Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

O objetivo geral deste procedimento é obter uma preparação altamente purificada de células dendríticas de pulmão de camundongo. Isso é realizado primeiramente coletando o tecido pulmonar sem incluir os linfonodos drenantes. Em seguida, uma suspensão de células únicas é obtida por digestão com colagenase.

O próximo passo é enriquecer as células positivas para CD11C utilizando um sistema de isolamento celular magnético. Agora, o subconjunto de células dendríticas convencionais é isolado por meio de ordenação celular por citometria de fluxo. Em última análise, as células dendríticas convencionais isoladas a partir do tecido pulmonar de camundongo podem ser analisadas por citometria de fluxo e microscopia de luz.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da imunologia, como qual é o envolvimento do subconjunto de células dendríticas convencionais na imunidade inata e em doenças infecciosas do trato respiratório? O procedimento será demonstrado por Issa Lancelin, pesquisadora associada do meu laboratório, e por mim. Após a eutanásia do camundongo, inicie cortando e, em seguida, puxando suavemente para trás a pele externa do peritônio para expor a cavidade torácica.

Prossiga abrindo o diafragma mediante corte na caixa torácica para expor o coração e os pulmões. Uma vez expostos o coração e os pulmões, o procedimento de perfusão pode ser iniciado. Encha uma seringa de cinco mililitros com E-D-T-A-H-B-S-S e conecte uma agulha de 25 graus à seringa.

Em seguida, insira a agulha no ventrículo direito para evitar vazamentos durante a injeção. Use pinça para fixar o tecido miocárdico ao redor da agulha. Então, injete suavemente a solução mantendo uma pressão constante.

Uma perfusão precisa resultará na inflação pulmonar e na mudança de cor para rosa ou branco; para evitar contaminação potencial, remova e descarte os linfonodos drenantes. Em seguida, colete o tecido pulmonar, transferindo o órgão ressecado para uma placa de Petri sobre gelo. Encha um tubo gentle max C com cinco mililitros de solução de digestão com colagenase pulmonar e, então, pique o pulmão em pequenos pedaços.

Usando uma lâmina de barbear, transfira o tecido para o tubo utilizando uma dissociação máxima suave. Para obter uma suspensão de células isoladas, selecione o programa M lung zero one. Em seguida, incube a amostra a 37 graus Celsius por 30 minutos, agitando o tubo a cada cinco minutos para ressuspender os fragmentos de tecido F, e prossiga com o programa M lung zero two.

Agora, transfira a amostra para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue as células por 10 minutos a 335 ×g a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e adicione dois mililitros de um tampão de lise CK ao pellet, mantendo por um minuto à temperatura ambiente para lisar os glóbulos vermelhos remanescentes. Em seguida, lave as células com 13 mililitros de PBS frio suplementado com 0,5% de BSA.

Após descartar o sobrenadante, ressuspenda novamente este pellet em cinco mililitros de PBS frio contendo BSA e, em seguida, passe a solução celular por uma malha de náilon de 100 micrômetros. Por fim, determine o número total de células pelo método de exclusão com azul de trian. Em vez de usar uma dissociação suave com max, encha um tubo cônico de 15 mililitros com cinco mililitros de solução de colagenase por pulmão.

Adicione o tecido pulmonar picado ao tubo e incube o tecido pulmonar por uma hora a 37 graus Celsius. Vortexe as células a cada 15 minutos para re-sedimentar os fragmentos de tecido. Em seguida, rompa o tecido digerido passando a amostra de seis a oito vezes por uma seringa de três mililitros acoplada a uma agulha de 20 gauge.

Evite formar bolhas durante o processo. Primeiro, lave a suspensão de células isoladas por 10 minutos a 200 vezes G a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células em 400 microlitros de tampão de separação.

Realize um bloqueio de ligação inespecífica de anticorpos mediada por FC nas oito células totais usando 0,5 microgramas de anticorpo anti-CD16/32, incubando as seis células por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após lavar as células com 10 mililitros de tampão de separação frio, re-suspenda as células em mais 400 microlitros de tampão de separação. Em seguida, adicione 100 microlitros de microesferas CD11c, realize um bloqueio nas oito células totais, misture bem e incube a solução de células e microesferas por 15 minutos na geladeira.

Após remover as microesferas não ligadas com 10 mililitros de tampão de separação frio, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de separação frio. Por fim, carregue as amostras no separador AutoMax pro e execute o programa P-O-S-S-E-L-D. Para coletar a fração de células que expressam CD11C.

Incube a suspensão celular enriquecida positiva para CD11c com o anticorpo anti-CD11c PE-Cy7 e anticorpos direcionados contra as moléculas da Classe II do MHC presentes nessas células por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após lavar as células com PBS frio mais BSA, re-suspenda as células em 0,5 mililitros de PBS mais BSA e filtre-as através de uma peneira de malha de náilon de 40 micrômetros. Finalmente, adicione as células positivas para CD11c purificadas a um tubo de citometria para posterior quantificação em tubos em branco separados.

Adicione 100 microlitros de PBS com BSA a tubos de coleta de cinco mililitros para prevenir danos às células purificadas e classifique a suspensão celular filtrada por meio de citometria de fluxo, mantendo as células coletadas em temperatura refrigerada durante todo o processo de separação celular. Nestes gráficos de densidade, há mais de três vezes o número de células dendríticas convencionais encontradas no baço do que nos pulmões. Além disso, no pulmão, as células positivas para CD11c incluem uma população celular que não corresponde a células dendríticas convencionais, representada pelo grupo de eventos com baixa expressão de MHC Classe II fora do gate das células dendríticas convencionais.

No lado esquerdo da figura, conforme visto neste gráfico de densidade, a separação magnética de células pulmonares totais aumenta o número de células dendríticas convencionais de cerca de 1,5% das células totais para aproximadamente 16,5%. No entanto, os macrófagos positivos para CD11C e com baixa expressão de MHC classe II ainda representam mais de 70% da população celular total, contaminando significativamente a pureza da fração enriquecida de células dendríticas convencionais pulmonares nesta etapa do processo de isolamento. A classificação por FACS, entretanto, aumenta a pureza das células dendríticas convencionais para mais de 96%, conforme observado na microfotografia superior direita. As células dendríticas convencionais CD11C alto e MHC classe II alto são células arredondadas que apresentam os dendritos típicos, enquanto as células CD11C alto e MHC classe II baixo, vistas na microfotografia inferior direita, exibem protuberâncias celulares mais típicas da morfologia de macrófagos.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de manipular o tecido pulmonar e a preparação de células isoladas nas temperaturas indicadas. Isso é crítico para a preservação da viabilidade celular e do rendimento de células dendríticas convencionais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar subpopulações de células dendríticas do pulmão de camundongo.

O isolamento de subconjuntos de células dendríticas pulmonares representa uma ferramenta muito útil para compreender as funções dessas células em resposta a patógenos respiratórios e fatores ambientais que podem desencadear a resposta imune do hospedeiro no pulmão.