Name: Medição Translocação Peptide em grandes vesículas Unilamelares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Aprenda a quantificar a translocação de peptídeos em vesículas unilamelares grandes usando FRET e tripsina encapsulada. Este método permite analisar a cinética de entrada em membranas lipídicas.

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Os autores gostariam de agradecer a Eleanor Fleming e Jessica Chen para discussões úteis. O financiamento foi fornecido pelo Instituto Nacional de Alergias e Doenças Infecciosas (NIH-NIAID) Award e um R15AI079685 Research Corporation Cottrell Prêmio Faculdade de Ciências. Apoio ao estudante adicional foi fornecido pelo Instituto Médico Howard Hughes e do fundo de Staley.

1. Preparação de grandes vesículas lipídicas Unilamelares (luvs) <ol><li> Prepare luvs para servir como membrana celular imita para o ensaio 19. </li><li> Fosfatidilcolina Mix (POPC, 760,10 g / mol), fosfatidilglicerol (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonil fosfatidiletanolamina (DNS-PAPA, 994,350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) dissolvido em clorofórmio a 50 : taxa de 45:5. Como todo ensaio requer a preparação separada de luvs tanto experimental e controle, dois frascos de bolo de lipídios deve ser preparado. 0,376 mg de lipídio total (0,188 mg POPC, 0,169 mg POPG e 0,019 mg DNS-POPE) é geralmente suficiente para fazer vesículas suficientes para um julgamento translocação único. </li><li> Evaporar o clorofórmio através de um fluxo de gás N 2. </li><li> Secar o bolo de lipídios 14/09 horas num exsicador de vácuo. </li><li> Prepare um estoque de 10 mM tampão HEPES (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58,44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). Tampão HEPES é stORed a 4 ° C. </li><li> Prepare uma solução estoque de 0,4 mM de tripsina suína (23,3 kg / mol) em 10 mM tampão HEPES preparado acima. Tripsina é armazenada a -20 ° C e, em nossa prática, geralmente não passam por mais de dois ciclos de congelamento e descongelamento antes de usar. </li><li> Prepare uma solução estoque de 4,0 mM Bowman-Birk inibidor de tripsina (8 kg / mol) em 10 mM tampão HEPES e armazenar a -20 ° C. Em nosso uso, esse estoque é reabastecido mensais e, normalmente, não sofre mais de 3 congelamento / degelo antes que seja feita novamente. </li><li> Reconstituir experimental vesículas multilamelares (MLVs) em uma solução de tripsina 0,2 mM, adicionando um volume igual de 0,4 mM de ações de tripsina e 10 mM tampão HEPES para o bolo de lipídios secas. Para uma única amostra de 0,376 mg de lipídeos totais, uma mistura de 150 mL de solução de tripsina e 150 mL de tampão HEPES é suficiente. </li><li> Reconstituir MLVs controle em uma solução com 0,2 mM e 2,0 mm de tripsina Bowman-Birk inibidor de tripsina, adicionando um volume igual a 0.4 mM estoque de tripsina e 4,0 mM inibidor de tripsina para os bolos secos de lipídios. Para uma única amostra de 0,376 mg de lipídeos totais, uma mistura de 150 mL de solução de tripsina e 150 mL de inibidor de tripsina é suficiente. </li><li> Soluções de transferência de MLV de frascos de vidro com 1,7 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Assunto MLV soluções a 5 congelamento / descongelamento em nitrogênio líquido. </li><li> Prepare lipídica extrusora (Avanti Polar Lipids), colocando dois suportes de filtro umedecido em solução tampão HEPES em cada pedaço extrusora Teflon. Coloque uma membrana track Nuclepore gravado com 0,1 mM poros (Whatman, Reino Unido), entre as duas peças Teflon extrusora, e coloque os pedaços dentro do canister extrusora extrusor metal. Coloque o espaçador donut sobre as duas peças extrusora antes de apertar a tampa de metal da caixinha extrusora e colocando-o no suporte. </li><li> Preencher o volume vazio dentro da extrusora com 500 10 mM tampão HEPES mL usando uma seringa de vidro 250 mL para evitar perda de amostra de vesícula. &lt;/ Li&gt; <li> Carga cada amostra MLV na extrusora e empurre a amostra através da membrana pelo menos 21 vezes para garantir o tamanho das vesículas unilamelares uniforme. Luvs são obtidos a partir da extrusão seguinte solução MLV. </li><li> Luvs armazenar a 4 ° C e usar dentro de 48 horas. </li></ol> 2. Quantificar LUV Concentração <ol><li> LUV concentração foi quantificada através da determinação do teor total de fósforo na amostra 20. </li><li> Prepare 8,9 NH 2 SO 4 em água NanoPure e armazenar em temperatura ambiente. </li><li> Prepare um w 2,5% / v molibdato de amônio VI (588,04 g / mol) solução em água NanoPure. Prepare um ácido ascórbico 10% w / v (176,1 g / mol) solução em água NanoPure. Proteger a solução de ácido ascórbico a partir de exposição à luz, cobrindo o tubo com papel alumínio. Loja ambas as soluções a 4 ° C por até 2 meses. </li><li> Prepare 0,65 mM tampão fosfato (fosfato de sódio monobásico anidro, 120 g / mol). </li><li> Prepare seis tu padrãobes. Normas devem conter 0,0 mL, 50 mL (0,0325 μmoles), 100 L (0,065 μmoles), 175 mL (0,114 μmoles), 250 mL (0,163 μmoles), ou 350 mL (0,228 μmoles) de solução de fósforo. </li><li> Prepare LUV tubos de amostra em triplicata. Cada tubo de amostra deve conter cerca de 0,1 μmoles de luvs. Experimental e controle LUV concentrações devem ser medidas separadamente. </li><li> Para corrigir os sais de fósforo secas no pó inibidor Bowman-Birk, um controle LUV em branco deve ser preparado. O espaço em branco deve conter o mesmo volume do 0,2 mM mM trypsin/2.0 solução inibidor Bowman-Birk como foi colocado no controle LUV tubo de amostra. </li><li> ML lugar 450 de 8,9 NH 2 SO 4 em cada uma das amostras, padrão e tubos em branco. </li><li> Amostras de calor, padrões e espaços em branco por 25 minutos a 175-210 ° C em um forno. </li><li> Remova todos os tubos e deixe esfriar. Adicionar 150 mL de 30% H 2 O 2 a cada um dos tubes. </li><li> Amostras de calor, padrões e espaços em branco durante 30 minutos a 175-210 ° C. </li><li> Remove as amostras, padrões e espaços em branco do calor. Se qualquer uma das soluções ainda não são incolor, adicionar 50 mL H 2 O 2 a todos os tubos e calor por mais 15 minutos a 175-210 ° C. </li><li> Adicionar 3,9 mL NanoPure H 2 O, 0,5 mL de solução de molibdato de amônio e 0,5 mL de solução de ácido ascórbico para cada tubo. </li><li> Todos os tubos de calor por 5-7 minutos em um banho de água fervente. </li><li> Medir a absorvância de cada padrão e amostra em 820 nm usando um espectrofotômetro Agilent 8453 UV-Visível. O tubo contendo 0,0 mmoles de fósforo deve ser usado como o espaço em branco para todos os padrões e experimental LUV amostras. O tubo contendo o 0,2 mM mM trypsin/2.0 solução inibidor Bowman-Birk deve ser usado como o espaço em branco para o controle LUV amostra. </li><li> A absorbância linear vs fósforo curva padrão de conteúdo podem ser produzidos e utilizados para calcular o total de phosphOrus conteúdo e LUV concentração das amostras. </li></ol> 3. Preparando Solutions Peptide <ol><li> Dissolver peptídeo em NanoPure H 2 O. Peptídeos usados ​​neste ensaio, como descrito deve conter um resíduo de triptofano. </li><li> Medir a absorvância da solução em 282 nm peptídeo em triplicata. Calcular a concentração de peptídeos usando o coeficiente de extinção molar de triptofano de 5700 M -1 cm -1. </li><li> Dilua em água peptídeo NanoPure a uma concentração final de 30 mM. Armazenar a -20 ° C </li></ol> 4. Quantificação de translocação <ol><li> Preparar amostras experimental e controle em 1,7 mL tubos de microcentrífuga. Adicionar luvs suficiente para cada solução para uma concentração final de 250 mM. Adicionar o suficiente Bowman-Birk solução inibidora de modo que é inibidor de uma concentração final de 10X superior à concentração de tripsina. Adicionar o suficiente 10 mM tampão HEPES para trazer o volume de solução final para 450 mL. </li> &lt;li&gt; Coloque 50 mL de solução de peptídeo em uma célula fluorímetro Starna micro quartzo. A relação entre luvs e peptídeo é alta o suficiente para garantir que praticamente todos os peptídeos intactos são próximas o bastante para um grupo dansyl para dar um sinal FRET mesmo que nenhum deles translocado na vesícula. Isto é consistente com o semelhante FRET observado em condições de controle de peptídeos que fazem e não translocate em vesículas. </li><li> Adicionar a amostra experimental ou de controle para a solução de peptídeo na cuvete. Isso deve reduzir a concentração de peptídeo final, a 3 mM. </li><li> Iniciar um 25 minutos de cinética fluorescentes imediatamente após a adição de experimental ou controle LUV solução, tendo uma leitura de fluorescência pelo menos uma vez por segundo. Definir o comprimento de onda de excitação a 280 nm, o comprimento de onda de emissão a 525 nm, ea temperatura a 25 ° C. Usando um Cary Eclipse Espectrofotômetro de Fluorescência, vamos definir a sensibilidade PMT para alta. </li></ol><html> 5. Gerando um Índice de Translocação Quantitative <ol><li> Definir a fluorescência inicial (F o) como a leitura de fluorescência após quinze segundos de coleta de dados. Em nossa configuração do instrumento, nós descobrimos que os primeiros quinze segundos de dados de fluorescência coletados não são confiáveis ​​devido à mistura, fechando a câmara de amostra, e outras perturbações do sistema após a adição da amostra. Divida cada leitura subseqüente por F o de obter fluorescência relativa (F / F 0) em cada momento. </li><li> Média de todas as leituras relativa de fluorescência de último minuto do experimento para obter uma média final de fluorescência relativa <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> . </li><li> Divida o <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> para amostras de controle pelos <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> para amostras experimentais para obter um valor final corrigido fluorescência. </li></ol>le &quot;&gt; 6. Resultados Representante A Figura 2 mostra os resultados deste ensaio para um peptídeo representante que mostraram translocação robusto. O sinal neste experimento (preto traço) mostra uma queda acentuada no FRET sinal ao longo do tempo. No entanto, é importante para controlar a potencial perda de sinal FRET devido à inibição de tripsina incompleta ou outros fatores não relacionados à capacidade de translocação. Para este fim, nós sempre também medir o FRET sinal entre peptídeos e luvs contendo tanto tripsina Bowman-Birk e inibidor de tripsina (cinza traço, Figura 2). Em nossas mãos, tem sido importante a realização desse controle para cada peptídeo cada vez que um experimento é executado. Isto permite-nos claramente correta para quaisquer alterações no sinal devido a eventuais diferenças entre preparações lipídicas vesícula ou ruído do instrumento, que pode ser significativa para os sinais relativamente fracos fluorescentes normalmente observadas nas concentrações. A importância do controle de expeexperiencia usando luvs contendo inibidor de tripsina é destacada pelos dados mostrados na Figura 3. Neste caso, o sinal peptídeo diminuíram um valor semelhante ao da Figura 2 na amostra experimental (traço preto). No entanto, a amostra de controle mostra uma queda mais rápida para esse peptídeo, por isso sua translocação líquida é menor. Ponto 5 do nosso protocolo descreve um método simples para quantificar a translocação deste experimento. Índices mais elevados são indicativos de translocação de peptídeos que translocar eficientemente; a razão para a translocação de peptídeos célula penetrante mostrado na Figura 2, é de 1,16, enquanto fracamente peptídeos translocação têm relações translocação mais próximo de 1. Em nossa experiência, o erro padrão de três experimentos independentes realizados com preparações diferentes vesícula está na faixa de 0,01 a 0,06. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática de translocation ensaio. LUV Experimental amostras (A) são dopados com fluorescentes PAPA dansyl (barras pretas) e contêm encapsulado tripsina (tesouras). Inibidor de tripsina (círculo vermelho) é usado para inibir tripsina fora do luvs. O luvs estão expostos a peptídeo (roxo). Peptídeo associação com LUV membranas produz um sinal FRET (verde), que diminui à medida que os peptídeos translocting encontro tripsina interna desinibida. Ambos tripsina e inibidor de tripsina são encapsulados no controle LUV amostras (B) para medir a diminuição do sinal FRET alheios a translocação. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> Figura 2. Dados representativos para um peptídeo de células-penetrante. Um representante translocação pepide antimicrobiana mostra uma queda significativa na FRET sinal em comparação com o seu controle. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> Figura3. Dados representativos destacando a importância do controle. Inibição incompleta da digestão tríptica de um peptídeo não-translocação leva a uma queda na FRET sinal ao longo do tempo, tanto experimental e controle LUV soluções. Porque a diferença entre o controle e traços experimentais é relativamente pequeno, o mutante é caracterizado como um peptídeo fracamente translocação.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo aqui apresentadas podem ser usados ​​para avaliar a mudança relativa na concentração de peptídeos dentro e fora de vesículas lipídicas. Estas mudanças estão relacionadas à capacidade de translocação. Este protocolo pode ser usado para identificar células-penetrante peptídeos com potencial como vetores de entrega de drogas. Como o interesse na célula-penetrantes peptídeos cresce, ela vai ser interessante ver como os métodos que medem diretamente o evento de translocação são desenvolvidas e utilizadas de forma...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PG </td><td> Lipídeos Avanti Polar </td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 01:18 dansyl PE </td><td> Lipídeos Avanti Polar </td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PC </td><td> Lipídeos Avanti Polar </td><td> 850457C </td></tr><tr><td> Tripsina suína </td><td> Sigma </td><td> T-0303 </td></tr><tr><td> Bowman-Birk tripsina / quimotripsina inibidor </td><td> Sigma </td><td> T-9777 </td></tr><tr><td> Mini-extrusora </td><td> Lipídeos Avanti Polar </td><td> 610000 </td></tr><tr><td> Molibdato de amônio (para) </td><td> Alfa Aesar </td><td> 10811 </td></tr><tr><td> L-ácido ascórbico </td><td> Sigma </td><td> A1417 </td></tr><tr><td> Peróxido de Hidrogênio, solução 30% </td><td> Mallinckrodt produtos químicos </td><td> 5240-05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-3375 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S-9625 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S-0751 </td></tr></tbody></table>

medição translocação peptide em grandes vesículas unilamelares

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Há um interesse ativo em peptídeos que atravessam facilmente as membranas celulares sem a ajuda de receptores de membrana celular 1. Muitos destes são referidos como célula-penetrantes peptídeos, que são frequentemente conhecida por seu potencial como vetores de entrega de drogas 1-3. Além disso, há interesse crescente em peptídeos antimicrobianos, que funcionam através da membrana não-lítica mecanismos de 4,5, particularmente aqueles que atravessam as membranas bacterianas sem causar lise celular e matar as células, interferindo com processos intracelulares 6,7. De fato, os autores têm apontado cada vez mais o relacionamento entre peptídeos célula-penetrantes e antimicrobianos 1,8. Um firme entendimento do processo de translocação da membrana e da relação entre estrutura de peptídeo e sua capacidade de translocar requer eficaz, reprodutível para ensaios de translocação. Diversos grupos têm proposto métodos para medir a translocação para unilamel grandeslar vesículas lipídicas (luvs) 9-13. Luvs servir como modelos úteis para as membranas celulares bacterianas e eucarióticas e são freqüentemente usados ​​em estudos de peptídeos fluorescentes 14,15. Aqui, descrevemos a nossa aplicação do primeiro método desenvolvido por Matsuzaki e colegas de trabalho a considerar peptídeos antimicrobianos, tais como magainin e II buforin 16,17. Além de fornecer o nosso protocolo para este método, apresentamos também uma abordagem simples para análise de dados que quantifica a capacidade de translocação com este ensaio. As vantagens deste ensaio translocação em relação aos outros é que ela tem o potencial para fornecer informações sobre a taxa de translocação de membrana e não requer a adição de uma etiqueta fluorescente, o que pode alterar as propriedades do peptídeo 18, a triptofano contendo peptídeos. Resumidamente, a capacidade de translocação em vesículas de lipídios é medido como uma função da Transferência de Energia Ressonância Foster (FRET) entre resíduos de triptofano nativas e dansyl fosfatidiletanolamina quando as proteínas estão associadas com a membrana externa LUV (Figura 1). Célula-penetrantes peptídeos são clivadas como eles encontram tripsina desinibida encapsulados com o luvs, levando a dissociação da membrana LUV e uma queda na FRET sinal. A queda na FRET sinal observado por um peptídeo translocação é significativamente maior do que a observada para o peptídeo mesmo quando o luvs contêm tanto tripsina e inibidor de tripsina, ou quando um peptídeo que não espontaneamente atravessar membranas lipídicas é exposto a tripsina contendo luvs. Esta mudança de fluorescência fornece uma quantificação direta de translocação de peptídeos ao longo do tempo.

Este protocolo de detalhes um método para a medida quantitativa da translocação de peptídeos em grandes vesículas lipídicas unilamelares. Este método também fornece informações sobre a taxa de translocação de membrana e pode ser usado para identificar peptídeos que de forma eficiente e espontânea cruz bicamadas lipídicas.

Medição Translocação Peptide em grandes vesículas Unilamelares

Existe um interesse ativo em peptídeos que atravessam prontamente as membranas celulares sem o auxílio de receptores de membrana celular1. Muitos destes são referidos ...

Para quantificar a translocação de peptídeos através de membranas de vesículas. Vesículas lipídicas marcadas com fluoróforo são geradas com tripsina encapsulada. Um inibidor de tripsina é adicionado para inibir a atividade de qualquer tripsina exógena, deixando a tripsina ativa no lúmen da vesícula.Somente quando peptídeos marcados com fluorescência são adicionados às vesículas, suas marcas fluorescentes atuam como doadores de fret e excitam as moléculas fluorescentes na vesícula. No entanto, quando as proteínas atravessam a membrana, são digeridas pela tripsina e o sinal de fret é perdido. A análise espectrométrica revela o grau de translocação do peptídeo, observado como uma diminuição do fret entre as vesículas e o peptídeo ao longo do tempo.A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos, incluindo outras técnicas de vesículas lipídicas e métodos para medir a entrada de peptídeos em células, é que ela fornece informações sobre a cinética da entrada na membrana, e não exige a adição de um marcador fluorescente aos peptídeos caso eles contenham um triptofano. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no projeto e engenharia de peptídeos ativos na m

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo discute o ensaio de vazamento de fluorescência para estudar as interações de peptídeos que penetram nas células com as membranas celulares usando imitadores de membrana celular - grandes vesículas unilamelares, ou LUVs, encapsuladas com um corante fluorescente e um atenuador.

Ensaio de vazamento de fluorescência para estudar a interação do peptídeo que penetra nas células com a membrana

O protocolo apresentado descreve a análise do transporte mediado por proteínas de membrana no nível do transportador único usando bicamadas lipídicas livres de solvente que abrangem os poros. Isso é alcançado pela criação de chips de matriz de nanoporos produzidos em massa, combinados com aquisição e análise de dados altamente paralelas, permitindo o estabelecimento futuro de telas efetoras de proteínas de membrana.

Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

Apresentamos uma técnica para micromanipulação sem contacto das vesículas, usando gradientes de íons cálcio localizadas. Microinjeção de uma solução de íons cálcio, nas proximidades de uma vesícula lipídica gigante, é utilizada para remodelar a membrana lipídica, resultando na produção de saliências de membrana tubular.

Remodelação de membrana das vesículas gigantes em resposta a gradientes de íons cálcio localizadas

Apresentamos aqui os protocolos para a criação de pequenas vesículas unilamelares à base de peptídeos capazes de crescimento. Para facilitar na produção do vesicobolhosas do peptide da membrana, estas vesículas são equipadas com um sistema da transcrição-Tradução e o plasmídeo da peptide-codificação.

Na síntese de Vesiculo de precursores de membrana peptídica para crescimento de vesículas autônomas

O objetivo do protocolo é medir de forma confiável as propriedades mecânicas da membrana de vesículas gigantes por aspiração micropipette.

Obtenção de vesículas híbridas unilamellares gigantes por eletroformação e medição de suas propriedades mecânicas pela aspiração micropipette

O ensaio de vazamento de fluorescência é um método simples que permite a investigação de interações peptídeo/membrana a fim de entender seu envolvimento em vários processos biológicos e, especialmente, a capacidade de peptídeos penetrantes de células para perturbar bicamadas de fósforo durante um processo de translocação celular direta.

Ensaio de vazamento fluorescente para investigar desestabilização da membrana por peptídeo penetrante de células

Este protocolo descreve uma abordagem de processamento de imagem baseada em iSCAT e rastreamento de partículas únicas que permite a investigação simultânea da massa molecular e o comportamento difuso de macromoléculas interagindo com membranas lipídicas. Instruções passo a passo para preparação da amostra, conversão em massa para contraste, aquisição de filmes e pós-processamento são fornecidas juntamente com direções para evitar possíveis armadilhas.

Rastreamento de partículas sensíveis à massa para caracterizar dinâmicas de macromolécula associadas à membrana

Este artigo apresenta um método para a preparação de vesículas unilamelares gigantes compostas (cGUVs) com uma estrutura vesícula em vesícula, com condutividade elétrica personalizada nas regiões interna, anular e externa. A eletroformação sintetiza GUVs simples, que são transformados em estomatócios e cGUVs por meio de choque osmótico, fornecendo um modelo valioso para estudar a biofísica de células nucleadas.

Síntese de Vesículas Unilamelares Gigantes Compostas: Um Modelo Biomimético de Células Nucleadas

Este artigo fornece uma descrição detalhada de como criar amostras para rastreamento de proteína única em bicamadas lipídicas suportadas por sólidos. Também explica um microscópio de fluorescência simples, com sensibilidade a molécula única e taxa de quadros rápida. Por fim, descrevemos o procedimento para extrair trajetórias de proteína única.

Rastreamento de proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência

Um protocolo experimental é apresentado para montar, estimular eletricamente e analisar bicamadas de interface de gotículas dopadas com gramicidina A. As relações estrutura-função lipídio-proteína são quantificadas medindo mudanças na área da membrana, fluxo iônico e condutância de canal único, e relacionando essas respostas a mudanças semelhantes à plasticidade na condução iônica em um modelo de membrana inspirado em sinapses elétricas.

Caracterização da Estrutura e Função da Membrana Lipídio-Proteína usando Bicamadas de Interface de Gotículas

Aprenda a quantificar a translocação de peptídeos em vesículas unilamelares grandes usando FRET e tripsina encapsulada. Este método permite analisar a cinética de entrada em membranas lipídicas.

Medição Translocação Peptide em grandes vesículas Unilamelares

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