Isolamento e Estudo de Biofísica de Cutículas Frutas

Este experimento utiliza técnicas biofísicas para avaliar a capacidade de reticulação do polímero cuticular protetor do tomate e para monitorar a remoção seletiva de ceras epicuticulares e intracuticulares das cutículas dos frutos. O isolamento da cutícula a partir do fruto inteiro é realizado por meio de tratamento enzimático das cascas de tomate e das paredes celulares aderentes. Em um segundo passo, utiliza-se extração com ATE para descerar completamente a cutícula do fruto, a fim de obter a caracterização molecular da cutina isolada.

O poliéster biológico é analisado por ressonância magnética nuclear no estado sólido. A análise espectral de RMN no estado sólido revela que, na cutina de frutos de tomate com casca selvagem e modificada, existem diferenças nas proporções relativas de grupos alifáticos oxigenados capazes de formar ligações cruzadas. Alternativamente, o fruto inteiro é pintado e descascado com goma arábica para remover as ceras epicuticulares e, em seguida, mergulhado em clorofórmio para remover as ceras intracuticulares da cutícula do fruto.

Em seguida, as cutículas parcialmente despolidas de cera, isoladas pelo mesmo tratamento enzimático utilizado nas cascas de tomate, são examinadas por meio de ressonância magnética nuclear no estado sólido e microscopia de força atômica. Em última análise, a remoção sequencial das ceras epicuticulares e intracuticulares torna-se evidente pela observação de um pico de cera progressivamente decrescente nos espectros de RMN e por alterações no perfil da superfície da cutícula do fruto, observadas mediante imagens simultâneas de microscopia de força atômica. Órgãos aéreos de plantas são protegidos por uma estrutura poliéster-cerácea bioquímica chamada cutícula. Apresentaremos protocolos para avaliar a remoção seletiva de ceras internas e externas das cutículas de frutos de tomate utilizando ressonância magnética nuclear no estado sólido e microscopia de força atômica.

Esses métodos também podem ser utilizados para avaliar a capacidade de reticulação de materiais cuticulares projetados. Realizando os procedimentos estarão três membros do grupo Stark: Dr. Ishish Chatterjee, a candidata ao doutorado Shantani Sarkar e a ex-aluna do ensino médio Julia Tik. Um demonstrador adicional é a Dra. Olivia Nisau, pesquisadora pós-doutoranda no laboratório do nosso colega de engenharia química, Dr. Alexander S. Para iniciar o isolamento enzimático da pele do tomate, coloque três frutos comerciais ou cultivados em uma tigela, retire a pele em grandes seções e descarte o tecido interno do pericarpo.

Em seguida, lave as cascas de tomate com água desionizada e preserve-as submersas em um béquer, imergindo completamente a casca de tomate descascada em um coquetel enzimático preparado conforme descrito no protocolo escrito. Incube a 31 graus Celsius por 24 horas com agitação contínua. Colete as cascas de tomate utilizando um funil de Büchner ou peneira de cozinha e lave-as com água desionizada.

Após colocar as cascas em uma estufa a vácuo à temperatura ambiente por uma hora, as cascas secas podem ser armazenadas em um frasco rotulado e tampado. Para procedimentos subsequentes de desparafinação, encha um tímpano de vidro centralizado ou descartável até aproximadamente metade com a amostra de cutícula de tomate, utilizando pinças para colocá-la cuidadosamente na base da coluna de extração a ser usada na extração sólida. Continue a montar o aparelho de soxhlet utilizando metanol como solvente, conforme descrito no protocolo escrito.

Monitore o processo durante uma hora, ajustando a voltagem do variac para que o reservatório acumule cerca de uma gota por segundo e o sifonamento ocorra dentro das meias do aparelho. Quando o bulbo de extração estiver cheio, após uma extração de 12 horas, deixe o aparelho esfriar, abaixe o manto de aquecimento e remova o extrator e o reservatório como uma única unidade para descartar o solvente após a extração. Incline a coluna para permitir o sifonamento para o frasco abaixo.

Use pinças para elevar o cartucho até logo abaixo do pescoço da coluna de extração. Drene o solvente em excesso e coloque o cartucho sobre uma superfície limpa. Desconecte o frasco e despeje o resíduo em um recipiente para solvente devidamente rotulado.

Repita o procedimento de extração para solventes sucessivos de polaridade progressivamente decrescente, como clorofórmio e taxano, durante 12 horas cada. Uma vez que a amostra de cutícula de tomate esteja seca, meça a massa e armazene-a em temperatura ambiente em um frasco com tampa de rosca selada com parafina. Para preparar a amostra para RMN, coloque de quatro a seis miligramas de cutículas de tomate completamente livres de cera, denominadas cutina, em um rotor de zircônia de 1,6 milímetro para MAS rápido, utilizando a ferramenta de acondicionamento fornecida pelo fabricante.

Após instalar a tampa superior, pinte metade da tampa com uma caneta marcadora de tinta preta para permitir a medição da taxa de rotação. A configuração inicial do experimento de RMN no estado sólido é um processo tecnicamente exigente e deve ser realizada sob a supervisão de pessoal experiente. Comece ajustando a homogeneidade do campo magnético e otimizando os parâmetros experimentais utilizando um composto modelo, conforme descrito no protocolo escrito. Insira o rotor contendo a amostra e devidamente acondicionado na sonda e, em seguida, coloque a sonda no ímã.

Aumente gradualmente a velocidade de rotação até 10 quilohertz para verificar a boa compactação da amostra e a capacidade do rotor de girar de forma estável com variação inferior a 20 hertz. Ajuste iterativamente os capacitores de sintonia e casamento da sonda para obter a mínima reflexão de potência nas frequências de ressonância magnética nuclear do próton e do carbono 13. Estabeleça a temperatura experimental em 25 graus Celsius.

Inicie o experimento de CPMA pré-otimizado correspondente à condição de casamento de próton-carbono de Hartman-Hahn determinada na frequência de rotação de 10 quilohertz. Após adquirir 4.096 transientes, condicione o espectro com alargamento de linha exponencial de 50 a 100 hertz e realize uma transformada de Fourier para gerar um espectro de RMN de intensidade do sinal versus deslocamento químico em partes por milhão. Referencie os deslocamentos químicos de carbono-13 conforme descrito no texto.

Aumente a frequência de rotação do rotor para 15 quilohertz e repita a medição C-P-M-A-S correspondente à condição de Hartman Han Matching determinada na análise da frequência de rotação em escada do deslocamento químico do carbono C-P-M-A-S. Os espectros de RMN de 13 C identificaram os principais grupos funcionais presentes na cutícula de tomate cera DW exaustivamente, PHAs de cadeia longa, PHAs oxigenados, múltiplas ligações e aromáticos e rendimentos de carbono. Os almo oxigenados desempenham um papel crucial no estabelecimento de ligações covalentes entre as unidades monoméricas do biopolímero cutina, formando assim a arquitetura molecular da matriz de cutina.

Diferenças nas áreas relativas dos picos observadas na região espectral entre 45 e 100 partes por milhão sugerem que a cutina mutante possui uma proporção relativamente maior de agrupamentos estruturais CHO formadores de ligações cruzadas em comparação com a cutina do tipo selvagem. Para iniciar o isolamento seletivo das ceras epicuticulares e intracuticulares.

Lave um segundo lote de tomates inteiros com água destilada. Seque-os com toalhas de papel e lenços Kim e coloque-os com o cabinho voltado para baixo sobre uma folha de papel alumínio. Pinte os tomates inteiros de cima a baixo com uma solução aquosa de goma arábica a 120%.

Deixe a goma arábica secar na casca do fruto por uma hora, formando uma película fina. Remova esta película com pinça, mas evite perfurar a pele do tomate. O tratamento adicional da película conforme descrito no texto resulta na cera epicuticular.

Os tomates permanecerão fisicamente intactos. Mergulhe-os em clorofórmio por dois minutos. À temperatura ambiente, a cera intra-cuticular pode ser coletada após a evaporação do solvente; descasque os tomates e trate-os enzimaticamente com celulase e pectinase em tampão de acetato de sódio para remover celulose e pectina, respectivamente.

Uma extração com sali pode então ser realizada conforme descrito anteriormente para descerificar exaustivamente os tomates. Os experimentos C-P-M-A-S podem ser repetidos com amostras de cutícula de frutos naturais e parcialmente descerrificadas conforme descrito no texto. A configuração do microscópio de força atômica é um processo complicado e é melhor realizada inicialmente sob supervisão de técnicos experientes. Um FM começa ligando o microscópio de sonda de varredura, abreviado como SPM, e garantindo que o interruptor de seleção do modo do microscópio esteja definido para o modo de microscopia de força atômica de contato.

Em seguida, eleve manualmente a cabeça do MFP girando seus dois botões dianteiros ajustáveis pelo usuário. Desprenda o suporte da ponta FM da cabeça do MFP girando o parafuso de fixação na parte traseira da cabeça. Use pinças para remover a alavanca FM existente do seu suporte.

Em seguida, pegue cuidadosamente um novo cantiléver com ponta de nitreto de silício embalado e instale-o no lugar do cantiléver antigo. Utilize um microscópio óptico para verificar se o cantiléver FM recém-instalado não está quebrado. Fixe a amostra de cutícula de tomate em um puck de amostra com fita dupla face.

Utilize um microscópio óptico para verificar se a amostra de cutícula permanece plana e lisa. Após posicionar a amostra no puck, coloque a amostra de cutícula de tomate fixada ao puck na região magnética localizada no topo do scanner de SPM. Ajuste os dois parafusos manuais frontais do scanner, girando os botões, elevando-os o suficiente para evitar a quebra da ponta de FM.

Quando o suporte da ponta for colocado na cabeça do MFP, ajuste o parafuso traseiro motorizado a aproximadamente o mesmo nível dos outros dois parafusos dianteiros. Recoloque o suporte da ponta na cabeça do MFP e fixe-o apertando o parafuso de fixação traseiro da cabeça. Após ligar o laser, alinhe o ponto do laser sobre a alavanca de ressonância FM utilizando os botões centrais e direito de ajuste do laser na parte superior da cabeça.

Monitore o feixe de laser refletido em um pedaço de papel para posicionar o ponto do laser exatamente na extremidade de um cantiléver FM. Ajuste a posição do ponto do laser para obter o sinal soma máximo. Regule a posição do ponto de laser refletido no detector fotônico ajustando a posição do espelho móvel horizontal e verticalmente, garantindo que a luz incidente seja recebida de forma uniforme pelos quatro quadrantes.

O detector abaixa a ponta FM recuando os parafusos frontais controlados pelo usuário e o parafuso traseiro motorizado do scanner SPM. Monitore visualmente a aproximação da ponta FM em direção à superfície da amostra com um microscópio invertido. Certifique-se de que os três parafusos estejam no mesmo nível.

Para evitar artefatos provenientes da imagem de uma amostra inclinada, aproxime a ponta da amostra, mas não tanto a ponto de tocá-la ou romper sua superfície. A luz laser refletida no cantiléver de FM será refletida por um espelho móvel até um detector foto-sensível, no modo de contato de FM com uma ponteira de nitreto de silício. Ajuste a tensão do sinal de saída para menos dois volts no ponto de ajuste de zero volts e o sinal diferencial para zero volts, ajustando a posição do espelho.

Usando o software nano scope, clique no ícone do microscópio e selecione o perfil apropriado. No painel de configurações de controle de varredura, defina a taxa de varredura e o tamanho da varredura.

Permita que a ponta de FM-A entre em contato com a superfície da amostra clicando no ícone de engajamento da ponta. Ao controlar o parafuso traseiro motorizado da base do MSP, o programa agora irá abaixar a ponta até que ela entre em contato com a superfície da amostra. O processo de varredura iniciará automaticamente assim que a ponta for engajada com sucesso.

Monitore o processo de varredura utilizando os modos de imagem e de escopo do software, ajustando iterativamente os parâmetros para obter imagens com a mais alta resolução, conforme descrito no protocolo escrito. Por exemplo, inicie a varredura com um valor alto na escala de dados do eixo Z. Em seguida, reduza cuidadosamente o valor da escala de dados do eixo Z para obter o melhor contraste das características superficiais na imagem.

Capture a imagem para salvar o arquivo de dados. Processe os dados utilizando funções de nivelamento para remover artefatos de imagem decorrentes de deriva vertical do scanner, curvaturas da imagem e deslocamento vertical entre linhas de varredura. Por fim, calcule a rugosidade média do carbono.

Os espectros de RMN 13 C-P-M-A-S-N-M-R mostraram uma diminuição progressiva do pico de cera em 31 partes por milhão, indicando a remoção sequencial das ceras epicuticulares e intracuticulares do compósito de cutícula e cera, mantendo paralelamente a arquitetura química principal do biopolímero cutina. Uma análise de imagem de FM revelou irregularidades superficiais devido à extração progressiva da cera epicuticular e da cera intracuticular da cutícula do fruto, indicando alterações na organização do conjunto cuticular. Após dominar esta técnica, a remoção sequencial das ceras epicuticulares e intracuticulares das cutículas de frutos de tomate pode ser realizada em duas horas.

Ao realizar a extração em fase sólida para a remoção exaustiva das cutículas dos frutos, é importante usar um painel de solventes com polaridades variadas após utilizar o nó de contato. Um protocolo FM é ilustrado aqui. Experimentos adicionais de FM podem ser usados para medir a elasticidade da superfície da cutícula.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar sistematicamente os componentes do compósito cera-cutina e realizar a caracterização molecular e exame rápido da superfície dos materiais da cutícula utilizando RM em estado sólido e FM, respectivamente. As técnicas ilustradas neste vídeo tornam possível para pesquisadores em biologia vegetal determinar a composição molecular e a arquitetura supramolecular de tecidos vegetais naturais e modificados.