Medição Translocação Peptide em grandes vesículas Unilamelares

Para quantificar a translocação de peptídeos através de membranas de vesículas. Vesículas lipídicas marcadas com fluoróforo são geradas com tripsina encapsulada. Um inibidor de tripsina é adicionado para inibir a atividade de qualquer tripsina exógena, deixando a tripsina ativa no lúmen da vesícula.

Somente quando peptídeos marcados com fluorescência são adicionados às vesículas, suas marcas fluorescentes atuam como doadores de fret e excitam as moléculas fluorescentes na vesícula. No entanto, quando as proteínas atravessam a membrana, são digeridas pela tripsina e o sinal de fret é perdido. A análise espectrométrica revela o grau de translocação do peptídeo, observado como uma diminuição do fret entre as vesículas e o peptídeo ao longo do tempo.

A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos, incluindo outras técnicas de vesículas lipídicas e métodos para medir a entrada de peptídeos em células, é que ela fornece informações sobre a cinética da entrada na membrana, e não exige a adição de um marcador fluorescente aos peptídeos caso eles contenham um triptofano. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no projeto e engenharia de peptídeos ativos na membrana, como quais características são necessárias para uma translocação eficaz através da membrana. O primeiro passo deste procedimento é preparar vesículas unilamelares grandes ou UUVs para servir como modelos de membrana celular no ensaio.

Inicie combinando a fosfatidilcolina, a fosfatidilglicerol e a fosfatidiletanolamina sulfonilada de 5-dimetilamino naftaleno em clorofórmio numa proporção de 50:45:5. Geralmente, 0,376 miligramas de lipídio total são suficientes para produzir vesículas em quantidade adequada para um único ensaio experimental ou controle.

Prepare um frasco como amostra experimental e outro como controle; evapore o clorofórmio utilizando um fluxo de gás nitrogênio. Os lipídios secos que permanecem após esta etapa são denominados bolos lipídicos. Seque os bolos lipídicos por nove a 14 horas em um dessecador a vácuo.

Em seguida, prepare uma solução estoque de HEI a 10 milimolar, uma solução estoque de tripsina suína a 0,4 milimolar e uma solução estoque de inibidor de tripsina Bowman-Birk a 4,0 milimolar; os detalhes para a preparação encontram-se no documento anexo. Adicione um volume igual da solução estoque de tripsina a 0,4 milimolar e da solução tampão de HEI a 10 milimolar aos discos lipídicos secos. Em seguida, agite o frasco em vórtex para reconstituir as vesículas multilamelares (MVs). Para reconstituir as MVs controle, adicione um volume igual da solução estoque de tripsina a 0,4 milimolar e do inibidor de tripsina a 4,0 milimolar ao disco lipídico seco e agite novamente em vórtex como antes.

Uma vez que as MVs são reconstituídas, transfira as soluções de VLM de frascos de vidro para tubos microcentrífugos de 1,7 mililitro. Em seguida, submeta as soluções de VLM a cinco ciclos de congelamento-descongelamento, alternando entre nitrogênio líquido e um banho de água a 30 graus Celsius. A seguir, prepare um extrusor de lipídios umedecendo dois suportes de filtro em Tampão Heiss.

Em seguida, coloque cada um deles sobre um pedaço de extrusor de teflon umedecido e posicione uma membrana de policarbonato porosa com poros de 0,1 mícron entre os dois pedaços de extrusor de teflon. Agora, coloque os pedaços do extrusor dentro de um cartucho metálico de extrusão e posicione um espaçador em forma de anel sobre os dois pedaços do extrusor. Aperte a tampa metálica do cartucho de extrusão e, em seguida, coloque-o no suporte utilizando uma seringa de vidro de 250 microlitros.

Encha o espaço vazio do extrusor com 500 microlitros de tampão He piece 10 milimolar para evitar qualquer perda da amostra de vesículas. Transfira a amostra para um béquer de 10 mililitros.

Em seguida, carregue cada amostra de MLV no extrusor e empurre a amostra através da membrana pelo menos 21 vezes. Para garantir tamanho uniforme das vesículas Ella após a extrusão, transfira as vesículas lipídicas grandes de ELLA ou L UUVs para um tubo microcentrífuga de 1,7 mililitro. Armazene os UUVs a quatro graus Celsius e utilize-os dentro de 48 horas.

Para avaliar a concentração de LUV, determina-se o teor total de fósforo na amostra. O seguinte deve ser preparado de acordo com as especificações no protocolo escrito anexo: ácido H dois S O quatro 8,9 normal, molibdato de amônio 2,5% peso por volume, ácido ascórbico 10% peso por volume e solução tampão de fosfato 0,65 milimolar.

Prepare seis padrões de fósforo conforme mostrado aqui. Em seguida, prepare um branco de LUV com o mesmo volume de solução de tripsina 0,2 milimolar e inibidor Bowman BIR 2,0 milimolar utilizados para os controles. Isso é feito para corrigir quaisquer sais de fósforo secos presentes no pó do inibidor Bowman B.

A seguir, pipete cerca de 0,1 micromol, geralmente cerca de 25 microlitros de UUVs, em tubos de cultura de vidro descartáveis em triplicata. Em seguida, adicione 450 microlitros de H dois SO quatro 8,9 normal a cada um dos tubos de amostra, padrão e branco. Em seguida, coloque as amostras, padrões e brancos em uma estufa a 175 a 210 graus Celsius por 25 minutos.

Após 25 minutos, retire todos os tubos do forno e deixe esfriar. Adicione 150 microlitros de 30%H2O a cada um dos tubos. Em seguida, aqueça as amostras, padrões e brancos por mais 30 minutos entre 175 e 210 graus Celsius.

Após 30 minutos, retire os padrões, amostras e brancos do aquecimento. Se alguma das soluções ainda não estiver incolor, adicione 50 microlitros de tubo de H2O a todos os tubos e aqueça por mais 15 minutos a 175-210 graus Celsius. Assim que as soluções ficarem incolores, adicione a cada tubo 3,9 mililitros de H2O nano pura, 0,5 mililitros de solução de molibdato de amônio e 0,5 mililitros de solução de ácido ascórbico.

Em seguida, aqueça todos os tubos por cinco a sete minutos. Em um banho-maria em ebulição, meça a absorbância de cada padrão e amostra a 820 nanômetros utilizando um espectrofotômetro UV-visível Agilent 8 4 5 3. As concentrações de LUV experimentais e controle devem ser medidas separadamente.

O tubo contendo 0,0 milimol de fósforo deve ser usado como branco para todos os padrões e amostras experimentais de LUV. O tubo contendo 0,2 milimolar de tripsina, 2,0 milimolar de osso e solução inibidora de bir deve ser usado como branco para a amostra controle de LUV. A curva padrão linear de absorbância versus teor de fósforo obtida deve ser usada para calcular o teor total de fósforo e a concentração de LUV das amostras.

Para preparar as soluções de peptídeos, dissolva o peptídeo em Oppu H2O. Os peptídeos utilizados neste ensaio devem conter um resíduo de triptofano. Meça a absorbância da solução de peptídeo a 282 nanômetros em triplicata. Calcule a concentração do peptídeo utilizando o coeficiente de extinção molar para triptofano de 5.700.

Centímetros inversos molares diluem o peptídeo em água nano pura até uma concentração final de 30 micromolares, armazene a menos 20 graus Celsius. Para quantificar a translocação, prepare amostras experimentais e controles em tubos microcentrífugos de 1,7 mililitro. Adicione quantidade suficiente de UUVs a cada solução para uma concentração final de 250 micromolares.

Adicione quantidade suficiente de solução inibidora Bowman BIR para que o inibidor atinja uma concentração final 10 vezes maior que a concentração de tripsina. Adicione quantidade suficiente de tampão heis 10 milimolar para ajustar o volume final da solução a 450 microlitros. Coloque 50 microlitros da solução de peptídeo em uma cubeta de fluorímetro stana micro chords e insira-a no programa do espectrofotômetro.

Um espectrofotômetro de fluorescência para realizar um experimento de cinética fluorescente de 25 minutos, no qual uma leitura de fluorescência é registrada pelo menos uma vez por segundo com um comprimento de onda de excitação de 280 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 525 nanômetros a 25 graus Celsius. Com a sensibilidade do PMT no máximo, adicione a amostra experimental ou controle à solução de peptídeo no qve. Isso deve levar a concentração final do peptídeo a três micromolares; imediatamente inicie o experimento de cinética fluorescente.

Após a execução das amostras experimentais e controle, calcule as razões de translocação conforme descrito no documento anexo. A razão entre s e o peptídeo é alta o suficiente para garantir que praticamente todos os peptídeos intactos estejam suficientemente próximos a um grupo dansel para gerar um sinal de fret, mesmo que nenhum deles tenha translocado para dentro da vesícula. Isso é consistente com o fret semelhante observado em condições controle para peptídeos que translocam e que não translocam para dentro das vesículas.

Ensaios de translocação foram realizados conforme descrito neste vídeo. Esta figura mostra os resultados de um peptídeo representativo que exibiu translocação robusta. O sinal neste experimento, representado pelo traço preto, mostra uma queda acentuada no sinal de fret.

Com o tempo, razões de translocação mais altas indicam peptídeos que translocam de forma eficiente. A razão de translocação para os peptídeos penetrantes em células mostrados aqui é 1,19; peptídeos com tradução semanal apresentam razões de translocação mais próximas de um, para controle da perda potencial do sinal FRET devido a tripsinas incompletas, inibição ou outros fatores não relacionados à capacidade de translocação. O sinal FRET entre o peptídeo e os UUVs contendo tanto tripsina quanto o inibidor de tripsina Bowman BRK é medido.

Isso é mostrado como o traço cinza. A importância do experimento controle utilizando UUVs contendo inibidor de tripsina é destacada pelos dados apresentados aqui. Nesse caso, o sinal do peptídeo diminuiu uma quantidade semelhante à da figura anterior na amostra experimental representada pelo traço preto.

No entanto, a amostra controle mostra uma diminuição mais rápida para este peptídeo, de modo que sua translocação líquida é menor. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar vesículas lipídicas e medir a translocação de peptídeos contendo triptofano. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de começar a coletar os dados imediatamente após a mistura do peptídeo e das vesículas.