Name: Isolamento e Estudo de Biofísica de Cutículas Frutas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: Aprenda a isolar cutículas de frutos de tomate e analisar a remoção seletiva de ceras usando RMN de estado sólido e microscopia de força atômica. Este método permite avaliar a capacidade de reticulação de biopolímeros cuticulares.

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Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation EUA concede # MCB-0741914 e 0843627-MCB; apoio de infra-estrutura adicional foi fornecida no City College de Nova York pelo National Institutes of Health 2 G12 RR03060-26 do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos. Agradecemos o JKC Rose grupo no Departamento de Biologia Vegetal da Universidade de Cornell para a prestação de M82 (tipo selvagem) e CM15 (mutante) cutículas de tomate. Agradecemos ao Dr. Spyros Monastiriotis do grupo CCNY Engenharia Química do Prof Alexander Couzis por sua generosa ajuda com os experimentos de AFM. Agradecemos a Sra. Lauren Gohara de apoio design gráfico.

1. Isolamento enzimática de Tomate cutículas 5 <ol><li> Coloque os tomates vários comerciais ou cultivadas em uma tigela. Descasque a pele dos frutos em grandes seções; descartar o pericarpo interior. Lave as peles de tomate com água desionizada e conservá-los sob água numa proveta. </li><li> Prepara-se uma 50 mM, pH 4,0 tampão de acetato de sódio (a 31 ° C), colocando 1,22 g de trihidrato de acetato de sódio (M r. 136,08 g / mol) e 2,34 ml de ácido glacial acético (17,485 M) num copo, adicionando 200 ml de água desionizada, e, em seguida, ajustando o pH para 4,0 a 31 ° C. Prepara-se uma mistura contendo 4 ml de pectinase (EC 3.2.1.15; 10 U ml -1, TCI America), 0,2 g de celulase (CE 232.734.4; 1,3 unidades / mg de sólido, Sigma Aldrich), e 13 mg de NaN3, e, em seguida adicionar 196 ml de tampão acetato de sódio à mistura de enzima para obter 200 ml da enzima cocktail final. 5 mergulhar completamente a pele de tomate desenrolada do coquetel enzima e incubara 31 ° C durante 24 horas com agitação constante (G24 Ambiental Shaker; New Brunswick Scientific Co.). </li><li> Colete as peles de tomate usando um coador de cozinha ou funil Büchner e lavá-los com água deionizada. Depois disso, colocá-los numa estufa de vácuo à temperatura ambiente durante uma hora. Preservar as peles de tomate seco em uma garrafa rotulada e tampado para procedimentos desparafinagem subseqüentes. </li></ol> 2. Desparafinação exaustiva por Soxhlet de extração 6 <ol><li> O equipamento utilizado para desparafinação exaustiva consiste de uma fonte de calor (aquecimento manto e Variac controlador), balão de fundo redondo para um reservatório de solvente, extractor de Soxhlet, de vidro sinterizado dedal ou cartucho de extracção descartável, anti-ebulição fichas e um condensador (ver fig. 1). Note-se que o braço de sifão estreito (partes 6 e 7 na fig. 1) é muito delicado e propensos à ruptura, requerendo tratamento cuidadoso. </li><li> Coloque 0,5-1 g de pele de tomate (obtido nopasso 1.) em um almofariz, e moer a amostra para um pó grosso com um pilão, a menos que as amostras são para ser usado para medições de AFM (Secção 5). Encher um dedal de vidro sinterizado ou descartáveis ​​aproximadamente a meio caminho com a amostra e usar uma pinça para colocá-lo cuidadosamente na base da coluna de extracção. </li><li> Fixe o condensador e envolvê-la com papel alumínio. Aquecer o solvente metanol (ACS grau), na presença de alguns anti-ebulição fichas até ferver suavemente e refluxos nas paredes do balão. Cobrir o reservatório de solvente com ambos lã de vidro e uma folha de alumínio. Verificar o processo durante uma hora, ajustando a tensão Variac de modo que o reservatório se acumula sobre uma gota por segundo e sifonagem ocorre dentro do aparelho de Soxhlet, quando o dedal está cheio. </li><li> Continuar o processo de extracção durante 12 h, em seguida, baixar a manta de aquecimento e permitir que o aparelho para arrefecer. Remover o extractor e reservatório como uma única unidade de dispor de um solvente. Use tweezers para elevar o dedal para um pouco abaixo do gargalo da coluna de extracção, escorrer o excesso de solvente a partir dele, e colocar o dedal sobre uma superfície limpa. Inclinar a coluna de extracção para permitir sifão para o balão abaixo. Desconecte o frasco e despeje os resíduos em um recipiente de resíduos rotulados solvente. </li><li> Repetir os passos 2.3 e 2.4 para os solventes sucessivas de polaridade progressivamente decrescente, por exemplo, clorofórmio e hexano durante 12 h em cada caso. </li><li> Deixar a amostra cutina tomate para secar no interior do dedal, quer por sopro uma corrente de azoto gasoso sobre ele ou colocando-o num forno de vácuo à temperatura ambiente. Finalmente, a medição da massa da amostra seca e armazená-la à temperatura ambiente em um frasco com tampa selada com parafilme. </li></ol> 3. Isolamento seletivo de ceras epicuticulares e Intracuticular 3,4 <ol><li> Em primeiro lugar, lavar tomates inteiros (um lote separado de tomate daqueles descritos na 1.) Com água destilada. Seque-os com paptoalhas er e Kimwipes, e coloque-tronco para baixo sobre um pedaço de papel alumínio. </li><li> Pintar os tomates inteiros com 120% (w / w, a razão de massa) de solução aquosa de goma arábica em uma forma de cima para baixo e permitir que cerca de uma hora para a goma arábica para secar sobre a pele do fruto, deixando uma película fina. Retire-a usando uma pinça, tomando cuidado para não perfurar a pele do tomate. Repita o procedimento mais uma vez. </li><li> Adicionar os filmes para frascos contendo 1:1 (v / v) de clorofórmio-água e misturar durante três minutos. Após agitação vigorosa e separação de fases, pipetar as frações clorofórmio e evaporar-los em frascos separados descobertos, deixando de cera epicuticular. Os tomates permanecerá fisicamente intacto. Mergulhar-los em clorofórmio, durante dois minutos à temperatura ambiente e recolher a cera intracuticular após evaporação do solvente. Agora, descascar os tomates e tratá-los enzimaticamente (com celulase e pectinase em tampão acetato de sódio) para remover celulose e pectina, respectivamente (tal como descrito no <li> Se desejado, realizar desparafinação exaustiva sobre estas cutículas enzimaticamente isolado por extracção de Soxhlet (ver passo 2), utilizando três solventes de polaridade variável (metanol, clorofórmio e hexano, respectivamente). </li></li></ol> 4. Caracterização Molecular da cutina frutos de tomate por polarização cruzada Magia ângulo de giro de estado sólido de Ressonância Magnética Nuclear (CPMAS SSNMR) 6 <ol><li> Coloque 4-6 mg de cutículas de tomate totalmente desparafinados (cutins) em 1,6 milímetros fastMAS zirconia rotor usando o fornecido pelo fornecedor de ferramentas de embalagem. (Ou terra cutículas tomate desparafinados ou peças muito pequenas de cutículas parcialmente desparafinados são adequados.) Certifique-se que a amostra é embalado de forma uniforme, mas não com muita força, no rotor. Depois de colocar a tampa de topo, pintar metade da tampa com uma caneta marcadora negro-de tinta para facilitar medições da velocidade de rotação. </li><li> Ajustar o calços do espectrómetro de RMN para a largura de linha espectral mínimo a meia-altura-umnd calibrar o protão (1 H) e de carbono (13 C) 90 ° larguras de pulso utilizando um composto padrão, tais como adamantano. </li><li> Usando glicina ou glutamina como compostos modelo, obter intensidade máxima do sinal através da otimização de todos os parâmetros (Hartmann-Hahn níveis de energia correspondentes, 1 H-13 C tempo de contato, heteronuclear 1 H força dissociação) dos polarização cruzada magia do ângulo de rotação (CPMAS) experimento. Para os espectros adquirido com uma frequência de 1 H 600 MHz, as condições recomendadas incluem 10 kHz ou 15 kHz frequência fiação, um atraso de 3-sec entre as aquisições, e protão heteronuclear SPINAL dissociação 7 a uma intensidade de campo magnético equivalente a uma frequência de 185 kHz. </li><li> Insira o rotor cutina-embalados na sonda. Em seguida, coloque a sonda no ímã. Aumente a velocidade de centrifugação até 10 kHz gradualmente para verificar se a embalagem da amostra e estabilidade do rotor. Verificar a estabilidade final de fiação do rotor para dentro± 20 Hz. </li><li> Ajuste a sintonia e harmonização capacitores da sonda iterativamente para atingir reflexão mínimo de energia, tanto de 1 H e 13 C RMN freqüências. Regule a temperatura experimental para 25 ° C (ou temperatura ambiente). </li><li> Iniciar o pré-optimizado experimento CPMAS correspondente à condição de Hartmann-Hahn correspondente determinado na frequência de 10 kHz a fiação. </li><li> Adquirir 4096 transientes, a condição do espectro com a linha (Lorentziana) exponencial ampliação de 50-100 Hz, e fazer uma transformada de Fourier para gerar um espectro de RMN de intensidade de sinal versus blindagem química (ppm). </li><li> Referência a 13 química C turnos externamente usando o conjunto de adamantano em 38,4 ppm (-CH 2 - grupo) 8 como padrão. </li><li> Aumentar a frequência do rotor de fiação a 15 kHz e repetir a medição CPMAS (passos 4.6-4.8) correspondente à condição de Hartmann-Hahn correspondente determinada nesta última frequência de girar. </li><li> Repenas experiências CPMAS (passos 4.1-4.9) com amostras de cutícula naturais (ceroso) e parcialmente desparafinados de fruta. </li></ol> 5. Sondagem da superfície da cutícula de Tomate com Microscopia de Força Atômica (Digital Instruments Nanoscope IIIa; procedimentos irão variar entre os microscópios) 6 <ol><li> Ligue o microscópio de varredura por sonda (SPM) (Fig. 2) e certifique-se que o interruptor de modo microscópio alternância é definida como a microscopia de força de contato Atômica (AFM) de modo. </li><li> Manualmente levantar a cabeça SPM girando seus dois botões ajustáveis ​​pelo usuário da frente. Separe o tipholder AFM a partir da cabeça SPM rodando o parafuso de aperto na parte de trás da cabeça. </li><li> Use uma pinça para remover o cantilever AFM existente na tipholder, então, cuidadosamente, pegue um cantilever de nitreto de silício novo (AFM sonda) de seu pacote e instalá-lo no lugar do cantilever de idade. Utilizar um microscópio de luz para verificar que o recém-instalado cantilever AFM não é quebrada. </li><li> Anexar ªe cutícula amostra de tomate (uma seção de cutícula tomate parcialmente desparafinados ~ 10 mm x 10 mm) para um disco de aço inoxidável (amostra puck) com fita dupla face. Utilizar um microscópio de luz para verificar que a superfície cutículas permanece plana e lisa após a colocação da amostra sobre a puck. </li><li> Coloque o puck com a amostra de cutícula de tomate para a região magnética na parte superior do scanner SPM. </li><li> Definir as dianteiras dois parafusos de ajuste manuais do scanner de alta rodando os botões; definir o parafuso de ajustamento motorizado de volta para aproximadamente o mesmo nível como os outros dois parafusos frontais. Certifique-se que todos os três parafusos são suficientemente elevadas para evitar a quebra da ponta do AFM quando colocar a tipholder na cabeça SPM. </li><li> Reinserir o tipholder dentro da cabeça de SPM e fixá-lo apertando o parafuso de aperto na parte de trás da cabeça. </li><li> Depois de ligar o laser, alinhar o ponto de laser sobre o cantilever AFM usando o central (y) e direita (x) botões de ajuste do laser sobre o topo da cabeça.Monitorar o feixe de laser reflectido sobre um pedaço de papel para posicionar o ponto de laser exactamente no final do cantilever de AFM. </li><li> Ajustar a posição do espelho móvel iterativamente usando os botões de ajuste fotodetector para alcançar máxima do sinal (sinal SUM), garantindo assim que o feixe de laser reflectido está a ser recebido uniformemente pelos quatro quadrantes do fotodetector. </li><li> Abaixar a ponta do AFM retraindo os parafusos de ajustamento manual frontal eo parafuso de ajustamento motorizado de trás do scanner SPM, visualmente o controlo da abordagem da ponta AFM em direcção à superfície da amostra com um microscópio invertido. Assegure-se que todos os três parafusos são ao mesmo nível, para evitar artefactos de imagem de uma amostra inclinada. Traga a ponta em direção à amostra, mas não tão perto que os toques de ponta ou rompe a superfície da amostra. </li><li> Neste ponto, a luz laser refletida do cantilever AFM vai saltar fora do espelho móvel para o fotodetector. Para o modo de AFM contacto com um silinitreto de con AFM ponta, definir o sinal de saída (deflexão vertical) de voltagem para -2 V para um valor nominal V 0 eo sinal de DIFF (vertical / horizontal diferença) para 0 V, ajustando a posição do espelho. </li><li> Usando o software Nanoscope, clique no ícone do microscópio e selecionar o perfil adequado (Contato modo AFM). </li><li> Usando o "Controle de Configurações de digitalização de" painel, defina a taxa de varredura e por exemplo, tamanho da digitalização, 10 microns tamanho de digitalização e 2 Hz taxa de varredura. </li><li> Permitir a ponta do AFM para envolver a superfície da amostra, clicando no ícone de envolver-dica. Ao controlar o parafuso de volta motorizada da base SPM, o programa irá agora baixar a ponta até que engata a superfície da amostra. O processo de digitalização será iniciado automaticamente uma vez que a ponta se envolveu com sucesso. </li><li> Monitorar o processo de digitalização usando ambos os modos de imagem e alcance do software, ajustando parâmetros como referência, o ganho integral, ganho proporcional, tamanho da digitalização, velocidade de varredura, as linhas e as amostras por linha iterativamente para atingir o mais altoimagens de alta resolução. Inicie a digitalização com uma gama eixo z grande (escala de dados); então cuidadosamente reduzir o valor da escala de dados para observar o melhor contraste de características de superfície sobre a imagem. Minimizar a ocorrência de áreas brancas da imagem digitalizada, que indicam que a altura das características da superfície superior do intervalo eixo z disponível. </li><li> Capturar a imagem para salvar o arquivo de dados, em seguida, processar os dados usando funções de nivelamento para remover artefatos na imagem devido à deriva do scanner vertical (Z), arcos de imagem, e deslocamento vertical entre linhas de varredura, 9, finalmente, calcular a rugosidade média. Depois de guardar os dados, retrair a ponta do AFM, invertendo a acção do motor de parafuso, controlado por computador que foi usado para acoplar-lo. O processamento de imagem pode ser realizada em modo off-line de análise de imagem e / ou utilizando um computador diferente. </li><li> Use os botões da frente de fundo de metal cinza do titular dica para mudar as posições x e y da área de digitalização, em seguida, repita a medição em cinco loca amostrações para verificar a reprodutibilidade, substituindo o cantilever de AFM se a qualidade da imagem deteriora-se. </li></ol> 6. Os resultados representativos A análise química do deslocamento 13 CPMAS C espectros de RMN (Fig. 3) identificou os grupos funcionais mais importantes presentes no cutícula de tomate exaustivamente desparafinados (cutina). As porções de carbono chave na biopoliéster cutina foram encontrados para ser alifáticos de cadeia longa (0-45 ppm), compostos alifáticos oxigenados (45-110 ppm), multiplicar-colados e aromáticos (110-160 ppm), e carbonilos (160-220 ppm). As porções oxigenados de alquilo (CHO + CH2O) desempenham um papel crucial no estabelecimento de ligações covalentes entre as unidades monoméricas do biopolímero cutina, formando assim a arquitectura molecular da matriz cutina. As diferenças na áreas dos picos relativos observados na região espectral entre 45 e 100 ppm sugerem que a cutina mutante tem uma proporção relativamente elevada de ligações cruzadas formando CHO Structura metades l em comparação com o tipo selvagem cutina; cuidadosas medições quantitativas utilizando polarização directa (DPMAS) RMN 5 métodos apoiar esta inferência (dados não mostrados). CPMAS 13 C espectros de RMN também mostrou um pico de cera progressivamente a decrescer a 31 ppm (Fig. 4), indicando a remoção sequencial de epi e ceras intracuticular a partir do composto cutina cera, mantendo a arquitectura química principal do biopolímero cutina. Análise de imagem paralelo AFM (Fig. 5) revelou irregularidades de superfície devido à extracção por passos de epi e ceras intracuticular da cutícula de fruta, significando alterações na organização do conjunto cuticular. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg"> . Figura 1 Soxhlet (fonte da imagem: Wikipedia). "/&gt; Figura 2. A) microscópio da sonda Scanning. B) cabeça SPM (adaptado do manual de treinamento fornecido pela AFM Instrumentos Digitais). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg"> Figura 3. 150 MHz CPMAS 13 C espectro de RMN de exaustivamente desparafinados vermelhas cutículas tomate maduro da fruta (cutins) de tipo selvagem (M82) e mutante (CM15) mostram ressonâncias com deslocamentos químicos correspondentes aos grupos funcionais de um ácido hydroxyfatty reticulada baseado no poliéster e também algumas porções multiplicam ligados. Todos os espectros foram adquiridos com uma frequência de 10 kHz a fiação. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg"> Figura 4. 150 MHz 13 CCPMAS espectros de RMN de comerciais vermelhas cutículas frutos maduros de tomate exibem alterações de composição após a remoção sequencial de ceras e intracuticular por extracção goma arábica mecânico e um two-dip minutos clorofórmio, respectivamente. Todos os espectros foram adquiridos com uma frequência de 15 kHz a fiação. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg"> Imagens Figura 5. AFM e estimativas de rugosidade para o tomate parcialmente desparafinados comercial cutículas descrito na Figura 4, após a remoção progressiva de epicuticulares (esquerda) e intracuticular (à direita) ceras.

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<li>Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os protocolos aqui descritos permitem a caracterização molecular e microescala detalhada de um material vegetal complexo insolúvel sem a necessidade de decomposição química destrutiva. Para investigar a mistura do biopoliéster cutina com diversos lípidos (ceras) que controlam a organização estrutural do conjunto cuticular, 10 realizamos e monitorados procedimentos para a remoção seletiva de ceras epicuticulares e intracuticular de uma mistura heterogênea cuticular. De estado sólido 13 C RMN foi utilizado para medir a extracção de componentes de cera moleculares, e microscopia de força atómica serviu para examinar as alterações concomitantes na rugosidade da superfície. 6,11 Para comparar as capacidades de ligação cruzada de cutins de cultivada de tipo selvagem e único gene frutos de tomate mutantes, de estado sólido 13 C RMN foi também utilizada para estimar os números relativos de CHO e 2 CH porções O químicos. Uma série de característica de projetos deste protocolo são notáveis. À medida que os materiais de cera englobar uma grande variedade de lipidos, tratando a cutícula de frutas com uma série de solventes com polaridades divergentes é essencial para alcançar desparafinação exaustiva. Além disso, o tempo de desparafinagem pode variar de 8 horas a 24 horas, dependendo da natureza das amostras cutícula. Para extrair ceras consistentemente a partir da cutícula fruto intacto, é imperativo para aplicar o revestimento adesivo uniforme para a superfície. De estado sólido CPMAS 13 C RMN 12 é um método rápido para a identificação de qualitativa vários componentes estruturais de biopolímeros vegetais altamente heterogéneos e insolúvel conservando as suas características físicas nativas; 13 RMN solução de estado-tradicional também pode ser usado para caracterizar as misturas de cera extraídos. Se a estimativa quantitativa de grupos funcionais é desejada para os polímeros de plantas intactas, 5 de alta fidelidade de polarização direta magia ângulo de giro (DAMPs) 13 C RMN 5,14 deve ser utilizado como um método complementar. Quantificação precisa dos grupos funcionais requer cuidadosa otimização dos tempos de reciclagem, comprimentos de pulso de excitação, e no poder de dissociação heteronuclear 15. Dissociação O heteronuclear pode ser ajustado para uma intensidade de campo 1 H variando de 50 kHz a 185 kHz usando o TPPM 16 ou COLUNA 7 metodologias. Em adição a estes parâmetros, a sensibilidade das medições CPMAS depende do tempo de spin-lock e Hartmann-Hahn condição de correspondência. 15 Em lugar de CPMAS tradicionais, uma rampa de amplitude CP técnica (RAMP-CP) pode ser implementado para maximizar a cruz -polarização eficiência através da variação da amplitude 1 H linearmente (~ 20-50%) ou tangencialmente ao mesmo tempo manter a amplitude da força do campo 13 C constante durante o período de rotação de bloqueio-(ou vice-versa). 17,18 execução das medições CPMAS em um mínimo de duas ro diferentetor-fiação freqüências é imperativo distinguir bandas laterais fiação dos principais picos espectrais. Medições simultâneas de AFM realizadas no modo de contato permitir imagens diretas do estado da superfície da cutícula com velocidades de digitalização de alta e alta resolução, 19, por exemplo durante a remoção sequencial de componentes cerosos. Operando AFM no aproveitamento (não-contacto) modo pode ser usado como uma alternativa para a caracterização da superfície de delicadas &quot;leves&quot; de materiais vegetais, evitando danos possível devido à laterais (cisalhamento) forças e raspagem da superfície da amostra. 5,20 Em ambos os casos , a aquisição seqüencial de várias imagens do mesmo ponto da superfície serve para identificar qualquer dano na superfície devido a &quot;sonda de superfície interações&quot; nas medidas de AFM. 6,21 Para reprodutibilidade ideal, sondas AFM com constantes de mola adequados para superfícies suaves cuticulares deve ser usado, constância e da temperatura e da umidade deve ser mantida. 6,15,20 </sup&gt; Considerando solid-state NMR oferece um perfil molecular de ensemble médio (a granel) em propriedades cutículas dos frutos do tomateiro, a imagem de força atômica fornece uma sonda complementar não invasivo 22,23 para acompanhar a topografia da superfície destes conjuntos macromoleculares requintadamente complexos 1,2.

<table><tbody><tr><td>Acetato de sódio tri-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pectinase</td><td>TCI America</td><td>P0026</td><td>EC 3.2.1.15; 10 U ml&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;, armazenar em geladeira</td></tr><tr><td>Cellulase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1184-100KU</td><td>EC232.734.4; 1,3 unidades/mg, armazenar em geladeira</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>Extremamente perigoso</td></tr><tr><td>Incubadora/agitador</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Nº do modelo G24</td><td>Nº de fabricação M1036-000G</td></tr><tr><td>Estufa a vácuo</td><td>Precision Scientific</td><td>31566</td><td></td></tr><tr><td>Controlador Variac</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cartucho de vidro sinterizado (85 mm/25 mm)</td><td>VWR international</td><td>89056</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho descartável de extração (80 mm/25 mm)</td><td>VWR international</td><td>28320</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR international</td><td>EMD-MX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>Lã de vidro</td><td>VWR international</td><td>RK20789</td><td></td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>VWR international</td><td>82027-452</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>VWR international</td><td>EM-CX1050-1</td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>Gás nitrogênio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR international</td><td>52858</td><td></td></tr><tr><td>Toalhas de papel</td><td>VWR international</td><td>89002-984</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Goma arábica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de zircônia 1,6 mm fastMAS</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de RMN</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>ímã de diâmetro padrão</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>Composto modelo para CPMAS</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49419</td><td>Composto modelo para CPMAS</td></tr><tr><td>Adamantano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100277</td><td>Para calibrar pulso de 90&amp;#x00B0; em RMN</td></tr><tr><td>Microscópio Multimodo de Sonda de Varredura (Nanoscope IIIA)</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Nanoscope</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td>Versão 5.30r3sr3 (2005)</td></tr><tr><td>Probeta de AFM (ponta de nitreto de silício não condutora)</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td>Modelo NP-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio óptico</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disco magnético</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fita dupla face</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Descascador de frutas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Funil de B&amp;#252;chner</td><td>VWR international</td><td>89038</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e estudo de biofísica de cutículas frutas

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

A cutícula, uma camada hidrofóbica protecção sobre as partes aéreas das plantas terrestres, funciona como uma barreira versátil defensiva para vários estresses e também regula o fluxo de água a partir do ambiente externo. 1 Um biopoliéster (cutina) e de cadeia longa de ácidos gordos ( ceras) formam o quadro estrutural principal da cutícula; a integridade funcional da camada cuticular depende da camada exterior &#39;epicuticular&#39;, bem como a mistura consistindo do biopolímero cutina e &#39;intracuticular dos ceras Nisto 2, nós descrevemos um protocolo global. para extrair ceras exaustivamente de tomate comercial (Solanum lycopersicum) cutículas de frutas ou para remover ceras e intracuticular seqüencialmente e, seletivamente, a partir do composto cutícula. O método de Jetter e Schaffer (2001) foi adaptado para a extracção por passos de ceras e intracuticular da cutícula fruta. 3,4 Para monitorizar oprocesso de remoção de cera seqüencial, de estado sólido polarização cruzada no ângulo mágico de fiação (CPMAS) 13 C espectroscopia de RMN foi utilizado em paralelo com microscopia de força atômica (AFM), oferecendo em nível molecular perfis estruturais dos materiais a granel, complementados por informações sobre a topografia microescala e rugosidade das superfícies cuticulares. Para avaliar as capacidades de ligação cruzada de cutículas desparafinados de cultivadas do tipo selvagem e de um único gene frutos de tomate mutantes, 13 MAS C RMN foi utilizado para comparar as proporções relativas dos alifático oxigenada (CHO e CH2O) porções químicas. Desparafinação exaustiva por extracção de Soxhlet stepwise com um painel de solventes de diferentes polaridades proporciona um meio eficaz para isolar porções de cera com base nas características hidrofóbicas da sua alifáticos e constituintes aromáticos, preservando a estrutura química do biopoliéster cutina. A extração mecânica de ceras epicuticulares e Seleremoção de ceras ctive intracuticular, quando monitorizado por metodologias complementares físicas, proporciona um meio sem precedentes para investigar a montagem cutícula: esta abordagem revela que a organização supramolecular e integração estrutural de vários tipos de ceras, a arquitectura da matriz cutina cera, e do produto químico composição de cada constituinte. Além disso, de estado sólido 13 C RMN revela diferenças nos números relativos de CHO e 2 CH porções químicas O para tipo selvagem e mutante vermelhos maduros frutos de tomate. As técnicas de RMN oferecem ferramentas excepcionais para a impressão digital do estrutura molecular dos materiais cuticulares que são insolúveis, amorfo, e quimicamente heterogénea. Como técnica de imagem não invasivo superfície seletiva, AFM fornece um meio eficaz e direta para investigar a organização estrutural do conjunto cuticular na escala de comprimento nm m de.

Órgãos das plantas aéreas são protegidos pela cutícula, uma assembléia biopoliéster cera supramolecular. Apresentamos protocolos para monitorar a remoção seletiva de epi-e ceras intracuticular de cutículas dos frutos do tomateiro em escalas moleculares e micro por RMN de estado sólido e microscopia de força atômica, respectivamente, e para avaliar a capacidade de ligação cruzada de engenharia biopolyesters cuticulares.

Isolamento e Estudo de Biofísica de Cutículas Frutas

A cutícula, uma camada protetora hidrofóbica nas partes aéreas de plantas terrestres, funciona como uma barreira defensiva versátil contra vários agentes bióticos e ...

Este experimento utiliza técnicas biofísicas para avaliar a capacidade de reticulação do polímero cuticular protetor do tomate e para monitorar a remoção seletiva de ceras epicuticulares e intracuticulares das cutículas dos frutos. O isolamento da cutícula a partir do fruto inteiro é realizado por meio de tratamento enzimático das cascas de tomate e das paredes celulares aderentes. Em um segundo passo, utiliza-se extração com ATE para descerar completamente a cutícula do fruto, a fim de obter a caracterização molecular da cutina isolada.O poliéster biológico é analisado por ressonância magnética nuclear no estado sólido. A análise espectral de RMN no estado sólido revela que, na cutina de frutos de tomate com casca selvagem e modificada, existem diferenças nas proporções relativas de grupos alifáticos oxigenados capazes de formar ligações cruzadas. Alternativamente, o fruto inteiro é pintado e descascado com goma arábica para remover as ceras epicuticulares e, em seguida, mergulhado em clorofórmio para remover as ceras intracuticulares da cutícula do fruto.Em seguida, as cutículas parcialmente despolidas de cera, isoladas pelo mesmo tratamento enzimático utilizado nas cascas de tomate, são examinadas por meio de ressonância magnética nuclear no estado sólido e microscopia de força atômica. Em última análise, a remoção sequencial das ceras epicuticulares e intracuticulares torna-se evidente pela observação de um pico de cera progressivamente decrescente nos espectros de RMN e por alterações no perfil da superfície da cutícula do fruto, observadas mediante imagens simultâneas de microscopia de força atômica. Órgãos aéreos de plantas são protegidos por uma estrutura poliéster-cerácea bioquímica chamada cutícula. Apresentaremos protocolos para avaliar a remoção seletiva de ceras internas e externas das cutículas de frutos de tomate utilizando ressonância magnética nuclear no estado sólido e microscopia de força atômica.Esses métodos também podem ser utilizados para avaliar a capacidade de reticulação de materiais cuticulares projetados. Realizando os procedimentos estarão três membros do grupo Stark: Dr. Ishish Chatterjee, a candidata ao doutorado Shantani Sarkar e a ex-aluna do ensino médio Julia Tik. Um demonstrador adicional é a Dra. Olivia Nisau, pesquisadora pós-doutoranda no laboratório do nosso colega de engenharia química, Dr. Alexander S. Para iniciar o isolamento enzimático da pele do tomate, coloque três frutos comerciais ou cultivados em uma tigela, retire a pele em grandes seções e descarte o tecido interno do pericarpo.Em seguida, lave as cascas de tomate com água desionizada e preserve-as submersas em um béquer, imergindo completamente a casca de tomate descascada em um coquetel enzimático preparado conforme descrito no protocolo escrito. Incube a 31 graus Celsius por 24 horas com agitação contínua. Colete as cascas de tomate utilizando um funil de Büchner ou peneira de cozinha e lave-as com água desionizada.Após colocar as cascas em uma estufa a vácuo à temperatura ambiente por uma hora, as cascas secas podem ser armazenadas em um frasco rotulado e tampado. Para procedimentos subsequentes de desparafinação, encha um tímpano de vidro centralizado ou descartável até aproximadamente metade com a amostra de cutícula de tomate, utilizando pinças para colocá-la cuidadosamente na base da coluna de extração a ser usada na extração sólida. Continue a montar o aparelho de soxhlet utilizando metanol como solvente, conforme descrito no protocolo escrito.Monitore o processo durante uma hora, ajustando a voltagem do variac para que o reservatório acumule cerca de uma gota por segundo e o sifonamento ocorra dentro das meias do aparelho. Quando o bulbo de extração estiver cheio, após uma extração de 12 horas, deixe o aparelho esfriar, abaixe o manto de aquecimento e remova o extrator e o reservatório como uma única unidade para descartar o solvente após a extração. Incline a coluna para permitir o sifonamento para o frasco abaixo.Use pin&ccedil;as para elevar o cartucho at&eacute; logo abaixo do pesco&ccedil;o da coluna de extra&ccedil;&atilde;o. Drene o solvente em excesso e coloque o cartucho sobre uma superf&iacute;cie limpa. Desconecte o frasco e despeje o res&iacute;duo em um recipiente para solvente devidamente rotulado.Repita o procedimento de extração para solventes sucessivos de polaridade progressivamente decrescente, como clorofórmio e taxano, durante 12 horas cada. Uma vez que a amostra de cutícula de tomate esteja seca, meça a massa e armazene-a em temperatura ambiente em um frasco com tampa de rosca selada com parafina. Para preparar a amostra para RMN, coloque de quatro a seis miligramas de cutículas de tomate completamente livres de cera, denominadas cutina, em um rotor de zircônia de 1,6 milímetro para MAS rápido, utilizando a ferramenta de acondicionamento fornecida pelo fabricante.Após instalar a tampa superior, pinte metade da tampa com uma caneta marcadora de tinta preta para permitir a medição da taxa de rotação. A configuração inicial do experimento de RMN no estado sólido é um processo tecnicamente exigente e deve ser realizada sob a supervisão de pessoal experiente. Comece ajustando a homogeneidade do campo magnético e otimizando os parâmetros experimentais utilizando um composto modelo, conforme descrito no protocolo escrito. Insira o rotor contendo a amostra e devidamente acondicionado na sonda e, em seguida, coloque a sonda no ímã.Aumente gradualmente a velocidade de rotação até 10 quilohertz para verificar a boa compactação da amostra e a capacidade do rotor de girar de forma estável com variação inferior a 20 hertz. Ajuste iterativamente os capacitores de sintonia e casamento da sonda para obter a mínima reflexão de potência nas frequências de ressonância magnética nuclear do próton e do carbono 13. Estabeleça a temperatura experimental em 25 graus Celsius.Inicie o experimento de CPMA pré-otimizado correspondente à condição de casamento de próton-carbono de Hartman-Hahn determinada na frequência de rotação de 10 quilohertz. Após adquirir 4.096 transientes, condicione o espectro com alargamento de linha exponencial de 50 a 100 hertz e realize uma transformada de Fourier para gerar um espectro de RMN de intensidade do sinal versus deslocamento químico em partes por milhão. Referencie os deslocamentos químicos de carbono-13 conforme descrito no texto.Aumente a frequência de rotação do rotor para 15 quilohertz e repita a medição C-P-M-A-S correspondente à condição de Hartman Han Matching determinada na análise da frequência de rotação em escada do deslocamento químico do carbono C-P-M-A-S. Os espectros de RMN de 13 C identificaram os principais grupos funcionais presentes na cutícula de tomate cera DW exaustivamente, PHAs de cadeia longa, PHAs oxigenados, múltiplas ligações e aromáticos e rendimentos de carbono. Os almo oxigenados desempenham um papel crucial no estabelecimento de ligações covalentes entre as unidades monoméricas do biopolímero cutina, formando assim a arquitetura molecular da matriz de cutina.Diferenças nas áreas relativas dos picos observadas na região espectral entre 45 e 100 partes por milhão sugerem que a cutina mutante possui uma proporção relativamente maior de agrupamentos estruturais CHO formadores de ligações cruzadas em comparação com a cutina do tipo selvagem. Para iniciar o isolamento seletivo das ceras epicuticulares e intracuticulares.Lave um segundo lote de tomates inteiros com água destilada. Seque-os com toalhas de papel e lenços Kim e coloque-os com o cabinho voltado para baixo sobre uma folha de papel alumínio. Pinte os tomates inteiros de cima a baixo com uma solução aquosa de goma arábica a 120%.Deixe a goma arábica secar na casca do fruto por uma hora, formando uma película fina. Remova esta película com pinça, mas evite perfurar a pele do tomate. O tratamento adicional da película conforme descrito no texto resulta na cera epicuticular.Os tomates permanecerão fisicamente intactos. Mergulhe-os em clorofórmio por dois minutos. À temperatura ambiente, a cera intra-cuticular pode ser coletada após a evaporação do solvente; descasque os tomates e trate-os enzimaticamente com celulase e pectinase em tampão de acetato de sódio para remover celulose e pectina, respectivamente.Uma extração com sali pode então ser realizada conforme descrito anteriormente para descerificar exaustivamente os tomates. Os experimentos C-P-M-A-S podem ser repetidos com amostras de cutícula de frutos naturais e parcialmente descerrificadas conforme descrito no texto. A configuração do microscópio de força atômica é um processo complicado e é melhor realizada inicialmente sob supervisão de técnicos experientes. Um FM começa ligando o microscópio de sonda de varredura, abreviado como SPM, e garantindo que o interruptor de seleção do modo do microscópio esteja definido para o modo de microscopia de força atômica de contato.Em seguida, eleve manualmente a cabeça do MFP girando seus dois botões dianteiros ajustáveis pelo usuário. Desprenda o suporte da ponta FM da cabeça do MFP girando o parafuso de fixação na parte traseira da cabeça. Use pinças para remover a alavanca FM existente do seu suporte.Em seguida, pegue cuidadosamente um novo cantiléver com ponta de nitreto de silício embalado e instale-o no lugar do cantiléver antigo. Utilize um microscópio óptico para verificar se o cantiléver FM recém-instalado não está quebrado. Fixe a amostra de cutícula de tomate em um puck de amostra com fita dupla face.Utilize um microscópio óptico para verificar se a amostra de cutícula permanece plana e lisa. Após posicionar a amostra no puck, coloque a amostra de cutícula de tomate fixada ao puck na região magnética localizada no topo do scanner de SPM. Ajuste os dois parafusos manuais frontais do scanner, girando os botões, elevando-os o suficiente para evitar a quebra da ponta de FM.Quando o suporte da ponta for colocado na cabeça do MFP, ajuste o parafuso traseiro motorizado a aproximadamente o mesmo nível dos outros dois parafusos dianteiros. Recoloque o suporte da ponta na cabeça do MFP e fixe-o apertando o parafuso de fixação traseiro da cabeça. Após ligar o laser, alinhe o ponto do laser sobre a alavanca de ressonância FM utilizando os botões centrais e direito de ajuste do laser na parte superior da cabeça.Monitore o feixe de laser refletido em um pedaço de papel para posicionar o ponto do laser exatamente na extremidade de um cantiléver FM. Ajuste a posição do ponto do laser para obter o sinal soma máximo. Regule a posição do ponto de laser refletido no detector fotônico ajustando a posição do espelho móvel horizontal e verticalmente, garantindo que a luz incidente seja recebida de forma uniforme pelos quatro quadrantes.O detector abaixa a ponta FM recuando os parafusos frontais controlados pelo usuário e o parafuso traseiro motorizado do scanner SPM. Monitore visualmente a aproximação da ponta FM em direção à superfície da amostra com um microscópio invertido. Certifique-se de que os três parafusos estejam no mesmo nível.Para evitar artefatos provenientes da imagem de uma amostra inclinada, aproxime a ponta da amostra, mas não tanto a ponto de tocá-la ou romper sua superfície. A luz laser refletida no cantiléver de FM será refletida por um espelho móvel até um detector foto-sensível, no modo de contato de FM com uma ponteira de nitreto de silício. Ajuste a tensão do sinal de saída para menos dois volts no ponto de ajuste de zero volts e o sinal diferencial para zero volts, ajustando a posição do espelho.Usando o software nano scope, clique no ícone do microscópio e selecione o perfil apropriado. No painel de configurações de controle de varredura, defina a taxa de varredura e o tamanho da varredura.Permita que a ponta de FM-A entre em contato com a superfície da amostra clicando no ícone de engajamento da ponta. Ao controlar o parafuso traseiro motorizado da base do MSP, o programa agora irá abaixar a ponta até que ela entre em contato com a superfície da amostra. O processo de varredura iniciará automaticamente assim que a ponta for engajada com sucesso.Monitore o processo de varredura utilizando os modos de imagem e de escopo do software, ajustando iterativamente os parâmetros para obter imagens com a mais alta resolução, conforme descrito no protocolo escrito. Por exemplo, inicie a varredura com um valor alto na escala de dados do eixo Z. Em seguida, reduza cuidadosamente o valor da escala de dados do eixo Z para obter o melhor contraste das características superficiais na imagem.Capture a imagem para salvar o arquivo de dados. Processe os dados utilizando funções de nivelamento para remover artefatos de imagem decorrentes de deriva vertical do scanner, curvaturas da imagem e deslocamento vertical entre linhas de varredura. Por fim, calcule a rugosidade média do carbono.Os espectros de RMN 13 C-P-M-A-S-N-M-R mostraram uma diminuição progressiva do pico de cera em 31 partes por milhão, indicando a remoção sequencial das ceras epicuticulares e intracuticulares do compósito de cutícula e cera, mantendo paralelamente a arquitetura química principal do biopolímero cutina. Uma análise de imagem de FM revelou irregularidades superficiais devido à extração progressiva da cera epicuticular e da cera intracuticular da cutícula do fruto, indicando alterações na organização do conjunto cuticular. Após dominar esta técnica, a remoção sequencial das ceras epicuticulares e intracuticulares das cutículas de frutos de tomate pode ser realizada em duas horas.Ao realizar a extração em fase sólida para a remoção exaustiva das cutículas dos frutos, é importante usar um painel de solventes com polaridades variadas após utilizar o nó de contato. Um protocolo FM é ilustrado aqui. Experimentos adicionais de FM podem ser usados para medir a elasticidade da superfície da cutícula.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar sistematicamente os componentes do compósito cera-cutina e realizar a caracterização molecular e exame rápido da superfície dos materiais da cutícula utilizando RM em estado sólido e FM, respectivamente. As técnicas ilustradas neste vídeo tornam possível para pesquisadores em biologia vegetal determinar a composição molecular e a arquitetura supramolecular de tecidos vegetais naturais e modificados.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Um modelo ideal para estudar a biologia de células-tronco adultas é o folículo piloso de camundongo. Aqui apresentamos um protocolo para isolar diferentes populações de folículos pilosos, células-tronco e queratinócitos epidérmicos, empregando digestão enzimática da pele dorsal de camundongos seguida de análise FACS.

Isolando células-tronco do folículo piloso e epidérmico queratinócitos da Dorsal rato Pele

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Isolamento, cultura e caracterização de células primárias de schwann, queratinócitos e fibroblastos de Foreskin Humano

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Isolamento de gotículas lipídicas de platoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias

Um protocolo é apresentado para o isolamento e enriquecimento conveniente e de alto rendimento de tricomas glandulares e sésseis de Cannabis sativa. O protocolo é baseado em uma extração seca e não tampão de tricomas usando apenas nitrogênio líquido, gelo seco e peneiras de nylon e é adequado para extração de RNA e análise transcriptômica.

Isolamento Não Aquoso e Enriquecimento de Tricomas Glandulares e Tricomas Sésseis de Cannabis sativa

O presente artigo tem como objetivo fornecer protocolos detalhados e adequados para o isolamento de fungos endofíticos associados a plantas, preservação a longo prazo de isolados, caracterização morfológica e extração de DNA total para posterior identificação molecular e análises metagenômicas.

Isolamento, caracterização e extração de DNA total para identificação de fungos endofíticos em plantas micoheterotróficas

Aprenda a isolar cutículas de frutos de tomate e analisar a remoção seletiva de ceras usando RMN de estado sólido e microscopia de força atômica. Este método permite avaliar a capacidade de reticulação de biopolímeros cuticulares.

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