Name: Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a isolar células dendríticas convencionais de pulmão de camundongo usando digestão com colagenase, separação magnética de células CD11c+ e citometria de fluxo. Este método permite obter preparações altamente purificadas para estudos de imunologia pulmonar.

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Os autores gostariam de agradecer a Marilyn Dietrich no Centro de Núcleo LSU Citometria de Fluxo por sua ajuda com a separação de células e Mottram Peter por sua ajuda com as microfotografias. Este trabalho foi financiado pela Flight Attendant Medical Research Institute, da LSU-Competitiva Prêmio Programa de Pesquisa, e os subsídios NIH / NIAID P20 RR020159 e R03AI081171.

1. Perfusão pulmonar e suspensão única célula <ol><li> Euthanize o mouse com uma injeção intraperitoneal de cetamina / xilazina mistura anestésica (em mg / mouse ketamina 1.8, xilazina 0,19) e sangria pela veia femoral </li><li> Expor a cavidade torácica, cortando e puxando para trás a pele externa do peritônio. Proceder à abertura do diafragma, cortando a caixa torácica para expor tanto o coração e os pulmões. </li><li> Perfundir gentilmente os pulmões com uma seringa de 5 ml preenchido com EDTA-HBSS (1mM EDTA de cálcio / magnésio livre de HBSS). Conectar uma agulha G 25 e inserir a agulha para o ventrículo direito. Para evitar fugas durante a injeção, segura o tecido ao redor da agulha myocardiac usando uma pinça. Suavemente injectar a solução, mantendo uma pressão constante. Perfusão será a precisão do resultado da inflação do pulmão e uma mudança de cor de rosa / branco. </li><li> Remover linfonodos drenantes para descartar qualquer possível contaminação a partir deste tecido. </li><li> Coletartecido pulmonar, a transferência para uma placa de Petri sobre gelo, e pique em pedaços pequenos usando uma lâmina de barbear. </li><li> Transferência de tecidos fundada em um tubo C gentleMACS contendo 5 ml / pulmão de solução de digestão da colagenase (colagenase tipo 1A 0,5 mg / ml, mais tipo IV de pâncreas bovino DNase 20 mg / ml em HBSS contendo 5% de FBS, 100 U / ml de penicilina e 100 mg / estreptomicina ml). </li><li> Use o dissociator gentleMACS para obter uma suspensão única célula. Escolha o programa: m_lung_01. Incubar amostra a 37 ° C por 30 minutos. Agite tubo a cada 5 minutos para voltar a suspender fragmentos de tecido. Prosseguir com m_lung_02 programa. </li><li> Transferência de amostra para um tubo cônico de 15 ml e centrifugar por 10 minutos a 335 x g a 4 ° C. Após esta etapa, manter todos os reagentes e centrifugação a 4 ° C para evitar a redução da viabilidade celular. </li><li> Elimine o sobrenadante e lise restantes células vermelhas do sangue, adicionando 2 ml de tampão de lise ACK por 1 minuto à temperatura ambiente. Lavar as células com 13ml de BSA PBS/0.5% fria e centrifugação por 10 minutos a 335 x g a 4 ° C. </li><li> Elimine o sobrenadante, ressuspender total de células em 5 ml de BSA PBS/0.5% fria e passe completo de 100 M malha de nylon. </li><li> Determinar o número total de células usando corante de exclusão de tripan blue. </li></ol> 2. Isolamento magnético e CD11c + enriquecimento de células <ol><li> Centrífuga suspensão única célula por 10 minutos a 200 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender pellet celular em 400 mL de tampão de separação (PBS, BSA 0,5%, e 2 mM de EDTA) por 10 8 células total. Bloco de anticorpos Fc mediada inespecíficos ligação usando anti-CD16/CD32 anticorpos (0.5μg / 10 6 células) por 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Lavar as células com 10 ml de tampão de separação fria e centrifugação por 10 minutos a 200 x g a 4 ° C. Ressuspender as células em 400 mL de tampão de separação. </li><li> Adicione 100 ml de microesferas de CD11c por 10 8 </sup&gt; células total. Misture bem e incubar por 15 minutos na geladeira (2-8 ° C). </li><li> Lavar as células com 10 ml de tampão de separação fria e centrifugação por 10 minutos a 200 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o pellet celular em 3 ml de tampão de separação frio. </li><li> Realizar separação magnética usando o separador autoMACS Pro TM, selecionando o posseld programa. Recolher a fração positiva (0,5 ml). </li></ol> 3. Células dendríticas convencional (CDC) de isolamento <ol><li> Incubar enriquecido CD11c suspensão de células positivas com anti-CD11c-PE Cy7 e anti-IA/IE (MHC-II)-FITC anticorpos durante 30 minutos a 4 ° C. Concentração otimizada de anticorpos é de 0,5 mg / 10 6 de células. </li><li> Lavar as células com BSA PBS/0.5% fria e centrifugação por 10 minutos a 335 x g a 4 ° C. Ressuspender as células em 0,5 ml de BSA PBS/0.5% e passá-las através de uma malha de nylon 40 mM. </li><li> Proceder àclassificar as células usando o classificador de células FACS Aria no modo de pureza. Adicione 100 ml de BSA PBS/0.5% para os tubos de coleta, a fim de evitar danos de células purificadas. Mantenha suas células, a uma temperatura de refrigeração em todo o processo de separação de células. </li></ol> 4. Protocolo alternativo para a obtenção de uma suspensão única célula e CD11c + enriquecimento de células <ol><li> Em substituição do dissociator gentleMACS, tecido pulmonar fundamentada a partir do passo 1.5 pode ser transferida para um tubo cônico de 15 ml contendo 5 ml de solução de colagenase por pulmão e incubar por 1 hora a 37 ° C. Vortex células a cada 15 minutos, a fim de ressuspender fragmentos de tecido. Perturbar o tecido, passando a amostra 6-8 vezes dentro e para fora através de uma seringa de 3 ml conectada a uma agulha G 20. Evite fazer bolhas durante o processo, caso contrário, a viabilidade celular será comprometida. Uma vez que a suspensão única célula é obtida, continue para o passo 1.8. </li><li> Em substituição do TM AutoMACSPro separaçãotor, o isolamento magnético para o enriquecimento das células CD11c, também pode ser realizada pela passagem da suspensão de células manualmente através de duas colunas MACS. A seleção das colunas apropriado irá variar dependendo do tamanho da amostra. </li></ol> 5. Resultados representativos: Pulmão CDC são identificados como CD11c oi / MHC-II população de células oi. Como mostrado na figura. 1, do CDC representam uma porcentagem menor de 1,4% quando comparado a alguns outros tecidos, como baço (4,8%). No entanto, em contraste com o baço, as células do pulmão CD11c positiva expressar diferentes quantidades de MHC-II, incluindo uma população de células diferentes do que a de CDC. Após a preparação de uma única célula, o rendimento das células pulmonar total foi de cerca de 3,0-3,8 x 10 7 células / pulmão com uma viabilidade de 60-70% dos quais pouco mais de 1%, representado subconjunto CDC. Esta percentagem foi aumentada após o isolamento CD11c magnética onde o total de pulmão CDC foi incrementado cerca de 10 times (&gt; 16%) desde a preparação original (Fig. 2A). No entanto, as células CD11c expressar baixas quantidades de MHC-II (CD11c oi / MHC-II eis que macrófagos) representou uma população de células de alta contaminação (&gt; 70%), que foi misturado com o subconjunto CDC pulmão. Como mostrado na figura. 2B, essas células foram eliminados após a etapa de separação de células, quando a pureza do CDC chegou a&gt; 96%. O rendimento habitual do CDC, após todo o procedimento foi de 5 x 10 4 células / pulmão. Microfotografias mostram características morfológicas do CDC como células arredondadas com as dendrites típicas (painel superior). Por outro lado, CD11c oi / MHC-II representaram um subconjunto lo morfologicamente diferentes que mostra protuberâncias celulares que são típicas de macrófagos (MΦ painel, menor) 12. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig1.jpg" /> Figura 1. Diferencial de freqüência DC no pulmão do rato e do baço. Um pulmãond tecido do baço de camundongos C57BL / 6 foram coletados e tratados com colagenase. Após digestão com colagenase, as células foram marcadas com anti-mouse CD11c-PE-Cy7 e anti-mouse IA / IE-FITC. Parcelas representativas de citometria de fluxo mostram percentuais de CDC (CD11c oi / MHC-II oi) no pulmão e baço. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig2.jpg" /> Figura 2. Isolamento de CDC do pulmão do rato. Rato pulmão suspensão única célula foi marcado com anti-CD11c micro e passou por um separador automático de células. A) Um representante trama mostra os percentuais de CDC (CD11c oi / MHC-II oi) e macrófagos (MΦ, CD11c oi / MHC-II lo) após o enriquecimento CD11c populações. Coloração mais da fração enriquecida seguido usando anti-mouse CD11c-PE-Cy7 e anti-mouse IA / IE-FITC. Duplo células positivas foram classificadas e analisadas por citometria de fluxo. Paraidentificar sua morfologia, as células foram cytospun e marcadas com uma coloração modificada Wright-Giemsa. B) parcelas Representante mostram percentuais de CDC e MΦ após separação de células. Microfotografias mostram uma imagem representativa do pulmão CDC e MΦ pulmão. Barra de escala = 20 mM.

<ol><li>Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pathogens+and+tuning+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sensing pathogens and tuning immune responses.</a> Science. 293, 253-256 (2001).</li>
<li>Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Manicassamy, S., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+control+of+tolerogenic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell control of tolerogenic responses.</a> Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).</li>
<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).</li>
<li>Asselin-Paturel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).</li>
<li>Chan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-producing+killer+dendritic+cells+provide+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity.</a> Nat. Med. 12, 207-213 (2006).</li>
<li>Taieb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+dendritic+cell+subset+involved+in+tumor+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance.</a> Nat. Med. 12, 214-219 (2006).</li>
<li>Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+pulmonary+dendritic+cell+function+by+paramyxovirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections.</a> Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).</li>
<li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+leukocyte+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).</li>
<li>Sung, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+lung+CD103+%28alphaE%29-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+CD11c%2B+MHC+class+II-+precursors+generate+lung+dendritic+cells+during+respiratory+viral+infection%2C+but+are+depleted+in+the+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process.</a> J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).</li>
<li>Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+of+alternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).</li>
<li>Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+regulates+migratory+pattern+and+antigen+uptake+of+lung+dendritic+cell+subsets+in+a+murine+model+of+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation.</a> J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).</li>
<li>Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+response+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection.</a> J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Isolamento de pulmonar do rato DC é uma técnica importante para o estudo de uma ampla gama de estímulos respiratórios. O processo de obtenção dessas células inclui passos críticos que impedem a perda de células, bem como a viabilidade celular e pureza. Perfusão do pulmão antes da coleta ajudará a eliminar as células periféricas, bem como reduzir os eritrócitos contaminantes. O uso da dissociação automatizado pode ser advanteogus quando um grande número de pulmões são tratados, caso contrário, você pode optar pelo protoc...

<table width="200" border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> Tampão de lise ACK </td><td> Invitrogen </td><td> D6-0005DG </td><td></td></tr><tr><td> Anti-camundongo CD11c (HL3) </td><td> BD PharMingen </td><td> 5580979 </td><td> PE-Cy7 conjugados </td></tr><tr><td> Anti-camundongo IA / IE (269) </td><td> BD-PharMingen </td><td> 553623 </td><td> FITC conjugado </td></tr><tr><td> Collangenase tipo 1A </td><td> Sigma </td><td> 9891-500mg </td><td></td></tr><tr><td> Filtros celular </td><td> BD Falcon </td><td> 352340, 352360 </td><td></td></tr><tr><td> CD11c (N418) microesferas </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D5025-150KU </td><td></td></tr><tr><td> Solução salina balanceada de Hank </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Solução tampão Hepes </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de Petri 60 milímetros </td><td> BD Falcon </td><td> 351016 </td><td></td></tr><tr><td> GentleMACS ™ C tubos </td><td> Miltenyi </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> Dissociator MACS gentil </td><td> Miltentyi </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS-Pro ™ </td><td> Miltenyi </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> FASCS Aria </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr></table>

isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Células pulmonares dendríticas (DC) desempenham um papel fundamental na detecção invadindo 1,2 patógenos, bem como no controle de respostas tolerogênico 3 no trato respiratório. Pelo menos três subconjuntos principais de células dendríticas pulmonares têm sido descritas em ratos: DC convencional (CDC) 4, plasmocitóide DC (PDC) 5 e IFN-produzindo assassino DC (IKDC) 6,7. O subconjunto do CDC é o subconjunto DC mais proeminentes no pulmão 8. O marcador comum conhecida para identificar subgrupos DC CD11c é, um tipo que eu transmembrana integrina (β2), que também é expresso em monócitos, macrófagos, neutrófilos e algumas células B 9. Em alguns tecidos, usando CD11c como um marcador para identificar rato DC é válido, como no baço, onde a maioria das células CD11c + representa o subconjunto do CDC que expressa altos níveis do complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHC-II). No entanto, o pulmão é um tecido mais heterogêneo, onde sesubconjuntos lado DC, há uma elevada percentagem de uma população de células distintas que expressa altos níveis de CD11c combate os baixos níveis de MHC-II. Com base na sua caracterização e principalmente em sua expressão de F4/80, um marcador de macrófagos do baço, o CD11c oi MHC-II eis população de células do pulmão foi identificado como macrófagos pulmonares 10 e, mais recentemente, como um precursor potencial DC 11. Em contraste com o rato pDC, o estudo do papel específico do CDC na resposta imunológica pulmonar tem sido limitado devido à falta de um marcador específico que poderia ajudar no isolamento dessas células. Portanto, neste trabalho, descrevemos um procedimento para isolar altamente purificado do mouse pulmão CDC. O isolamento de subconjuntos pulmonar DC representa uma ferramenta muito útil para obter insights sobre a função destas células em resposta a patógenos respiratórios, bem como fatores ambientais que podem desencadear a resposta imune do hospedeiro no pulmão.

A preparação altamente purificada de células dendríticas pulmonares do rato é descrito. Ênfase específica é dada para o isolamento de um subconjunto de células dendríticas convencionais.

Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

As células dendríticas (DC) do pulmão desempenham um papel fundamental na detecção de patógenos invasores 1,2, bem como no controle de respostas tolerogênicas 3 no...

O objetivo geral deste procedimento é obter uma preparação altamente purificada de células dendríticas de pulmão de camundongo. Isso é realizado primeiramente coletando o tecido pulmonar sem incluir os linfonodos drenantes. Em seguida, uma suspensão de células únicas é obtida por digestão com colagenase.O próximo passo é enriquecer as células positivas para CD11C utilizando um sistema de isolamento celular magnético. Agora, o subconjunto de células dendríticas convencionais é isolado por meio de ordenação celular por citometria de fluxo. Em última análise, as células dendríticas convencionais isoladas a partir do tecido pulmonar de camundongo podem ser analisadas por citometria de fluxo e microscopia de luz.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da imunologia, como qual é o envolvimento do subconjunto de células dendríticas convencionais na imunidade inata e em doenças infecciosas do trato respiratório? O procedimento será demonstrado por Issa Lancelin, pesquisadora associada do meu laboratório, e por mim. Após a eutanásia do camundongo, inicie cortando e, em seguida, puxando suavemente para trás a pele externa do peritônio para expor a cavidade torácica.Prossiga abrindo o diafragma mediante corte na caixa torácica para expor o coração e os pulmões. Uma vez expostos o coração e os pulmões, o procedimento de perfusão pode ser iniciado. Encha uma seringa de cinco mililitros com E-D-T-A-H-B-S-S e conecte uma agulha de 25 graus à seringa.Em seguida, insira a agulha no ventrículo direito para evitar vazamentos durante a injeção. Use pinça para fixar o tecido miocárdico ao redor da agulha. Então, injete suavemente a solução mantendo uma pressão constante.Uma perfusão precisa resultará na inflação pulmonar e na mudança de cor para rosa ou branco; para evitar contaminação potencial, remova e descarte os linfonodos drenantes. Em seguida, colete o tecido pulmonar, transferindo o órgão ressecado para uma placa de Petri sobre gelo. Encha um tubo gentle max C com cinco mililitros de solução de digestão com colagenase pulmonar e, então, pique o pulmão em pequenos pedaços.Usando uma lâmina de barbear, transfira o tecido para o tubo utilizando uma dissociação máxima suave. Para obter uma suspensão de células isoladas, selecione o programa M lung zero one. Em seguida, incube a amostra a 37 graus Celsius por 30 minutos, agitando o tubo a cada cinco minutos para ressuspender os fragmentos de tecido F, e prossiga com o programa M lung zero two.Agora, transfira a amostra para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue as células por 10 minutos a 335 ×g a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e adicione dois mililitros de um tampão de lise CK ao pellet, mantendo por um minuto à temperatura ambiente para lisar os glóbulos vermelhos remanescentes. Em seguida, lave as células com 13 mililitros de PBS frio suplementado com 0,5% de BSA.Após descartar o sobrenadante, ressuspenda novamente este pellet em cinco mililitros de PBS frio contendo BSA e, em seguida, passe a solução celular por uma malha de náilon de 100 micrômetros. Por fim, determine o número total de células pelo método de exclusão com azul de trian. Em vez de usar uma dissociação suave com max, encha um tubo cônico de 15 mililitros com cinco mililitros de solução de colagenase por pulmão.Adicione o tecido pulmonar picado ao tubo e incube o tecido pulmonar por uma hora a 37 graus Celsius. Vortexe as células a cada 15 minutos para re-sedimentar os fragmentos de tecido. Em seguida, rompa o tecido digerido passando a amostra de seis a oito vezes por uma seringa de três mililitros acoplada a uma agulha de 20 gauge.Evite formar bolhas durante o processo. Primeiro, lave a suspensão de células isoladas por 10 minutos a 200 vezes G a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células em 400 microlitros de tampão de separação.Realize um bloqueio de ligação inespecífica de anticorpos mediada por FC nas oito células totais usando 0,5 microgramas de anticorpo anti-CD16/32, incubando as seis células por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após lavar as células com 10 mililitros de tampão de separação frio, re-suspenda as células em mais 400 microlitros de tampão de separação. Em seguida, adicione 100 microlitros de microesferas CD11c, realize um bloqueio nas oito células totais, misture bem e incube a solução de células e microesferas por 15 minutos na geladeira.Após remover as microesferas não ligadas com 10 mililitros de tampão de separação frio, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de separação frio. Por fim, carregue as amostras no separador AutoMax pro e execute o programa P-O-S-S-E-L-D. Para coletar a fração de células que expressam CD11C.Incube a suspensão celular enriquecida positiva para CD11c com o anticorpo anti-CD11c PE-Cy7 e anticorpos direcionados contra as moléculas da Classe II do MHC presentes nessas células por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após lavar as células com PBS frio mais BSA, re-suspenda as células em 0,5 mililitros de PBS mais BSA e filtre-as através de uma peneira de malha de náilon de 40 micrômetros. Finalmente, adicione as células positivas para CD11c purificadas a um tubo de citometria para posterior quantificação em tubos em branco separados.Adicione 100 microlitros de PBS com BSA a tubos de coleta de cinco mililitros para prevenir danos às células purificadas e classifique a suspensão celular filtrada por meio de citometria de fluxo, mantendo as células coletadas em temperatura refrigerada durante todo o processo de separação celular. Nestes gráficos de densidade, há mais de três vezes o número de células dendríticas convencionais encontradas no baço do que nos pulmões. Além disso, no pulmão, as células positivas para CD11c incluem uma população celular que não corresponde a células dendríticas convencionais, representada pelo grupo de eventos com baixa expressão de MHC Classe II fora do gate das células dendríticas convencionais.No lado esquerdo da figura, conforme visto neste gráfico de densidade, a separação magnética de células pulmonares totais aumenta o número de células dendríticas convencionais de cerca de 1,5% das células totais para aproximadamente 16,5%. No entanto, os macrófagos positivos para CD11C e com baixa expressão de MHC classe II ainda representam mais de 70% da população celular total, contaminando significativamente a pureza da fração enriquecida de células dendríticas convencionais pulmonares nesta etapa do processo de isolamento. A classificação por FACS, entretanto, aumenta a pureza das células dendríticas convencionais para mais de 96%, conforme observado na microfotografia superior direita. As células dendríticas convencionais CD11C alto e MHC classe II alto são células arredondadas que apresentam os dendritos típicos, enquanto as células CD11C alto e MHC classe II baixo, vistas na microfotografia inferior direita, exibem protuberâncias celulares mais típicas da morfologia de macrófagos.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de manipular o tecido pulmonar e a preparação de células isoladas nas temperaturas indicadas. Isso é crítico para a preservação da viabilidade celular e do rendimento de células dendríticas convencionais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar subpopulações de células dendríticas do pulmão de camundongo.O isolamento de subconjuntos de células dendríticas pulmonares representa uma ferramenta muito útil para compreender as funções dessas células em resposta a patógenos respiratórios e fatores ambientais que podem desencadear a resposta imune do hospedeiro no pulmão.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Dissociar as células de tipos de tecido específico requer parâmetros específicos para a agitação do tecido para obter um volume elevado de viáveis, as células cultiváveis. A Miltenyi gentleMACS dissociator otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. Nesta publicação o uso deste aparelho no tecido pulmonar é explicado.

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Neste artigo, vamos demonstrar o isolamento de murino residente de pulmão de células-tronco mesenquimais (MSC pulmão), sua expansão, caracterização e análise de propriedades imunomoduladores.

Isolamento &amp; Caracterização da Hoechst Baixa CD45 Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

Aqui, nós detalhe uma metodologia para o isolamento rápido de células de ratinho intestinais dendríticas (DC) e macrófagos. Caracterização fenotípica de DCs intestinais e macrófagos é realizada utilizando várias cores análise de fluxo citométrico enquanto enriquecimento grânulo magnético seguido por separação de células é usado para produzir populações altamente puros para estudos funcionais.

Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

Este protocolo detalha um método para isolar células apresentadoras de antigénio a partir de timo humano por meio de diferentes passos de digestão enzimática do tecido seguida por centrifugação de densidade da suspensão de células individuais e finalmente separação magnética e / ou FACS das populações de células de interesse.

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

Subconjuntos distintos de células dendríticas existem como populações raras em órgãos linfóides e, portanto, são difíceis de isolar em número e pureza suficientes para experimentos imunológicos. Aqui descrevemos um método de alta eficiência e alto rendimento para isolamento de todos os principais subconjuntos atualmente conhecidos de células dendríticas esplênicas de camundongos.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Descreve-se um método para a geração de corte de precisão pulmonar fatias (PCLS) e imunocoloração-los para visualizar a localização de vários tipos de células imunitárias no pulmão. Nosso protocolo pode ser estendido para visualizar a localização e função de muitos tipos diferentes de células sob uma variedade de condições.

Rato pulmão Slices para Visualize células vivas pulmonar dendríticas precisão de corte

Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.

Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

Neste artigo, células endoteliais primárias do pulmão foram isoladas e cultivadas de camundongos neonatais.

Isolamento de Células Endoteliais Primárias de Pulmão de Camundongo

Fornecemos um protocolo detalhado para isolar e identificar populações raras de células T específicas de antígenos em pulmões de camundongos por meio de enriquecimento de células T baseadas em esferas magnéticas e tetrâmeros peptídicos: complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

Identificação de células T raras específicas de antígenos de pulmões de camundongos com peptídeos: tetrâmeros do complexo principal de histocompatibilidade

Este protocolo detalha o isolamento de populações imunes e não imunes vivas do pulmão de camundongo em estado estacionário e após a infecção por influenza. Ele também fornece estratégias de gating para identificar subconjuntos de células epiteliais e mieloides.

Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo

Aprenda a isolar células dendríticas convencionais de pulmão de camundongo usando digestão com colagenase, separação magnética de células CD11c+ e citometria de fluxo. Este método permite obter preparações altamente purificadas para estudos de imunologia pulmonar.

Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

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