Avaliação de mutação somática em células B Ramos, após superexpressão ou Knockdown de genes específicos

O objetivo geral do seguinte experimento é alterar a expressão de um gene e, em seguida, medir seu impacto na hipermutação somática. Isso é alcançado por meio da transfeção de células Bosque 23 para produzir partículas virais contendo um construto de superexpressão ou um contendo SHRA. Como segundo passo, células ramo são infectadas com os vírus, resultando na redução ou superexpressão do gene de interesse.

Em seguida, os clones de célula única são cultivados por várias semanas para permitir que as células acumulem mutações. Por fim, o efeito da expressão gênica alterada pode ser determinado com base na análise da perda de IgM e no sequenciamento dos genes IG. Este método poderia ajudar a identificar novos fatores envolvidos na diversificação de anticorpos.

Inicie elo, pipetando 600 microlitros de DMEM suplementado morno em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, tomando cuidado para pipetar diretamente no meio, adicione 30 microlitros de FU gene seis ao tubo, vorte o conteúdo por menos de um segundo e, então, incube o tubo em temperatura ambiente por cinco minutos. A seguir, para infecção lentiviral como esta, adicione seis microgramas do construto S-H-R-N-A e 1,5 micrograma de cada um de P-V-S-V-G-P-M-D-L-G-P-R-R-E e PRSV rev à mistura de DMEM com FU gene seis.

Vortexie brevemente a solução e, em seguida, incube as duas gotas à temperatura ambiente novamente, desta vez por 25 minutos. Por fim, transfete uma cultura de células Bosque 23 com 50 a 60% de confluência com o gene D-N-A-D-M-E-M FU seis. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas.

No dia seguinte, adicione cinco mililitros de DMEM às células e retorne-as ao incubador por mais 24 horas. No terceiro dia após a transfeção, use uma seringa de 10 mililitros para coletar 10 mililitros de meio das células transfectadas da caixa 23 e, em seguida, acople um filtro de 0,45 micrômetro à extremidade da seringa. Colete o meio filtrado em um tubo de polipropileno limpo de 15 mililitros. 24 horas antes da infecção, semeie dois mililitros de duas vezes 10 à quinta potência de células ramo por mililitro em RPMI completo em uma placa de seis poços. No dia seguinte, adicione três microlitros de uma solução de polibrena a 10 microgramas por mililitro e um mililitro de vírus às células ramo, e misture bem a suspensão celular por pipetagem.

Para o controle não infectado, adicione um mililitro de RPMI completo e três microlitros de poli cérebro a um dos poços em vez do vírus. Além disso, infecte um poço com um controle negativo pareado e outro com um vetor contendo GFP para determinar a eficiência de infecção por fax. Agora, centrifugue a placa de seis poços a 3000 ×g durante 90 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, retorne a placa ao incubador por 48 horas.

Por fim, centrifugue as células infectadas em um tubo de polipropileno de 15 mililitros a 400 Gs durante quatro minutos. À temperatura ambiente, aspire o meio, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular, e ressuspenda as células em RPMI fresco. Após a contagem das células, ajuste uma alíquota das células infectadas a 10 células por mililitro.

Em uma solução de meio condicionado RPMI e FBS até um volume final de 10 mililitros para cada placa semada. Em seguida, utilize uma pipeta multicanal para semear placas de 96 poços com 100 microlitros por poço das células diluídas.

Após incubar as placas por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, utilize um microscópio para verificar cada poço individualmente. Para confirmar a presença de células, pois a profundidade adequada para identificar células isoladas pode ser difícil de determinar. Primeiro, tente focar nos números dos poços gravados na parte inferior da placa de 96 poços.

Em seguida, tente procurar uma célula após duas semanas. Verifique a presença de colônias celulares ao longo das bordas das cavidades usando tinta permanente. Marque as cavidades com crescimento celular robusto e, em seguida, transfira as colônias para placas de 24 poços com um mililitro de RPMI para incubação adicional.

Após vários dias de crescimento, transfira as células para uma placa de seis poços e continue a incubação das culturas. Três semanas após o semeio das colônias celulares na placa de seis poços Eloqua, colete cinco vezes 10 à quinta células de cada poço em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Neste momento, também colete as células de cada um dos poços controle e com silenciamento de HRNA, bem como uma amostra para um controle não corado.

Agora, centrifugue todas as células a 400 Gs por quatro minutos à temperatura ambiente, lavando as células duas vezes com um mililitro de PBS na segunda centrifugação. Após a segunda lavagem, suspendemos o pellet não corado em 50 microlitros de PBS e os demais pellets em PBS mais uma diluição de 1 para 20 do anticorpo anti-IgM humano marcado com PE. Em seguida, incube todas as amostras celulares no gelo por uma hora após lavar as células mais duas vezes com PBS como antes, descarte o sobrenadante e re-suspenda todos os pellets em 100 microlitros de PBS.

Em seguida, transfira as células coradas e as células-controle não coradas, ressuspendidas, para tubos FACS e analise as células por citometria de fluxo. Compare a porcentagem de células negativas para IgM dos controles com a das células com silenciamento de S-H-R-N-A. Um vetor de superexpressão retroviral para um ID foi transfectado em células Bosque 23.

Os vírus foram então colhidos e usados para infectar células Ramos, tanto do tipo selvagem (wt) quanto com superexpressão de a ID. Células a ID.High foram semeadas como célula única e cultivadas por três semanas, momento em que foram analisadas quanto à expressão gênica por RT-qPCR. Conforme esperado, os resultados do RT-qPCR mostram um aumento acentuado na expressão de a ID após infecção das células com um vetor de superexpressão de a ID. A perda de IgM nas células infectadas também foi avaliada por citometria de fluxo. A IgM de superfície foi medida por citometria de fluxo a partir da figura anterior no ponto temporal de três semanas, e a porcentagem de perda de IgM foi calculada para células do tipo selvagem e células com alta expressão de a ID, sendo representada graficamente aqui. Conforme esperado, células que superexpressam a ID exibiram uma perda maior de IgM de superfície.

Em um experimento separado, lentivírus contendo ou um S-H-R-N-A irrelevante como controle ou um S-H-R-N-A contra um fator de reparo de DNA de alta fidelidade, esperado para proteger contra a MHM, foram produzidos em células bosque 23. Os lentivírus foram então infectados em um clone a ID alto de células Ramos. Novamente, a expressão gênica foi analisada e, mais uma vez, como esperado, observou-se queda nos níveis do fator de reparo de DNA na presença de um S-H-R-N-A direcionado contra esse fator. A perda de IGM em clones de célula única também foi analisada após três semanas, já que acredita-se que o fator forneça proteção contra mutações durante a MHM, ocorrendo um aumento na perda de IGM e na MHM na ausência do fator, como pode ser observado nesta figura.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar infecções virais com construtos que contenham OVEREXPRESSION ou S-H-R-N-A na linhagem celular de linfócitos B da linhagem RAW, e, em seguida, como medir a hipermutação somática nessas células.