Name: Avaliação de mutação somática em células B Ramos, após superexpressão ou Knockdown de genes específicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a avaliar mutação somática em células B Ramos usando superexpressão ou knockdown de genes específicos. Este método permite identificar novos fatores envolvidos na diversificação de anticorpos.

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O pMSCV-AID-I-Thy1.1 e pKat2 vetores foram um presente amável da DG Schatz eo pVSV-G, PRSV-Rev, e pMDLg / pRRE vetores foram um presente amável da BR Cullen.

1. Amostras de preparação e células <ol><li> Realizar uma preparação de médio porte de DNA (midiprep) da superexpressão ou shRNA contendo construções e as embalagens retroviral vector pKat2 ou os vetores embalagem lentiviral pVSV-G, pMDLg / pRRE e PRSV-Rev 25. Use 6 mg DNA para cada construção e ou mcg 4 de pKat2 (para infecções retrovirais) ou 1,5 mg de DNA para cada um dos pVSV-g, pMDLg / pRRE, e vetores PRSV-Rev embalagem (para infecções lentiviral). </li><li> Prepare BOSC 23 meios de comunicação. Para transfecção, use ambas as médias não emendada Dulbecco modificado Eagle (DMEM), bem como DMEM completo. Para fazer DMEM completo, adicionar 1% tampão HEPES, 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina (PGS), e 10% soro bovino recém-nascidos (NCS) para uma garrafa de DMEM. </li><li> Prepare Ramos mídia. Para a etapa de infecção, tornam completo RPMI-1640 (RPMI) pela adição de HEPES 1%, PGS 1% e 10% de soro fetal bovino (FBS) para uma garrafa de RPMI. Para a etapa única célula semeadura, make "condicionados" media crescendo células Ramos em RPMI completo para dois dias, girando as células para baixo a 400 X g por 4 minutos e filtrar o sobrenadante com um filtro de 0,2 m em um frasco estéril. À semelhança de outros meios de comunicação completa, media condicionado é armazenada a 4 ° C até serem necessárias. </li><li> Dividido 3 x 10 6 BOSC 23 células em um prato de 100 mm em 10 mL DMEM completo no dia anterior transfecção de modo que as células serão a 50-60% da confluência dias de transfecção. Faça uma placa de células para cada vetor você planeja transfecting. É importante que as células não foram mantidas em cultura por muito tempo; usar células passagem baixo número ou células recém-descongeladas tanto para transfecção e infecção passos para garantir uma boa infecção. </li><li> Incluem controles para suas experiências. Para transfections e infecções, criar um controle negativo (células não infectadas ou untransfected) e um controle positivo (vírus que expressa GFP e puromicina resistência gene). Para shRNA exper knock-downiments, infectar um poço com uma embaralhada ou controle shRNA irrelevante. </li></ol> 2. Transfecting BOSC 23 células <ol><li> Aquecer a garrafas de DMEM e DMEM sem alterações, completa a 37 ° C. </li><li> Remova a mídia da BOSC 23 células e substituir com 5 mL de DMEM completo. As células voltem ao a 37 ° C até o uso da incubadora no passo 2.6. </li><li> Aquecer a garrafa de FuGENE 6 em temperatura ambiente por 5 minutos e brevemente vortex (&lt;1 segundo). </li><li> Alíquota de 600 mL DMEM sem alterações, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Diluir 30 mL FuGENE 6 na 600 mL DMEM sem alterações, brevemente vortex (&lt;1 segundo), e depois deixe em temperatura ambiente por cinco minutos. Tenha o cuidado de pipetar diretamente na mídia. Não deixe que os 6 FuGENE tocar os lados do tubo. </li><li> Adicionar 6 mg construir e ou 4 mg pKat2 (infecções retrovirais) ou 1,5 mg cada um dos pMDLg, pVSV-G / pRRE e PRSV-Rev (infecções lentiviral) para o DMEM / 6 FuGENE mix, vortex bri efly (&lt;1 segundo), e depois deixe em temperatura ambiente por 25 minutos. </li><li> Adicione o DNA / DMEM / 6 FuGENE mix para o BOSC 23 células e retornar para a 37 ° C incubadora por 24 horas. </li><li> Após 24 horas, adicionar 5 mL DMEM completo para as células transfectadas e retornar para a 37 ° C incubadora por mais 24 horas. </li></ol> 3. Colheita partículas virais <ol><li> Colheita os 10 ml de mídia da transfectadas BOSC 23 células com uma seringa de 10 mL. </li><li> Anexar um 0,45 mM filtro para o final da seringa e do filtro da mídia em um tubo limpo de polipropileno de 15 mL. </li><li> Use a mídia viral imediatamente ou congelar como um alíquotas mL em 2 mL frascos criogênicos a -80 ° C. </li><li> Após a colheita os meios de comunicação viral, confirmam que a transfecção eficiente ocorreu nas células controle positivo por FACS. Isso também pode ser feito para todas as amostras se a construir contém quer um (GFP, por exemplo) ou um marcador fluorescente na superfície celular (por exemplo, Thy1). </li></ol>ESIGNAÇÃO "&gt; 4. Infectar células B <ol><li> ML de semente 2 de 2 x 10 5 células / mL Ramos células em RPMI completo em uma placa 6-bem 24 horas antes da infecção. Novamente, não se esqueça de usar células passagem baixo número ou células recentemente descongelada para garantir a boa infecção. </li><li> Se usar alíquotas de vírus congelados, descongele a mídia viral rapidamente a 37 ° C. </li><li> Misture 1 mL de mídia viral com 3 mL de 10 polibrene mg / mL. A concentração final de polibrene deverá ser de 10 mcg / mL em um volume total de 3 mL. </li><li> Adicione a mistura de vírus / polibrene para as células e misture bem por pipetagem. Como mencionado anteriormente, um bem deve ser usado como um controle não infectados; adicionar 1 mL RPMI completo e 3 mL polibrene a este bem, em vez de vírus de 1 mL. Certifique-se de infectar um bem com um controle pareado negativo. Nós também infectar um bem com um vetor contendo GFP, para determinar a eficiência de infecção por FACS. </li><li> Centrifugar a placa de 6 poços em 3000 X g por 90 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Devolver a placa paraa 37 ° C incubadora por 48 horas. </li><li> Após 48 horas, girar as células infectadas em um tubo de polipropileno de 15 mL a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente. Remova a mídia por aspiração, certificando-se de não perturbar o pellet celular. Ressuspender as células em RPMI fresco. </li><li> Confirmar a eficiência de infecção na amostra de controlo positivo por FACS. Como antes, você pode fazer isso para todas as suas amostras, se a construção contém quer um (GFP, por exemplo) ou um marcador fluorescente na superfície celular (por exemplo, Thy1). </li><li> Iniciar seleção de células (se for o caso). Nosso shRNA contendo construções contêm um cassete de resistência puromicina. Nós selecionamos as células infectadas shRNA Ramos com 0,25 mcg / mL puromicina. Nós encontramos que os derivados de células Ramos, por vezes mostram alterações suscetibilidade a puromicina e, portanto, realizamos matar curvas para otimizar a concentração de puromicina para cada derivado. Também tratar células controle não infectadas com puromicina para confirmar que a seleção é eficaz. </li></ol> &lt;class = p "jove_title"&gt; 5. Semeadura única célula Semeadura só pode ser realizada de duas maneiras: por FACS classificação ou manualmente. <ol><li> FACS: Use um classificador FACS com um adaptador de placa para celular sementes 1 / bem em uma placa de 96 poços pré-cheia com 100 mL de 40% RPMI/40% condicionado media/20% FBS. Este método dá um monte de clones celulares mais simples por placa. </li><li> Manualmente: Contagem das células. Diluir uma alíquota de células a 10 células / mL em 40% RPMI/40% condicionado media/20% FBS. Use 10 mL de células diluída para cada placa semeada. Diferentes clones irá mostrar recuperação variável nesta fase, portanto, é útil a criação de várias chapas em diferentes concentrações (variando de 3 a 20 células / mL). Use aquele que produz conseqüências menos para evitar clones resultantes de várias células). Use uma pipeta multicanal para sementes de placas de 96 poços com 100 mL de células diluída. </li><li> Coloque a placa em uma incubadora de 37 ° C por 2 semanas. </li><li> Verificação individual poços under ao microscópio para confirmar a presença de células um dia após a semeadura. Células individuais podem ser difíceis de encontrar devido à necessidade de se concentrar na profundidade correta. Focalizando os números bem impresso na parte inferior da placa de 96 poços deve ajudar. Células são mais fáceis de encontrar quando semeado pela classificador FACS pois a maioria dos poços tem uma célula. </li><li> Após 2 semanas, colônias de crescimento pode ser mal visto pelo olho nu, olhando para as placas de baixo. Eles são muito mais fáceis de ver sob o microscópio. Colônias tendem a crescer ao longo das bordas das colônias mais bem e normalmente em uma placa de crescer ao longo da mesma borda em poços diferentes. Mark poços com crescimento celular robusta e transferência das células para placas de 24 poços em 1 mL RPMI e retornar para a 37 ° C incubadora. </li><li> Manter as células em 1 x 10 5 a 1 x 10 6 células / mL. Troque a mídia girando as células a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente e remover a mídia, conforme necessário. Substituir com 1 mL RPMI fresco. </li><li> Depois de várias days de crescimento, a transferência das células para uma placa de 6 poços e continuar crescendo em um 37 ° C incubadora. </li><li> Após 3 semanas, analisar os clones para a perda de IgM (como descrito abaixo). </li><li> Continuar a crescer as células para mais 2 semanas e depois analisar os clones novamente no ponto de tempo de 5 semanas. </li></ol> 6. Análise: a perda de IgM (3 semanas e 5 semanas) <ol><li> Alíquota de 5 x 10 5 células de cada poço em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e girar as células para baixo em 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente. Utilização de células de cada um dos e controle de shRNA-knock-down poços, bem como uma amostra para um controle sem mácula. </li><li> Lave as células em 1 ml de PBS e depois girar novamente a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender em 50 mL de PBS (controle sem mácula) ou PBS + diluição 1:20 da PE-anticorpo marcado IgM α-humano. Incubar no gelo por 1 hora. </li><li> Spin the células para baixo a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Lavar os cells duas vezes com 1 mL de PBS e girar para 400 X g por 4 minutos cada vez que a temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender em 100 mL de PBS. Transferência de células ressuspenso manchado a um tubo FACS. </li><li> Analisar as células usando uma máquina FACS. </li><li> Compare o percentual de IgM - células dos controles contra o shRNA knocked-down células. Como observado anteriormente, a perda de IgM medida pelo FACS é uma medida semi-quantitativa confiável de SHM em células Ramos. </li></ol> 7. Análise: Confirmar knock-down por RT-PCR quantitativa (5 semanas) <ol><li> Alíquota de 3 x 10 6 células de cada poço e spin down a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Prepare RNA a partir da alíquota de células. Usamos TRIzol de acordo com recomendações do fabricante. </li><li> Prepare cDNA a partir do RNA prep. Nós usamos 2 mg RNA e Sobrescrito II de acordo com recomendações do fabricante. </li><li> Realizar uma PCR quantitativa usando o cDNA para confirmaçãom knock-down. Usamos GAPDH como controle, normalização e do kit SYBR qPCR FAST em um volume de 10 L de reação total. </li></ol> 8. Análise: o seqüenciamento genômico (5 semanas) <ol><li> Alíquota de 5 x 10 6 células de cada poço e spin down a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Isolar DNA genômico a partir dessas células. Nós usamos o Assistente de genômica SV kit de purificação de DNA de acordo com recomendações do fabricante. </li><li> PCR amplificar o DNA genômico para os genes Ig V 19 (Tabela 1) e quaisquer outros genes de interesse usando o KAPA DNA polimerase HiFi. Usamos essa polimerase por causa de sua baixa taxa de erros, mas qualquer de alta fidelidade da polimerase PCR deve ser aceitável. </li><li> Gel purificar a produtos de PCR em um gel de agarose 1% utilizando o kit de extração QIAquick gel. </li><li> Alguns polimerases adicionar um único resíduo de (A) desoxiadenosina para termina o 3 'dos ​​produtos de PCR, enquanto outros não. Estes 3 'A cauda são necessários para o TOPO TAetapa de clonagem. O KAPA polimerase HiFi não deixa três 'A cauda. A cauda dos produtos PCR por incubação de 25 mL de gel-purificada produto de PCR com 3 tampão de reação 10x Taq mL, 1 mL 10 mM dNTPs, e uma unidade de Taq polimerase a 72 ° C por 30 minutos. </li><li> Clone os produtos gel de PCR purificados usando o kit TOPO TA Cloning. Transformar os produtos da reação para o TOPO E. desde coli DH5α-T1 R células competentes e placa de LB / ágar placas contendo 100 mg / mL ampicilina e suplementado com 1,6 mg de X-gal de acordo com recomendações do fabricante. </li><li> Enviar colônias individuais para o seqüenciamento. </li><li> Realizar análises para determinar a seqüência de tipos e locais de mutações. </li></ol> 9. Resultados representativos: Como observado anteriormente, usamos um vetor viral de controle positivo que expressa tanto GFP, bem como um gene puromicina-resistência. Se costuma ver 50-75% de células GFP + dois diasapós transfecção. Em nossa infecções, nós tipicamente ver as células 50-70% são GFP + dois dias após a infecção, mas antes da seleção. Após a seleção estiver completa,&gt; 95% das células são + GFP. Como experimentos representante, vamos mostrar os efeitos da superexpressão de AID ou derrubar um fator de reparo em células Ramos. Especificamente, nós transfectadas um vetor retroviral para superexpressão AID ligados através de um sítio para IRES Thy1.1 juntamente com o vetor retroviral embalagem pKat2 BOSC em 23 células. Vírus contendo-media foi filtrado e então usado para infectar as células Ramos. Ambos tipo selvagem (WT) e superexpressão AID (AID oi) células foram semeadas única célula e cresceu durante 3 semanas, altura em que eles foram analisadas para expressão gênica por qRT-PCR (Figura 2) e para a perda de IgM por FACS (Figura 3 ). Para a coloração FACS, as células foram incubadas com tanto diluída 1:20 PE-rotulados α-humano de anticorpos IgM, assim como 1:400 diluídos FITC marcado CD90/mouse α rat-CD90.1 (Thy1.1) de anticorpos. Em um experimento separado, contendo um ou outro um lentivírus shRNA irrelevantes (controle) ou um shRNA contra um fator de reparo de alta fidelidade DNA esperado para proteger contra SHM foram feitas em BOSC 23 células, e depois infectados em um clone de células AID oi Ramos. Mais uma vez, a expressão do gene (Figura 4) e perda de IgM (Figura 5) foram analisados ​​em clones única célula depois de 3 semanas. Desde que o fator de reparação é pensada para fornecer proteção contra mutações durante SHM, vemos um aumento na perda de IgM e SHM na ausência do fator. Se tivéssemos knocked-down um fator envolvido na geração de SHM mutações associadas, teríamos visto uma diminuição na perda de IgM em seu lugar. Como esperado, a nossa qRT-PCR resultados mostram um aumento significativo na expressão AID após a infecção de células com um vetor de superexpressão AID (Figura 2), enquanto os níveis do fator de queda de reparo de DNA na presença de um shRNA dirigidas contra esse fator (Figura 4 ). Porque clon individuaises podem variar, você poderá ver alguma variação nos níveis de expressão do gene. Porque a expressão do gene pode variar, é necessário para confirmar a expressão em cada clone você está pensando em analisar mais. ShRNAs diferentes contra o mesmo gene pode ter efeitos diferentes sobre a expressão gênica, bem, então você deve tela shRNAs vários para determinar qual tem o maior impacto. Knockdown também pode ser confirmado a nível de proteínas por immunoblotting. Da mesma forma, clones individuais podem variar muito em níveis de perda de IgM. Alguns clones poderiam demonstrar um "jackpot" efeito, onde uma mutação IgM ocorreu em uma das divisões celulares mais antigos - por exemplo, você verá&gt; perda de IgM 50%, simplesmente porque uma das células ficou IgM - no estágio de duas células. A influência desses clones é minimizada pelo cálculo da mediana para vários clones única célula. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig1.jpg"> Figura 1. Esquema de transinfecção perfeição, e análise de perda de IgM. Veja o texto para mais detalhes. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig2.jpg"> Figura superexpressão AID 2. Células em Ramos. WT e células AID oi Ramos foram clonados e única célula cultivada por três semanas, em que a expressão ponto AID em clones individuais foi medida por qRT-PCR. Expressão GAPDH foi utilizado para a normalização. WT foi definido como 1. O valor médio é indicado. * Indica valor de p = &lt;0,01, calculado como um estudante uni-caudal t-teste. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig3.jpg"> Figura 3. Aumento da perda de IgM em células oi AID, em comparação com as células WT. IgM de superfície foi medida por FACS no ponto de tempo três semanas, ea porcentagem de perda de IgM foi calculado para WT e células oi AID. (A) Representante FACS enredo de um clone WT e um clone AID oi. A AID superexpressão vector tem AID ligados à Thy1.1 através de um site IRES, assim Thy1.1 expressão é usada como um substituto para a expressão AID. (B) A determinação quantitativa da perda de IgM em WT e vários clones AID oi. O valor médio é indicado. * Indica valor de p = &lt;0,01, calculado como um estudante uni-caudal t-teste. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig4.jpg"> Figura 4. Knockdown de um fator de reparo em células oi AID. Células foram infectadas com a shRNA um controle irrelevante (controle) ou o nosso shRNA de interesse (shRNA), e única célula semeado. Após 3 semanas, expressão gênica em clones individuais foi medida por qRT-PCR. Expressão GAPDH foi utilizado para a normalização. WT foi definido como 1. O valor médio é indicado. * Indica valor de p = &lt;0,01, calculado como um estudante uni-caudal t-teste. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig5.jpg"> Figura 5. IgM perda Maiorem células AID oi com níveis knocked-down de um fator de reparo. IgM de superfície em vários clones foi medido por FACS no ponto de tempo três semanas, ea porcentagem de perda de IgM foi calculado em células AID superexpressão ainda. O valor médio é indicado. * Indica valor de p = &lt;0,01, calculado como um estudante uni-caudal t-teste. <img src="/files/ftp_upload/3573/3573table1.jpg" alt="Tabela 1"> Seqüências tabela 1 Primer para a genes de Ig 19:. Cμ a região constante, a cadeia pesada região V (V H), ea luz da cadeia região V (V L).

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<li>Sale, J. E., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li>
<li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li>
<li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li>
<li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt%27s+lymphoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li>
<li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a%3AT+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li>
<li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li>
<li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+class+switching+of+an+IgM%2B+B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li>
<li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+%28AID%29%2C+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Como discutido anteriormente, os modelos de celular da linha de diversificação de anticorpos se tornaram um popular ponto de partida para identificar novas proteínas que influenciam diferentes etapas durante a diversificação de anticorpos. Apresentamos aqui um método para usar infecção viral às proteínas ou knock-down ou superexpressam na linha de Ramos de células B e em seguida, examinar o impacto sobre a SHM. Para esses estudos, utilizamos tanto WT Ramos e células AID oi Ramos. ...

Reagentes sugerido - a maioria destes pode ser substituído por produtos similares de outros fornecedores. <table border="1" ><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th > Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td > 6-bem claro TC tratados com placas </td><td > Corning </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 mL BD Luer-Loksyringes </td><td > BD Medical </td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24 bem claro TC tratados com placas </td><td > Corning </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > De 96 poços de poliestireno com fundo transparente plana TC-tratados microplacas </td><td > Corning </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100 milímetros TC tratados com placas de cultura </td><td > Corning </td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td > Filtros de seringa Acrodisc, 0,45 mM </td><td > Pall Life Sciences </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > Agar </td><td > Teknova </td><td > A7777 </td&gt; <td ></td></tr><tr><td > Agarose </td><td > GeneMate </td><td> E-3120-500 </td><td ></td></tr><tr><td > Ampicilina </td><td> Sigma </td><td > A0166 </td><td> 100 mg / mL em água </td></tr><tr><td > BD FACSCanto citômetro de fluxo II </td><td> BD Biosciences </td><td ></td><td > ou similar </td></tr><tr><td> BD Falcon poliestireno rodada tubos de fundo </td><td> BD Biosciences </td><td > 352054 </td><td > para FACS </td></tr><tr><td > BOSC 23 células </td><td > ATCC </td><td > CRL-11270 </td><td ></td></tr><tr><td > Incubadora de CO 2 capazes de 37 ° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (meio modificado Dulbecco Eagle) </td><td > Sigma </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (soro fetal bovino) </td><td > Gémeos Bio-Products </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α-rato CD90/mouse CD90.1 anticorpos </td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα-Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE Reagente Transfection 6 </td><td > Roche </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > Solução tampão HEPES </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPA DNA polimerase HiFi </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB caldo (caldo lisogenia - Luria) Pó </td><td > Difco </td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MISSÃO TRC shRNA estoque glicerol bacteriana </td><td > Sigma </td><td ></td><td> vetores shRNA </td></tr><tr><td > NCS (recém-nascido soro bovino) </td><td > Gémeos Bio-Products </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (solução tampão fosfato) </td><td > Invitrogen </td><td> 70011 </td><td > diluída em água para 1x </td></tr><tr><td > PE α-humano de anticorpos IgM </td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (penicilina-estreptomicina-glutamina solução) </td><td > Gémeos Bio-Produtos </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polibrene (Hexadimetrina brometo) </td><td > Sigma </td><td > 107689 </td><td > 10 mg / mL em água </td></tr><tr><td > PureYield Sistema Midiprep Plasmid </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma </td><td > P8833 </td><td > 250 mcg / mL em água </td></tr><tr><td > QIAquick extração de gel kit </td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td> Ramos (RA 1) células </td><td > ATCC </td><td > CRL-1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI-1640 médio </td><td > Sigma </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > SuperScript II </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR RÁPIDO qPCR kit </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq DNA polimerase </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TA Cloning kit </td><td > Invitrogen </td><td > K4520-01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > Assistente de Genomic SV sistema de purificação de DNA </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X-Gal [5-bromo-4-cloro-3-β-indoyl-D-galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C-5687 </td><td > 40 mg / mL em DMSO </td></tr></tbody></table>

avaliação de mutação somática em células b ramos, após superexpressão ou knockdown de genes específicos

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Células B começam sua vida com os anticorpos de baixa afinidade gerada pela recombinação V (D) J. No entanto, após a detecção de um patógeno, a variável região (V) de um gene de imunoglobulina (Ig) é mutante aproximadamente 100.000 vezes mais do que o resto do genoma através hipermutação somática (SHM), resultando em alta de 1,2 anticorpos de afinidade. Além disso, a recombinação classe switch (CSR) produz anticorpos com diferentes funções efetoras, dependendo do tipo de resposta imune que é necessário para um determinado patógeno. Ambos RSE e SHM são iniciadas pela ativação induzida citidina desaminase (AID), que deaminatos resíduos citosina no DNA para produzir uracils. Estes uracils são processados ​​por formas propenso a erros de vias de reparo, acabou levando a mutações e recombinação 1-3. Nossa compreensão atual dos detalhes moleculares da SHM ea RSE vêm de uma combinação de estudos em camundongos, células primárias, linhas de células, e células-fexperimentos ree. Modelos de ratos permanecem o padrão-ouro com nocautes genética mostrando papéis críticos para reparar muitos fatores (por exemplo, Ung, MSH2, MSH6, Exo1 e polimerase η) 4-10. No entanto, nem todos os genes são passíveis de estudos nocaute. Por exemplo, nocautes de várias cadeias duplas proteínas de reparo estão embrionariamente quebrar letal ou prejudicar o desenvolvimento das células B 11-14. Além disso, por vezes, a função específica de uma proteína em SHM ou CSR pode ser mascarada por mais defeitos global causado pelo nocaute. Além disso, desde experimentos em camundongos pode ser demorado, alterando a expressão de genes individuais em linhas de celular tornou-se um passo cada vez mais popular primeiro a identificar e caracterizar genes candidatos 15-18. Ramos - uma linha de células de linfoma de Burkitt que constitutivamente sofre SHM - tem sido um modelo de celular da linha popular de estudo SHM 18-24. Uma vantagem das células Ramos é que eles têm uma semi built-in conveniente-Quantitativa medida da SHM. Células de tipo selvagem expressar IgM e, como eles peguem mutações, algumas das mutações knock out expressão IgM. Portanto, dosagem de perda de IgM por fluorescência-ativado de varredura de células (FACS) fornece uma rápida leitura para fora para o nível de SHM. A medida mais quantitativa da SHM pode ser obtida diretamente seqüenciamento dos genes dos anticorpos. Como as células Ramos são difíceis de transfecção, que produzem derivados estáveis ​​que têm aumentado ou abaixado expressão de um gene individual por infectar as células com construções retroviral ou lentiviral que contêm um cassete de superexpressão ou um curto hairpin RNA (shRNA), respectivamente. Aqui, descrevemos como nos infectar as células Ramos e depois usar essas células para investigar o papel de genes específicos em SHM (Figura 1).

Descrevemos como executar infecções retrovirais ou lentiviral de superexpressão ou shRNA contendo constrói no ser humano Ramos linhagem de células-B e como medida de mutação somática nestas células.

Avaliação de mutação somática em células B Ramos, após superexpressão ou Knockdown de genes específicos

As células B iniciam a sua vida com anticorpos de baixa afinidade gerados por recombinação V(D)J. No entanto, ao detetar um patógeno, a região variável (V) de um...

O objetivo geral do seguinte experimento é alterar a expressão de um gene e, em seguida, medir seu impacto na hipermutação somática. Isso é alcançado por meio da transfeção de células Bosque 23 para produzir partículas virais contendo um construto de superexpressão ou um contendo SHRA. Como segundo passo, células ramo são infectadas com os vírus, resultando na redução ou superexpressão do gene de interesse.Em seguida, os clones de célula única são cultivados por várias semanas para permitir que as células acumulem mutações. Por fim, o efeito da expressão gênica alterada pode ser determinado com base na análise da perda de IgM e no sequenciamento dos genes IG. Este método poderia ajudar a identificar novos fatores envolvidos na diversificação de anticorpos.Inicie elo, pipetando 600 microlitros de DMEM suplementado morno em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, tomando cuidado para pipetar diretamente no meio, adicione 30 microlitros de FU gene seis ao tubo, vorte o conteúdo por menos de um segundo e, então, incube o tubo em temperatura ambiente por cinco minutos. A seguir, para infecção lentiviral como esta, adicione seis microgramas do construto S-H-R-N-A e 1,5 micrograma de cada um de P-V-S-V-G-P-M-D-L-G-P-R-R-E e PRSV rev à mistura de DMEM com FU gene seis.Vortexie brevemente a solução e, em seguida, incube as duas gotas à temperatura ambiente novamente, desta vez por 25 minutos. Por fim, transfete uma cultura de células Bosque 23 com 50 a 60% de confluência com o gene D-N-A-D-M-E-M FU seis. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas.No dia seguinte, adicione cinco mililitros de DMEM às células e retorne-as ao incubador por mais 24 horas. No terceiro dia após a transfeção, use uma seringa de 10 mililitros para coletar 10 mililitros de meio das células transfectadas da caixa 23 e, em seguida, acople um filtro de 0,45 micrômetro à extremidade da seringa. Colete o meio filtrado em um tubo de polipropileno limpo de 15 mililitros. 24 horas antes da infecção, semeie dois mililitros de duas vezes 10 à quinta potência de células ramo por mililitro em RPMI completo em uma placa de seis poços. No dia seguinte, adicione três microlitros de uma solução de polibrena a 10 microgramas por mililitro e um mililitro de vírus às células ramo, e misture bem a suspensão celular por pipetagem.Para o controle não infectado, adicione um mililitro de RPMI completo e três microlitros de poli cérebro a um dos poços em vez do vírus. Além disso, infecte um poço com um controle negativo pareado e outro com um vetor contendo GFP para determinar a eficiência de infecção por fax. Agora, centrifugue a placa de seis poços a 3000 ×g durante 90 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, retorne a placa ao incubador por 48 horas.Por fim, centrifugue as células infectadas em um tubo de polipropileno de 15 mililitros a 400 Gs durante quatro minutos. À temperatura ambiente, aspire o meio, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular, e ressuspenda as células em RPMI fresco. Após a contagem das células, ajuste uma alíquota das células infectadas a 10 células por mililitro.Em uma solução de meio condicionado RPMI e FBS até um volume final de 10 mililitros para cada placa semada. Em seguida, utilize uma pipeta multicanal para semear placas de 96 poços com 100 microlitros por poço das células diluídas.Após incubar as placas por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, utilize um microscópio para verificar cada poço individualmente. Para confirmar a presença de células, pois a profundidade adequada para identificar células isoladas pode ser difícil de determinar. Primeiro, tente focar nos números dos poços gravados na parte inferior da placa de 96 poços.Em seguida, tente procurar uma célula após duas semanas. Verifique a presença de colônias celulares ao longo das bordas das cavidades usando tinta permanente. Marque as cavidades com crescimento celular robusto e, em seguida, transfira as colônias para placas de 24 poços com um mililitro de RPMI para incubação adicional.Após vários dias de crescimento, transfira as células para uma placa de seis poços e continue a incubação das culturas. Três semanas após o semeio das colônias celulares na placa de seis poços Eloqua, colete cinco vezes 10 à quinta células de cada poço em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Neste momento, também colete as células de cada um dos poços controle e com silenciamento de HRNA, bem como uma amostra para um controle não corado.Agora, centrifugue todas as células a 400 Gs por quatro minutos à temperatura ambiente, lavando as células duas vezes com um mililitro de PBS na segunda centrifugação. Após a segunda lavagem, suspendemos o pellet não corado em 50 microlitros de PBS e os demais pellets em PBS mais uma diluição de 1 para 20 do anticorpo anti-IgM humano marcado com PE. Em seguida, incube todas as amostras celulares no gelo por uma hora após lavar as células mais duas vezes com PBS como antes, descarte o sobrenadante e re-suspenda todos os pellets em 100 microlitros de PBS.Em seguida, transfira as células coradas e as células-controle não coradas, ressuspendidas, para tubos FACS e analise as células por citometria de fluxo. Compare a porcentagem de células negativas para IgM dos controles com a das células com silenciamento de S-H-R-N-A. Um vetor de superexpressão retroviral para um ID foi transfectado em células Bosque 23.Os vírus foram então colhidos e usados para infectar células Ramos, tanto do tipo selvagem (wt) quanto com superexpressão de a ID. Células a ID.High foram semeadas como célula única e cultivadas por três semanas, momento em que foram analisadas quanto à expressão gênica por RT-qPCR. Conforme esperado, os resultados do RT-qPCR mostram um aumento acentuado na expressão de a ID após infecção das células com um vetor de superexpressão de a ID. A perda de IgM nas células infectadas também foi avaliada por citometria de fluxo. A IgM de superfície foi medida por citometria de fluxo a partir da figura anterior no ponto temporal de três semanas, e a porcentagem de perda de IgM foi calculada para células do tipo selvagem e células com alta expressão de a ID, sendo representada graficamente aqui. Conforme esperado, células que superexpressam a ID exibiram uma perda maior de IgM de superfície.Em um experimento separado, lentivírus contendo ou um S-H-R-N-A irrelevante como controle ou um S-H-R-N-A contra um fator de reparo de DNA de alta fidelidade, esperado para proteger contra a MHM, foram produzidos em células bosque 23. Os lentivírus foram então infectados em um clone a ID alto de células Ramos. Novamente, a expressão gênica foi analisada e, mais uma vez, como esperado, observou-se queda nos níveis do fator de reparo de DNA na presença de um S-H-R-N-A direcionado contra esse fator. A perda de IGM em clones de célula única também foi analisada após três semanas, já que acredita-se que o fator forneça proteção contra mutações durante a MHM, ocorrendo um aumento na perda de IGM e na MHM na ausência do fator, como pode ser observado nesta figura.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar infecções virais com construtos que contenham OVEREXPRESSION ou S-H-R-N-A na linhagem celular de linfócitos B da linhagem RAW, e, em seguida, como medir a hipermutação somática nessas células.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós fornecemos um método para testar variantes BRCA1 em um ensaio de cultura de tecidos com base homóloga de reparação de danos no DNA de recombinação, esgotando proteína BRCA1 endógenos de uma célula usando RNAi e substituindo-o por um mutante ponto BRCA1 que contém uma mudança de codificação.

Identificar os efeitos das mutações BRCA1 em Recombinação Homóloga usando células que expressam BRCA1 tipo selvagem endógena

Descrevemos aqui um ensaio in vivo de mutagénese para pequenos números de células hematopoiéticas purificados utilizando o modelo de ratinho transgénico Lacl. O gene LacI pode ser isolado para determinar a frequência, a localização eo tipo de mutantes de DNA espontaneamente surgido ou após a exposição ao genotoxinas.

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Fatores epigenéticos podem interagir com programas genéticos para modular a expressão gênica e regulam a função de células B. Combinando a estimulação de vitro em células B, qRT-PCR e elevado-throughput do microRNA-sequência e abordagens de RNAm-sequência, podemos analisar a epigenética modulação da expressão de gene e miRNA em células B.

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Detecção de ácido ribonucleico (cRNA) do sangue que circula é uma necessidade insatisfeita em diagnósticos clínicos. Aqui descrevemos os métodos que caracterizam cRNA de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células usando a reação em cadeia da polimerase digital sensível e específico. Os testes de requisitos de projeto para detectar variantes de fusão dentro de 72 horas.

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Aqui, descrevemos um em situ ensaio de hibridização que permite detecção sensível e específica de sequências tão curtas quanto 50 nucleótidos com single-nucleotide resolução a nível de célula única. O ensaio, que pode ser executado manualmente ou automaticamente, pode habilitar a visualização de variantes da tala, sequências curtas e mutações dentro do contexto de tecido.

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Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para identificar os eventos de recombinação homóloga que ocorreram em células-tronco embrionárias do mouse usando a mancha do Sul e/ou PCR. Este método é exemplificado pela geração de nonmuscle myosin II substituição genética rato modelos usando embrionária baseada em células-tronco homóloga mediada por recombinação segmentação tecnologia tradicional.

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PCR de bloqueio de tipo selvagem combinado com sequenciamento de Sanger para detecção de mutação somática de baixa frequência

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Aprenda a avaliar mutação somática em células B Ramos usando superexpressão ou knockdown de genes específicos. Este método permite identificar novos fatores envolvidos na diversificação de anticorpos.

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