Modificado Sistema Yeast-Two-Hybrid para identificar proteínas Interagindo com o Fator de Crescimento progranulina
17 de janeiro de 2012
Nós modificamos o fermento convencional de dois híbridos de rastreamento, uma ferramenta eficaz na identificação genética de interação de proteínas. Esta modificação marcadamente encurta o processo, reduz a carga de trabalho, eo mais importante, reduz o número de falsos positivos. Além disso, esta abordagem é reproduzível e confiável.
Este sistema MY dois H aprimora o protocolo convencional de duplo híbrido em levedura, reduzindo acentuadamente o número de falsos positivos. Primeiro, prepare uma transformação em pequena escala do plasmídeo isca em levedura. Após validar a construção da isca, utilize uma tela com inibidor competitivo para triar a biblioteca de cDNA em placas menos quatro.
Prossiga para verificar os clones positivos com ensaios de XGL e reação. Em seguida, identifique as proteínas interagentes potenciais por meio de sequenciamento de DNA e análise de bioinformática. Em última instância, este sistema modificado de duplo híbrido em levedura aumenta significativamente a eficácia e o sucesso do processo de triagem.
O sistema convencional de duplo-híbrido em levedura é notório por gerar falsos positivos. Esta mensagem apresenta o procedimento modificado de triagem, que foi significativamente aprimorado em favor das caudas de dois pontos. Então, vamos começar.
Inocule 50 mililitros de YPD com um cultivo de 5 mililitros de crescimento noturno de MAV 2 0 3. Incube por duas a quatro horas a 30 °C. Em seguida, recolha o fermento por centrifugação, após uma lavagem, reconstitua os pellets em 2 mililitros da solução um e incube à temperatura ambiente por 10 minutos.
Prepare a mistura de DNA para transformação. Adicione 100 microlitros de células de levedura e misture bem. Em seguida, adicione 700 microlitros da solução dois e misture bem.
Primeiro, incubar a 30 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, aplicar choque térmico. Agora, colher as células por centrifugação e ressuspender o pellet em 200 microlitros de água destilada autoclavada, espalhar diluições seriadas da suspensão em placas SD LU e incubar a 30 graus Celsius por dois a três dias. Este passo confirma que o plasmídeo isca ativa a transcrição e que essa ativação autóloga pode ser neutralizada por inibidores como três, um inibidor competitivo do produto do gene hiss três.
Primeiro, transforme o plasmídeo isca em levedura MAV 2 0 3. Espalhe a reação em placas SD LU e incube a 30 graus Celsius. Para triar colônias quanto à autoativação induzida por três at, use palitos de dente autoclavados para transferir colônias de cada transformação para placas SD LU hiss contendo concentrações crescentes de três at; incube as placas a 30 graus Celsius.
Elimine cepas isca que crescem em placas contendo 100 milimolares de três em como não adequadas para uso no teste de duplo híbrido para re. Para as iscas restantes, selecione a menor concentração de três em que inibe o crescimento celular para uso na triagem de biblioteca de CD NA, suspenda várias colônias isoladas de levedura contendo o plasmídeo isca em 100 microlitros de água destilada autoclavada. Espalhe-as em duas placas SD LU de 10 centímetros.
Incube ambas as placas a 30 graus Celsius. Raspe e suspenda completamente as células em 10 mililitros. Autoclave água destilada e inocule 500 mililitros de meio YPD líquido.
Verifique a densidade celular por espectrofotometria e cultivo a 30 graus Celsius. Prossiga para a colheita das células por centrifugação. Lave uma vez com 100 mililitros de água destilada autoclavada e uma vez com 50 mililitros da solução um.
Em seguida, ressuspender o precipitado em 2,5 mililitros da solução um. Agora, adicionar o DNA de esperma de salmão desnaturado e fragmentado e também a biblioteca de DNA CD, misturando suavemente com pipeta. Em seguida, adicionar 15 mililitros da solução dois contendo 40% de polietilenoglicol.
Misture suavemente e distribua alíquotas de 700 microlitros em 25 tubos de microcentrífuga esterilizados em autoclave de 1,5 mililitro. Incube por 30 minutos em banho-maria a 30 graus Celsius, seguido por choque térmico de 15 minutos em banho-maria a 42 graus Celsius.
Recolha as células por centrifugação e ressuspenda suavemente cada pellet em 400 microlitros de água destilada autoclavada. Espalhe cada mistura de transformação em duas placas de seleção e incube por cinco a 10 dias a 30 graus Celsius como controle para estimar a eficiência de transformação da reação. Diluições seriadas de uma reação.
Após incubar por três dias a 30 graus Celsius, determine o número de colônias totais. Transfira as colônias para uma placa de YPD e incube a 30 graus Celsius durante a noite. Em seguida, coloque uma membrana de nitrocelulose arredondada diretamente sobre a placa de YPD, garantindo que não haja bolhas de ar.
Após um minuto, verifique se todas as colônias foram transferidas para as membranas. Posicione a membrana com o lado das colônias voltado para cima em um barquinho de folha de alumínio e coloque-o sobre a superfície do nitrogênio líquido por 20 segundos. Em seguida, imerja no nitrogênio líquido por alguns minutos.
Agora remova a membrana para descongelar. Enquanto isso, prepare uma placa de Petri com uma camada fresca de solução XCA em papel Aman. Em seguida, imerja cuidadosamente a membrana descongelada e incube a 37 graus Celsius.
Até que colônias azuis apareçam. A reação de presas, clones e construção isca em levedura pode eliminar ainda mais falsos positivos. Primeiro, isolue o DNA plasmidial das linhagens de levedura que potencialmente contenham proteínas interagentes.
Transforme o DNA em E. coli DH5α e selecione pelo crescimento em placas de LB com ampicilina. Analise os transformantes por meio de análise com enzimas de restrição. Agora, realize a cotransformação dos plasmídeos de presa e isca em levedura MAV203, plaque em placas SC-LU-trip e incube por dois a três dias a 30 graus Celsius.
Escolha três colônias diferentes para realizar a sequência do ensaio xal, o DNA plasmidial dos clones positivos e identifique os genes utilizando bioinformática. Neste experimento, o fator de crescimento Rine progranulina foi usado como isca para triar uma biblioteca de CD NA cerebral, obtendo 54 clones positivos.
Os candidatos foram isolados entre 2,5 milhões. Transformantes triados com a isca pró-granulina. Análises adicionais pelo ensaio ex cranio indicaram 23 candidatos positivos para a isca pró-granulina.
Curiosamente, análises bioinformáticas de dados de sequenciamento identificaram o receptor de TNF dois. De fato. Experimentos funcionais adicionais confirmaram a progranulina como um novo ligante dos receptores TT NF. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar esta tela híbrida modificada com sua base de interesse.
Não se esqueça de trabalhar com luvas, pois algumas regiões utilizadas são perigosas. Boa sorte em seus experimentos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um sistema de duplo-híbrido em levedura modificado que aprimora o protocolo convencional para identificar interações proteicas. A nova abordagem reduz significativamente os falsos positivos e melhora a confiabilidade dos resultados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Interações proteicas
- Triagem genética
- Sistema de duplo híbrido em levedura
Contexto
- O sistema de duplo híbrido em levedura é um método amplamente utilizado para estudar interações entre proteínas.
- Os métodos convencionais frequentemente geram um alto número de falsos positivos.
- Melhorar a precisão dessas triagens é essencial para obter informações biológicas confiáveis.
- Este estudo tem como objetivo abordar esses problemas por meio de modificações metodológicas.
Objetivo do Estudo
- Modificar o protocolo de duplo híbrido em levedura para aumentar a precisão.
- Reduzir a carga de trabalho e o tempo necessário para triagens.
- Fornecer um método reprodutível e confiável para identificar interações proteicas.
Métodos Utilizados
- Preparação de uma transformação em pequena escala do plasmídeo isca em levedura.
- Validação da construção isca utilizando um ensaio com inibidor competitivo.
- Tamisagem da biblioteca de cDNA em placas menos quatro.
- Verificação de clones positivos com ensaios de XGL e reação.
Resultados Principais
- O sistema modificado reduz significativamente o número de falsos positivos.
- Observou-se maior eficácia e sucesso no processo de triagem.
- Proteínas interagentes potenciais foram identificadas por meio de sequenciamento de DNA.
- A análise de bioinformática apoiou os achados.
Conclusões
- O sistema modificado de duplo híbrido em levedura é uma ferramenta confiável para estudos de interação proteica.
- Essa abordagem aumenta a eficiência geral das triagens genéticas.
- Aplicações futuras podem se beneficiar das taxas reduzidas de falsos positivos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A mapeamento de interações proteicas em estágio de descoberta é essencial para a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico&D. O sistema modificado de duplo híbrido em levedura (MY2H) permite a identificação mais confiável de parceiros proteicos, reduzindo os falsos positivos e acelerando insights acionáveis. Essa abordagem fortalece a confiança preditiva nos pontos de indicação de alvo e de identificação precoce de compostos promissores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação sistemática de interações proteína-proteína para a validação funcional de alvos.
- Reduz a ambiguidade mecanicista ao minimizar falsos positivos em telas de interação.
- Apóia o triagem confiável de alvos com base em parceiros de ligação validados.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara construções de isca validadas para fluxos de trabalho de triagem downstream.
- Melhora a reprodutibilidade e a confiabilidade do ensaio por meio de controles com inibidores competitivos.
- Facilita a triagem em larga escala de bibliotecas de cDNA para a descoberta de interações.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas de interações proteicas com vias relevantes para doenças quando a seleção do isca está associada à doença.
- Permite continuidade da descoberta até a validação pré-clínica ao identificar parceiros proteicos acionáveis.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados robustos de interação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O sistema MY2H se situa na interface entre a descoberta inicial e a identificação de compostos líderes, fornecendo uma plataforma reprodutível para mapear interações proteicas antes de estudos funcionais downstream.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao identificar interatores diretos de fatores de crescimento ou proteínas relevantes para doenças.
- Triagem: Fornece resultados validados e com baixa taxa de falsos positivos, adequados para ensaios bioquímicos ou celulares adicionais.
- Análises: Oferece contagens quantitativas de colônias e acertos confirmados por sequenciamento para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta dados de interação a modelos de doenças quando as proteínas isca estão implicadas em patologias.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho padronizado e reprodutível, adaptável a diversos alvos proteicos em diferentes portfólios.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a incerteza mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e produtividade de telas de interação proteica.
- Valor Estratégico: Permite decisões de avançar/não avançar mais informadas e um gerenciamento de portfólio com maior eficiência no uso de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de alvos validados.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em genética de leveduras, clonagem molecular e análise de bioinformática.
- Requer acesso a equipamentos de transformação, meios seletivos e infraestrutura de sequenciamento.
- Exige padronização entre equipes para validação da isca e controles de inibidores.
- Adaptável a diversas proteínas isca, mas pode exigir otimização para construtos específicos.
- A redução de falsos positivos depende de etapas rigorosas de controle e validação.
