um sistema que, na sequência de pulso-caça, rotulagem permite monitorar proteólise ciclina B em populações de células inteiras e facilita a detecção de interferência do checkpoint mitótico.

Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

miRNA ou microRNA são os principais reguladores da progressão do ciclo celular. Este vídeo descreve uma análise do ciclo celular baseada em citometria de fluxo de células de câncer de pulmão transfectadas com miRNA, para estudar o efeito do miRNA na regulação do ciclo celular. A inibição da proliferação pela interrupção da progressão do ciclo celular mostrou potencial para ser uma abordagem promissora para o tratamento do câncer.

Análise do ciclo celular: uma abordagem para estudar a regulação do ciclo celular de células de câncer de pulmão transfectadas com miRNA

Este protocolo descreve o uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir a absorção de seguimento temporais de células que estavam na fase S de um determinado ponto no tempo. A adição de corantes de ADN e rotulagem anticorpo facilita a análise detalhada do destino das células em fase S em momentos posteriores.

Acompanhamento Temporal de progressão do ciclo celular utilizando citometria de fluxo, sem a necessidade de sincronização

Relatamos dois protocolos de sincronização de células que fornecem um contexto para estudar eventos relacionados a fases específicas do ciclo celular. Mostramos que essa abordagem é útil para analisar a regulação de genes específicos em um ciclo celular não perturbado ou após a exposição a agentes que afetam o ciclo celular.

Estudando a expressão de genes regulada pelo ciclo celular por dois protocolos complementares de sincronização de células

Apresentamos um protocolo para sincronização de timidina duplo de células HeLa, seguido de análise utilizando microscopia confocal de alta resolução. Esse método é a chave para a obtenção de grande número de células que proseguem sincronicamente de fase S de mitose, permitindo estudos sobre funções mitóticas das proteínas multifunctional que também possuem funções de interfase.

Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

É descrito um método baseado em imagens que pode ser usado para identificar a fase S e analisar a dinâmica do ciclo celular no germline hermafrodita de c. elegans , usando a timidina EdU analógico. Este método não requer nenhum transgenes e é compatível com coloração imunofluorescente.

Análise de ciclo celular no Germline de c. elegans com o EdU analógico de timidina

Este protocolo descreve como isolar os queratinócitos da pele dos modelos do rato, manchar com os anticorpos metal-etiquetados, e analisar pilhas manchadas pela citometria maciça a fim examinar o teste padrão da expressão das proteínas do interesse nas fases diferentes do ciclo de pilha.

Isolação e mancha de keratinocytes da pele do rato para a análise específica do ciclo de pilha da expressão celular da proteína pela citometria maciça

Este protocolo detalha dois métodos de parada do ciclo celular de levedura e liberação opcional, e elabora o uso de microscopia de fluorescência para estudar processos dependentes do ciclo celular em S. cerevisiae.

Manipulação e Análise de Processos Dependentes do Ciclo Celular em Leveduras de Brotamento

Longo prazo células de mamíferos utilizando imagens do Largo-Campo Microscopia

Aprenda a determinar a posição do ciclo celular em células de mamíferos usando citometria de fluxo com marcação BRDU e iodeto de propídio. Este método permite quantificar células nas fases G1, S e G2/M com precisão.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

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