Name: Análise de Expressão de mamíferos Linker-histona Subtipos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Aprenda a analisar a expressão de subtipos de histona H1 em mamíferos usando PCR em tempo real e cromatografia líquida de alta eficiência. Este método permite quantificar simultaneamente níveis de mRNA e proteína.

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Este trabalho é apoiado pelo NIH concessão GM085261 e um Cancer Coalition Geórgia Prêmio Distinguished Scholar (a FA).

<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
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<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O conjunto de ensaios aqui apresentados permitir uma análise abrangente dos níveis de expressão de mamífero vinculador subtipos histonas. Adequadamente projetados qRT-PCR ensaios fornecem medições altamente sensível e precisa de mensagens de RNA a partir de quaisquer genes de mamíferos histona H1. A parte crítica de qRT-PCR ensaios para linker genes subtipo histona é a preparação de ADNc utilizando o iniciador aleatório baseado transcrição reversa. mRNA de genes mais histona, incluindo genes mais H1, não contêm um longo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> RNase Zap </td><td> Applied Biosystems </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Reagente Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-018 </td></tr><tr><td> SuperScriptIII </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> Etanol absoluto </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> QI SYBR Green </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8880 </td></tr><tr><td> Kit Mini RNeasy </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Desoxirribonuclease I </td><td> Sigma </td><td> AMP-D1 </td></tr><tr><td> Microseal placa de 96 poços de PCR </td><td> Bio-Rad </td><td> MSP-9605 </td></tr><tr><td> Auto-colantes &#39;B&#39; Microseal </td><td> Bio-Rad </td><td> MSB-1001 </td&gt; </tr><tr><td> Sacarose </td><td> Organics Agros </td><td> AC40594 </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP332 </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (NaCl) </td><td> Americana Bioanalytical </td><td> AB01915 </td></tr><tr><td> Hepta-di-hidrogenofosfato de sódio (NaH 2 PO 4 · 7H2O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP-330 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310 </td></tr><tr><td> Completa Mini proteinase comprimido coquetel inibidor </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E-5134 </td></tr><tr><td> Fluoreto de Phenylmethanesulfonyl (PMSF) </td><td> Americana Bioanalytical </td><td> AB01620 </td></tr><tr><td> Nonidet-40 (NP-40) </td&gt; <td> Americana Bioanalytical </td><td> AB01425 </td></tr><tr><td> Cloreto de potássio (KCl) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> Tris [hidroximetil aminometano] </td><td> Americana Bioanalytical </td><td> AB02000 </td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio (MgCl2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Ácido sulfúrico (H2SO4) </td><td> VWR </td><td> VW3648-3 </td></tr><tr><td> Hidróxido de amónio (NH4OH) </td><td> Organics Agros </td><td> AC42330 </td></tr><tr><td> Bradford Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Acetonitrila </td><td> EMD </td><td> AX0145-1 </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético (TFA) </td><td> JTBaker </td><td> 9470-01 </td></tr></tbody></table>

análise de expressão de mamíferos linker-histona subtipos

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Histona H1 Linker liga-se à partícula núcleo nucleossomo e DNA linker, facilitando o dobramento da cromatina em estrutura de ordem superior. H1 é essencial para o desenvolvimento de mamíferos 1 e regula a expressão do gene específica in vivo 2-4. Entre as proteínas altamente conservadas histona, a família de histonas linker H1 é o grupo mais heterogénea. Existem 11 subtipos H1 em mamíferos que são diferencialmente regulados durante o desenvolvimento e em diferentes tipos celulares. Estes subtipos H1 incluem 5 somática H1s (H1a-e), o H1 substituição 0, 4 subtipos de células germinativas H1 específicos, e H1x 5. A presença de subtipos H1 múltiplas que diferem na afinidade de ligação ao ADN ea capacidade de compactação cromatina 6-9 fornece um nível adicional de modulação da função da cromatina. Assim, a análise quantitativa da expressão subtipos H1 individuais, tanto de ARNm e as proteínas, é necessário para melhor compreensão da regulação de maiorestrutura de ordem cromatina e função. Descrevemos aqui um conjunto de ensaios concebidos para analisar os níveis de expressão dos subtipos H1 individuais (Figura 1). a expressão do mRNA de genes de variantes diferentes H1 é medido por um conjunto de altamente sensíveis e quantitativa transcrição reversa PCR (qRT-PCR), que são mais rápida, mais precisa e requerem amostras muito menos em comparação com a abordagem alternativa de análise de Northern blot. Ao contrário da maioria outras mensagens de ARNm celulares, mRNAs para os genes mais histona, incluindo a maioria dos genes H1, ​​carecem de uma cauda poliA de comprimento, mas contêm uma estrutura de haste loop-na extremidade 3 &#39;região não traduzida (UTR) 10. Portanto, cDNAs são preparados a partir de RNA total por transcrição inversa utilizando iniciadores aleatórios, em vez de oligo-dT iniciadores. Os ensaios em tempo real de PCR com primers específicos para cada subtipos H1 (Tabela 1) são realizados para obter medições altamente quantitativa dos níveis de mRNA de subtipo H1 indivíduos. A expressão de genes de limpeza são analisados ​​como controlos para a normalização. A abundância relativa de proteínas de cada subtipo H1 e histonas núcleo é obtido através de cromatografia líquida de fase reversa de alto desempenho (RP-HPLC) análise de histonas total extraído de células de mamíferos 11-13. O método de HPLC e as condições de eluição descrito aqui dar separações óptimas de subtipos H1 do rato. Pela quantificação do perfil de HPLC, calcula-se a proporção relativa de subtipos H1 individuais dentro da família H1, bem como determinar a H1 a razão de nucleossomas nas células.

Nós descrevemos um conjunto de ensaios para analisar os níveis de expressão de histonas linker H1. mRNA de genes H1 individuais são quantitativamente medido por acaso a transcrição reversa com base iniciador seguido por PCR em tempo real, enquanto que a quantificação de proteína de histonas H1 é conseguido através da análise por HPLC.

Análise de Expressão de mamíferos Linker-histona Subtipos

A histona de ligação H1 liga-se à partícula central do nucleossomo e ao DNA de ligação, facilitando o enovelamento da cromatina em estruturas de ordem superior. A H1 é essencial...

O objetivo geral deste procedimento é analisar os níveis de expressão dos subtipos da histona H1 por meio da análise dos níveis de mRNA de H1 e da medição dos níveis de proteína H1. Para realizar a análise de mRNA, o RNA total é primeiramente extraído de células cultivadas ou de tecido de camundongo. O segundo passo do procedimento consiste em realizar uma transcrição reversa do RNA total com primers aleatórios, seguida por ensaios de PCR quantitativa em tempo real para cada um dos genes dos subtipos de H1. A análise da proteína histona H1 começa com o preparo de extratos totais de histonas a partir de tecidos de camundongo ou células cultivadas.Em seguida, realiza-se a fracionamento e quantificação de cada subtipo de histona H1 e da histona central H2B por meio de análise de CLAE em fase reversa. Por fim, a PCR quantitativa em tempo real e a análise de CLAE em fase reversa mostram os níveis de expressão de mRNA e proteínas, para cada subtipo de histona H1.Somos estudantes de pós-graduação do laboratório FES da Dra. Yuhan, da Escola de Biologia do Instituto de Tecnologia da Geórgia. Hoje vamos mostrar a vocês um conjunto de ensaios abrangentes para análise da expressão de H ones em

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A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina

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