Name: Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprenda a realizar imagem intravital do timo em ratos usando microscopia de dois fótons. Este método permite observar timócitos em vivo e estudar o desenvolvimento de células T em tempo real.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. David Olivieri para revisão crítica deste manuscrito, Dr. Nuno Moreno pela ajuda logística para construir o nosso titular animal e almofadas de aquecimento e Dr. Vijay K. Kuchroo para o tipo de doação Foxp3-KI gfp / gfp camundongos. Este trabalho é apoiado pela &quot;Fundação para Ciência e Tecnologia&quot; (FCT, Portugal), conceder # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.

1. Preparação de animais Notas importantes: suspensões de células do timo BM e transplantes foram realizados em condições assépticas. As suspensões foram preparadas BM no interior do capuz da nossa sala de cultura de células, enquanto que o transplante de timo foi realizada na sala cirúrgica localizada dentro de nossas instalações para animais. A fim de manter e garantir essas condições assépticas, que não foram autorizados a gravar nosso vídeo nesses lugares. No entanto, todos os materiais cirúrgicos foram autoclavados e da bancada cirúrgica foi previamente limpa com Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc.) e etanol 70%. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) e eles estavam de acordo com a Federação das Associações Laboratório Europeu de Ciência Animal (FELASA) directivas. O número de identificação de aprovação é AO10/2010. Todos os experimentos foram imagem de procedimentos terminal e os animais foram sacrificados imediatamente após o fim da imagemaquisição. O procedimento detalhado é o seguinte: <ol><li> Irradiar (com um irradiador γ) 8 semanas de idade camundongos Nude com 900 rads para destruir os precursores endógenos hematopoiéticas dentro da medula óssea (BM). Após a irradiação, o retorno dos animais ao seu gaiolas até que você prepare as células do doador BM para injecção intravenosa e reconstituição BM ainda mais. Esta transferência foi realizada BM 1 h após a irradiação. </li><li> Separar os animais dadores BM. Tíbias e fêmures de membros posteriores de um animal são geralmente suficientes para reconstituir até 3 animais destinatário. Após eutanásia com CO 2, retire a membros posteriores e, em seguida, retire a pele e os músculos dos ossos. </li><li> Corte a extremidade fechada de cada osso e lave-o com PBS (ou RPMI) ou esmagá-los todos em um almofariz, usando um pilão, com 2 ml de PBS (ou RPMI) para remover o BM. </li><li> Romper a estrutura BM em uma suspensão de uma única célula por repetições de vigorosa aspiração using uma pipeta P1000. Alternativamente, você também pode passar o BM através de uma agulha da seringa 21G várias vezes. Centrifugação (400g, 5 min, RT), re-suspender as células em PBS, e injectar por via intravenosa em sua nude-irradiados destinatários. Em nossos experimentos usamos BM de Foxp3-KI gfp / mice gfp, onde todas as células T reguladoras (Tregs) vai expressar GFP 1. </li><li> Aceitação da BM doador ocorre nos primeiros dias após a transferência, uma vez que não BM-reconstituída animais não podem sobreviver mais de 14 dias. No entanto, deve-se esperar por 4 a 6 semanas para permitir a recuperação completa de todos os compartimentos BM. Bactrim (Roche) foi adicionado à água (2 mg / ml) durante a primeira semana após a irradiação para diminuir o risco de infecções bacterianas. </li><li> Embrionárias timo transplante já foi descrito 2. Brevemente, começar a criação de pares de camundongos isogênicos e verifique se há entupimento (evidência de coito) todos os dias. Fêmeas em separado conectado e CO 2-sacrificá-los no dia 15 de pregnAncy (observação de plug é dia 1 de gravidez). Remoção dos embriões eo timo. Coloque o timo embrionárias no frio PBS até a transferência. </li><li> Para realizar o transplante timo, anestesiar BM-destinatário camundongos Nude com cetamina (120 mg / g de peso do rato) / xilazina (16 mg / g de peso do rato) e mantê-los em cima de uma almofada de aquecimento a 37 ° C até se obter inconsciente. </li><li> Cirurgicamente expor o rim para realizar o transplante do timo. Primeiro esfregue a pele com ChloraPrep (CareFusion Inc.) e etanol 70%. Então, faça um corte um centímetro na pele da parte do corpo volta-lateral do animal, 2 mm abaixo da última costela torácica. </li><li> Corte a cavidade peritoneal e puxe o rim desta cavidade. Faça um pequeno corte superficial na cápsula renal com uma lâmina de bisturi. Utilizando uma pinça com uma ponta muito fina fazer uma bolsa debaixo da cápsula renal do rato do destinatário e adicione até 4 lobos do timo nessa bolsa. </li><li> Coloque o b renal ack ao seu lugar, sutura da cavidade peritoneal com um ou dois pontos, e feche a pele do rato usando o método de sutura mesmo. Alternativamente, suturas pode ser feito usando cola cirúrgica. </li><li> Injetam analgésicos (butorfanol a 5 mg / kg) por via subcutânea imediatamente após o término da operação para evitar a dor dos animais e manter os animais em uma almofada de aquecimento até que começar a se recuperar da anestesia. Os ratos são gaiolas individualmente para os 3 primeiros dias após o transplante para prevenir companheiros de gaiola de remover os pontos. Remove pontos após 1 semana. </li><li> Camundongos nude não têm células T. Portanto, você pode avaliar a aceitação do enxerto timo, monitorando a percentagem de CD4 + ou CD8 + T no sangue. Uma vez por semana, duas semanas após o transplante timo, sangrar os animais e manchar o sangue com anti-CD4 e anti-CD8 anticorpos monoclonais (MAbs). Quando o CD4: CD8 é de aproximadamente 2:1, o timo transplantado é totalmente funcional (Figura 1). </li></ol>"&gt; 2. Intravital aquisição de imagem Prepare todos os materiais que você vai precisar de antecedência e colocá-los de lado. <ol><li> Anestesiar animais com cetamina / xilazina (mesmas doses descritas no item 1.5) e colocá-los em cima de uma almofada de aquecimento a 37 ° C. Injetar 100 ml de Rodamina B isotiocianato-Dextran (20 mg / ml em PBS) por via intravenosa para permitir a visualização futuro do fluxo sanguíneo. </li><li> Expor o rim transplantado que contém o timo de acordo com o protocolo previamente descrito no item 1.6. </li><li> Para evitar que o rim de volta à sua posição original, feche as laterais da incisão na pele com pontos. </li><li> Coloque um pedaço de algodão embebido PBS-na parte superior do órgão para mantê-lo úmido. </li><li> Coloque a almofada de aquecimento em cima do palco titular animal (Figura 2A). </li><li> Colocar o animal em cima da almofada de aquecimento no porta-animal, até de órgãos (Figura 2B). </li><li> Pitada o órgão em ambos os lados com uma braçadeira made de papel de alumínio fino (Figura 2C). </li><li> Feche o suporte do animal e colocar a sonda aquecedor superior o mais próximo possível de seu tecido (Figura 2D). Esta sonda aquecedor constantemente mede a temperatura de órgãos e envia essa informação para o aquecedor para ajustar a corrente elétrica, mantendo-o a 37 ° C. </li><li> Remover o algodão embebido PBS e adicionar ponto de fusão baixo agarose (2% em PBS) a 30 ° C no topo de sua preparação. </li><li> Cobrir toda a preparação com o aquecedor superior (Figura 2E). Na abertura deste aquecedor há uma lamela isolar a agarose do objetivo (Figura 2F). Monitorar a anestesia do mouse e injetar um impulso meia dose a cada 40 min. Após a aquisição da imagem, eutanásia do animal com CO 2. </li></ol> Nota: imagens do clipe de papel-alumínio e do aquecedor superior são apresentados na Figura 3. 3. Dois fótons de aquisição de imagem Usamos uma posição vertical "Prairie Ultima XY" microscópio de dois fótons. Nosso sistema é equipado com uma Ti: Sapphire laser, quatro PMTs superior para simultânea de até 4 aquisições do canal e um 20x objetivo imersão em água. <ol><li> Ligue a Ti: Sapphire laser eo sistema de microscópio todo. </li><li> Adicionar espelhos dicróicos e conjuntos de filtros de acordo com os comprimentos de onda desejados. No nosso caso, usamos um titular Olympus-BX2 Chroma contendo um espelho nm 565 dicróicas, um filtro 525/50 nm (para Foxp3 GFP-sinal), e um filtro 595/50 nm (para Dextran-rodamina-B do sinal dentro dos vasos sanguíneos ). A faixa de comprimento de onda do laser utilizado foi entre 880-900 nm. </li><li> Adicione o detentor de animais ao microscópio, conectar e ligar todos os aquecedores, adicione água sobre a abertura do aquecedor superior, inferior cuidadosamente o objectivo para a água, e se concentrar em um vaso ou algum GFP-Tregs. </li><li> Com o microscópio x, y, z controle externo, de forma rápida pesquisa no tecido para localizar uma região de interesse. </li><li> Ajustar o ganho no PMTs para otimizar a separação de cores e minimizar a quantidade de laser necessária para conseguir sinal suficiente sobre o fundo. Tente usar a quantidade mínima de laser para evitar a foto-dano do seu tecido. </li><li> Uma vez que a região de interesse está localizado, comece lapso de tempo de imagem. No nosso caso, uma 5D típico (x, y, z, t, e cor) protocolo de aquisição consiste em adquirir imagens sequenciais de um volume de tecido 50 mm profundidade, dividido em 4,0 mM z-passos, x e y comprimento de 140 mM cada um. Cada volume tem cerca de 30 segundos a serem adquiridos. Portanto, 60 aquisições irão realizar cerca de 30 min de aquisição de imagem. </li><li> Transferir os dados para o servidor institucional e uso ImageJ, Imaris, ou software Volocity para executar multi-dimensional de processamento e monitoramento celular. </li></ol> 4. Resultados representante g1.jpg "/&gt; Figura 1. . Embrionárias aceitação timo e função BM Após se recuperar, timo embrionárias foram transplantadas para animais BM reconstituída; duas semanas após o transplante de timo, esses ratos foram sangrados uma vez por semana para monitorar o percentual de subtipos de células T através da coloração com anti-CD4 e anti-CD8 MAbs. Consideramos o timo foi aceito com sucesso em animais com um CD4: CD8 em torno 1.5-2.0:1 (A). Para confirmar a sua funcionalidade, sacrificamos alguns animais timo-transplantados e comparou o percentual de diferentes subpopulações timócito com camundongos WT (B). As porcentagens de dupla negativa (DN; CD4 - CD8 - timócitos) subpopulações (por coloração com anticorpos anti-CD25 e anti-CD44 MAbs), duplo-positivos (DP; CD4 + CD8 + timócitos) e single-positivo (SP) CD4 + ou CD8 + timócitos foram semelhantes entre esses animais. ig2.jpg "/&gt; Figura 2. Conjunto do suporte de animais. Depois profundamente anestesiado, o animal é colocado em cima de uma almofada de aquecimento, anteriormente montado em cima do palco titular animal (A). O rim transplantado que contém o timo é voltada para cima (B). Um prendedor de folhas de alumínio delicadamente aperta o rim inteiro (C) para mantê-lo no lugar. Fig. 1C inserir mostra em detalhes do grampo. A parte superior do porta-animal é posto em prática (D). O algodão embebido PBS é removido do topo do órgão, substituído pelo quentes ponto de fusão baixo agarose, eo aquecedor superior é adicionado (E). Finalmente, toda a assembléia é transferido para o microscópio, aqui representado pelo objetivo (F). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3504/3504fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Detalhes das peças titular. Essas imagens mostram o prendedor de folhas de alumínio (A) segurando o rim (B). Note também a região onde o timo transplantado é localizado. Esta aproximadamente indica a regiãopara cortar a cápsula do timo e fazer o bolso para colocar o timo embrionárias. A lamela aquecedor superior (C) foi fixado com cola de silicone para a sua parte inferior (D). Movie 1. Intravital imagem de timócitos + Foxp3-GFP dentro do timo, onde os níveis fisiológicos de oxigenação e temperatura (37 ° C) foram mantidos durante todo o processo. Observe o fluxo sanguíneo e do movimento de Tregs. Estas velocidades podem ser medido e comparado com os dados publicados. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie1.avi">Clique aqui para ver o filme.</a> Filme 2. Intravital imagem de Tregs no interior de um timo onde as imagens foram adquiridas menos 30 ° C. Note a ausência de movimento e a forma redonda das células, apesar da manutenção do fluxo sanguíneo. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie2.avi">Clique aqui para ver o filme.</a>

<ol><li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li>
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<li>Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+regulatory+T+cell+control+of+autoimmune+responses+in+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice.</a> Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).</li>
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<li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li>
</ol>

Não temos nada a revelar.

Neste trabalho, demonstrou os procedimentos para dois fótons de imagem de timócitos dentro de um animal vivo. Nós também descreveu alguns parâmetros que se deve controlar cuidadosamente, como a continuação do fluxo sanguíneo e à manutenção da temperatura do órgão durante os procedimentos de imagem. No entanto, apesar dos esforços o cuidado de manter o órgão estável, artefatos de movimento, como &quot;órgão drifting&quot; pode ocorrer. Correção de imagem posterior pode ser realizado através do desenvolvimento de algoritmos projetados especificamente para esta finalidade. Análise de imagem mais também poderia ser a fonte do desenvolvimento de novos protocolos que visa a minimizar os erros. O timo é o órgão onde todas as células T são produzidos e, portanto, é o órgão onde imunologistas interessados ​​em compreender a geração de γδ, CD4 ou células T CD8 irá centrar a sua atenção. A maioria dos estudos sobre as células T são baseadas em diferenças de números e / ou estabilidade destas cells após diferentes in vitro / in vivo manipulações. No entanto, somente após a visualização in vivo pudemos observar a interação entre as células do sistema imune envolvidos na manutenção da homeostase 3-7. Portanto, a observação em vivo dos timócitos é provavelmente uma das informações mais importantes em falta para compreender melhor a biologia das células T. Intravital TPM fornece um retrato detalhado dos movimentos de células T e as interações e demonstramos aqui como ele pode ser usado para estudos detalhados de timócito. No entanto, cada técnica tem suas limitações. Embora a aquisição de imagens intravital é o sistema mais acurado para refletir o comportamento de células dentro do corpo, também é verdade que a aquisição da imagem explantado de órgãos é menos trabalhoso e tem sido utilizado para coletar informações importantes sobre o sistema imunológico 8,9. Além disso, não se pode negar métodos de imagem intravital requerem cirurgia para expor os tecidos e vasos sanguíneos em animais anestesiados,que por si só pode causar uma alteração no órgão toda a fisiologia 10. No entanto, existem métodos não-invasiva que abolir a artefatos causados ​​pelo procedimento cirúrgico 11 e novos métodos estão sendo desenvolvidos que melhor se preparar com antecedência os animais a serem utilizados 12. Portanto, novos procedimentos cirúrgicos e portagens irá minimizar ou ignorar as limitações reais de aquisição de imagens intravital e se tornar mais e mais acessível à comunidade científica. Nós demonstramos que o método que descrevemos é viável e que relata todas as manipulações in vivo sistêmica, a administração dessas drogas, que temos usado. Assim, sugerimos o uso deste método em conjunto com técnicas ex vivo já disponíveis, a fim de complementar e reforçar mais estudos sobre o desenvolvimento timócitos.

<table border="1"><thead><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr></thead><tbody><tr><td> Rodamina B ishothiocyanate-Dextran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R9379 </td><td> preparar estoque em 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Microscópio de dois fótons </td><td> Prairie Technologies Inc. </td><td> Prairie Ultima XY </td><td></td></tr><tr><td> Ti: Sapphire a laser </td><td> Coerente, Inc. </td><td> Chameleon Família Ultra </td><td></td></tr><tr><td> 20x/1.00 objetiva de imersão NA </td><td> Olympus Inc. </td><td> XLUMPLFLN 20XW </td><td></td></tr><tr><td> Titular (Filtros / Dichroic) </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> 91018 BX2 (U-MF2) </td><td></td></tr><tr><td> 525 nm/50 filtro </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> ET525/50m </td><td></td></tr><tr><td> 595 nm/50 filtro </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> ET595/50m </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 565 nm dichroic </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> 565dcxr </td><td></td></tr><tr><td> Imaris software </td><td> Bitplane AG Inc. </td><td> Imaris </td><td></td></tr><tr><td> Volocity </td><td> PerkinElmer Inc. </td><td> Volocity </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> NIH, EUA </td><td> ImageJ </td><td></td></tr></tbody></table>

imagem intravital da thymus rato usando 2-photon microscopia

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Dois fótons-Microscopia (TPM) fornece a aquisição de imagens em áreas mais profundas dentro tecidos e órgãos. Em combinação com o desenvolvimento de ferramentas estereotáxica novo e procedimentos cirúrgicos, TPM se torna uma poderosa técnica para identificar &quot;nichos&quot; dentro de órgãos e ao documento celular &quot;comportamentos&quot; de animais vivos. Enquanto imagem intravital fornece informações que melhor se assemelha ao comportamento real celulares dentro do órgão, é tanto mais trabalhoso e tecnicamente exigentes em termos de equipamentos necessários / procedimentos alternativos que ex aquisição de imagem in vivo. Assim, nós descrevemos um procedimento cirúrgico e da novela titular do órgão &quot;estereotaxia&quot; que nos permite acompanhar os movimentos de Foxp3 + células dentro do timo. Foxp3 é o regulador mestre para a geração de células T reguladoras (Tregs). Além disso, essas células podem ser classificadas de acordo com sua origem: ou seja. timo diferenciadas Tregs são chamados de &quot;ocorrência natural Tregs&quot; (nTregs), como opposed para perifericamente convertida Tregs (pTregs). Apesar de quantidade significativa de pesquisas tem sido relatado na literatura sobre o fenótipo e fisiologia destas células T, muito pouco se sabe sobre suas interações em vivo com outras células. Esta deficiência pode ser devido à ausência de técnicas que permitissem tais observações. O protocolo descrito neste artigo fornece um remédio para esta situação. Nosso protocolo consiste na utilização de camundongos nude que falta um timo endógena, uma vez que têm uma mutação pontual na seqüência do DNA que compromete a diferenciação de algumas células epiteliais, incluindo células epiteliais tímicas. Camundongos nude foram gama-irradiados e reconstituídos com abobrinhas óssea (MO) de camundongos GFP / gfp Foxp3-KI. Depois BM recuperação (seis semanas), cada animal recebeu transplante embrionário timo dentro da cápsula renal. Após a aceitação do timo (6 semanas), os animais foram anestesiados, o rim que contém otimo transplantado foi exposto, fixo em nosso titular do órgão, e mantidos sob condições fisiológicas para in vivo de imagens por TPM. Temos vindo a utilizar essa abordagem para estudar a influência de drogas na geração de células T reguladoras.

Nós desenvolvemos novas ferramentas de laboratório e protocolos para aquisição de imagens intravital do timo. Nossa técnica deve ajudar na identificação de &quot;nichos&quot; dentro do timo, onde o desenvolvimento de células T ocorre.

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

A microscopia de dois fótons (TPM) permite a aquisição de imagens em áreas profundas no interior de tecidos e órgãos. Em combinação com o desenvolvimento de novos sistemas estereotáxicos...

A microscopia de dois fótons permite a aquisição de imagens em regiões profundas dentro dos órgãos. A excitação de proteínas fluorescentes na microscopia de dois fótons é alcançada quando dois fótons de energia aproximadamente igual interagem com a molécula, produzindo uma excitação equivalente à absorção de um único fóton com o dobro da energia. Portanto, em um microscópio de dois fótons, são utilizados lasers de infravermelho, permitindo a aquisição de imagens em tecidos espessos e minimizando o fotodesbotamento e os danos fotoinduzidos.Além disso, como a excitação é restrita ao plano focal, não há fluorescência fora de foco. Juntamente com novas ferramentas estereotáxicas e procedimentos cirúrgicos, torna-se uma técnica poderosa para documentar comportamentos celulares em animais vivos. Neste artigo, a microscopia de dois fótons foi utilizada para adquirir imagens intravital do timo.Neste órgão, ocorre a maturação de linfócitos T e, portanto, esta técnica pode ser útil em estudos envolvendo o desenvolvimento de timócitos. Agora vamos iniciar os protocolos. Primeiramente, para preparar os animais, irradie animais nus de oito semanas de idade com 900 rads. Após a irradiação, devolva os animais à gaiola até o transplante de medula óssea.Para preparar a suspensão de medula óssea após a eutanásia com dióxido de carbono de camundongos doadores e a remoção das patas traseiras, a pele e o músculo são removidos dos ossos e reservados em PBS. Transfira os ossos para um novo recipiente de Petri contendo PBS. Corte as extremidades dos ossos.Encha uma seringa com PBS e lave os ossos utilizando uma agulha de 25 graus. Alternativamente, transfira os ossos para um almofariz e triture-os com um pistilo, homogeneizando a medula óssea com pipetagem vigorosa. Centrifugue a suspensão por cinco minutos a 400 G. Resuspenda.Suspenda as células em PBS e injete intravenosamente no seu camundongo irradiado. Uma certa fragilidade da medula óssea ocorre nos primeiros dias após a transferência. Como não há reconstituição com 10 pl, os camundongos começam a morrer 10 dias após a irradiação.No entanto, aguardamos de seis a oito semanas para considerar nossos animais completamente reconstituídos. Para continuar o preparo dos animais, quatro a seis semanas após a transferência da medula óssea, será realizada a transplante de timo embrionário para permitir a observação de timócitos in vivo.Primeiro, após a eutanásia, em dia 15, de fêmeas grávidas com dióxido de carbono e a coleta dos embriões, remova o timo de cada embrião e coloque-os em uma placa com PBS frio até o uso. Anestesie os animais receptores com cetamina e xilazina e mantenha-os sobre uma placa aquecida. Quando o animal estiver profundamente anestesiado, lave a região com etanol. Corte a pele, corte a membrana peritoneal, localize e exponha o rim.Uma vez exposto o rim, faça um pequeno corte na cápsula renal e crie um bolsão sob ela. Os timos embrionários são colocados dentro desse bolsão. Por fim, retorne o rim à sua posição original e feche a cavidade peritoneal e a pele.Com pontos, o animal deve receber analgésicos e ser colocado sobre uma almofada aquecida até começar a se recuperar dos anestésicos. A proporção entre células CD quatro positivas e células CD oito positivas pode ser acompanhada semanalmente por meio de análise de amostra sanguínea. Animais com uma proporção em torno de 1,521 aceitaram o timo.As porcentagens das populações de linfócitos T no timo transplantado são semelhantes às porcentagens encontradas no timo endógeno de animais controle. A imagem intravital do timo transplantado exigirá uma nova cirurgia em animal e o uso do nosso dispositivo de fixação de animais. Primeiro, injete cetamina, xilazina e anestésicos.Uma vez que o animal esteja inconsciente, coloque-o sobre uma almofada aquecida por via intravenosa. Injete dextrana isotiocianato de Rodina para permitir a observação futura do fluxo sanguíneo no seu tecido. Abra a pele e a cavidade peritoneal para expor o rim que contém o timo transplantado, evitando que o rim retorne à sua posição original.Fechamento do lado lateral da incisão na pele com pontos. Transfira o animal para o aquecedor localizado na parte superior do suporte do animal. Pince ambas as laterais do rim.Usando um grampo feito de folha de alumínio. Feche o suporte do animal e coloque o aquecedor superior. Posicione a sonda o mais próximo possível do seu tecido.Adicione agarose de baixo ponto de fusão sobre a sua preparação. Cubra toda a preparação com o aquecedor superior. Monitore a anestesia e administre reforços anestésicos a cada 40 minutos.Após concluir a cirurgia, todo o conjunto é agora transferido para o microscópio de dois fótons para aquisição adicional de imagens. No nosso caso, utilizamos um microscópio de dois fótons Prairie Ultima equipado com um laser de safira sintonizável, quatro PMTs superiores e uma objetiva de imersão em água de 20x. Primeiro, ligue o laser e o microscópio.Em seguida, adicione os espelhos RIC e os conjuntos de filtros de acordo com os comprimentos de onda desejados. Coloque o animal no microscópio. Conecte todos os aquecedores a seus controladores.Adicione água sobre a abertura do aquecedor superior e abaixe cuidadosamente a objetiva na água. Foque em vasos sanguíneos ou regiões GFPT utilizando o controlador externo XY, Z. Localize rapidamente a região de interesse.Ajuste o ganho nos PMTs para otimizar a separação de cores e minimizar o laser necessário para obter um sinal suficiente em relação ao fundo. Uma vez localizada a região de interesse, inicie a aquisição de imagens em lapso de tempo adquirindo imagens sequenciais de um volume de tecido com profundidade de 50 micrômetros na configuração básica. Cada volume leva 30 segundos para ser adquirido.Portanto, uma aquisição de imagem de 30 minutos é alcançada após 60 repetições sequenciais deste volume. Este vídeo mostra células positivas para GFP dentro do timo. Observe o movimento celular e o fluxo sanguíneo dentro dos vasos.No entanto, se o preparo não for adequado, nesse caso, a temperatura do órgão é baixa. As células param de se mover mesmo com o fluxo sanguíneo contínuo. O método aqui descrito permite a observação in vivo de timócitos.Estes métodos devem ser muito úteis para qualquer imunologista interessado em observar a distribuição e as interações de timócitos durante o desenvolvimento de linfócitos T, embora sejam bastante simples, devendo-se atentar a alguns passos para evitar artefatos experimentais. Por exemplo, é necessário ter cuidado para não danificar qualquer vaso sanguíneo, pois isso reduzirá a oxigenação dentro do tecido. Além disso, a temperatura deve ser mantida constantemente a 37 graus Celsius.Por fim, os resultados aqui obtidos devem ser muito úteis para validar quaisquer outros resultados obtidos por técnicas x vivo.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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