Análise de Expressão de mamíferos Linker-histona Subtipos

O objetivo geral deste procedimento é analisar os níveis de expressão dos subtipos da histona H1 por meio da análise dos níveis de mRNA de H1 e da medição dos níveis de proteína H1. Para realizar a análise de mRNA, o RNA total é primeiramente extraído de células cultivadas ou de tecido de camundongo. O segundo passo do procedimento consiste em realizar uma transcrição reversa do RNA total com primers aleatórios, seguida por ensaios de PCR quantitativa em tempo real para cada um dos genes dos subtipos de H1. A análise da proteína histona H1 começa com o preparo de extratos totais de histonas a partir de tecidos de camundongo ou células cultivadas.

Em seguida, realiza-se a fracionamento e quantificação de cada subtipo de histona H1 e da histona central H2B por meio de análise de CLAE em fase reversa. Por fim, a PCR quantitativa em tempo real e a análise de CLAE em fase reversa mostram os níveis de expressão de mRNA e proteínas, para cada subtipo de histona H1.

Somos estudantes de pós-graduação do laboratório FES da Dra. Yuhan, da Escola de Biologia do Instituto de Tecnologia da Geórgia. Hoje vamos mostrar a vocês um conjunto de ensaios abrangentes para análise da expressão de H ones em subtipos de H one de mamíferos. Por meio desses ensaios, é possível obter uma medida quantitativa dos níveis de expressão de mRNA e proteína em diversos subtipos de H one.

A histona H1 é a principal proteína cromossecular que facilita o dobramento cromossômico de ordem superior, existindo múltiplas variantes da histona H1 que são diferencialmente expressas durante a diferenciação celular e o desenvolvimento. O perfil de expressão desses subtipos de H1 é necessário para uma melhor compreensão da regulação da estrutura e função cromossômica de ordem superior. Então, vamos começar.

Antes da extração de RNA, todas as superfícies de trabalho e pipetas devem ser limpas com etanol a 70% e tratadas com solução descontaminante de RNAses. Esta prática reduz as chances de contaminação por RNAses e de degradação do RNA. Além disso, deve-se usar luvas em todos os procedimentos para iniciar a extração de RNA de culturas celulares aderentes, aspirar o meio de cultura e lavar as células com PBS.

Em seguida, remova o PBS dos poços. É necessário um quantidade suficiente do reagente triol para obter RNA de alta qualidade. Use um mililitro do reagente triol para extrair RNA de um poço de uma placa de seis poços e prossiga com a extração de RNA das células de acordo com o manual do fabricante para o reagente triol. Após a extração do RNA, meça a concentração de RNA utilizando o NanoDrop 1000.

O rendimento típico varia de cinco a quinze microgramas de RNA por um vezes dez à sexta potência de células cultivadas. Antes de prosseguir para a síntese de cDNA, analise a qualidade do RNA por eletroforese em gel para eliminar a possível contaminação do RNA com traços de DNA genômico; trate as amostras de RNA com DNase livre de RNase conforme as instruções do fabricante para a transcrição reversa de RNA total em cDNA. Utilize o sistema SuperScript III de síntese da primeira fita de acordo com as instruções do fabricante. Como os mRNA da maioria dos genes H1 não possuem caudas poli-A, é essencial utilizar hexâmeros aleatórios em vez de oligo dT como iniciadores.

Para a síntese de cDNA, após a transcrição reversa, a amplificação do cDNA pode ser realizada por meio de Q-R-T-P-C-R, detectada com corante cyber green antes do ensaio de Q-R-T-P-C-R. Foram projetados primers direto e reverso específicos para cada gene H one e para o gene interno de referência, e a eficiência dos primers foi testada pelo método da curva padrão conforme descrito no protocolo escrito. Prossiga para preparar cada reação de PCR misturando os primers, cDNA e CYBERG green super.

Homogeneíze bem as reações em uma placa PCR de 96 poços usando selos adesivos B micros EAL para garantir que a tampa da placa esteja vedada à placa. Em seguida, vortexe a placa vedada e centrifugue brevemente as misturas de reação. Coloque a placa no sistema de detecção em tempo real My IQ de uma cor para QPCR.

Configure as condições de QPCR e realize a corrida conforme instruído no texto após a amplificação. Examine as curvas de amplificação quanto à eficiência da PCR e ao limiar de ciclos ou valores de CT. A linha de limiar pode ser definida automaticamente pelo software da versão 2.0 do sistema óptico IQ five.

Como o cyber green detecta qualquer DNA de dupla fita, é fundamental realizar uma corrida de curva de dissociação após a QPCR para garantir que o amplicon desejado, e não dímeros de iniciadores ou contaminantes, seja amplificado e detectado. Para o programa de análise de curva de dissociação, o instrumento de QPCR deve aquecer as amostras de 55 graus centígrados a 95 graus centígrados em incrementos de 0,5 grau centígrado com coleta de dados. Como a temperatura ou TM de DNA de dupla fita depende do comprimento do amplicon e do teor de GC, diferentes amplicons terão diferentes TM.

Examine as curvas derivativas de fusão dos produtos de QPCR para confirmar a temperatura específica de fusão dos amplicons desejados, bem como a ausência de picos de amplicons indesejados, como as curvas de fusão dos amplicons de PCR de H one A mostradas aqui, com uma TM de 86 graus centígrados. Prossiga para analisar os dados de QPCR com o software do sistema óptico IQ cinco. Normalize os valores de expressão dos genes da isoforma H one com a expressão dos genes de referência para obter os níveis relativos de expressão dos genes H one.

Após dissecar o órgão de interesse de um camundongo eutanasiado, lave-o com PBS frio. Nesta demonstração, o preparo do total de histonas é realizado no fígado; após a lavagem, pique o tecido em pedaços com uma lâmina de barbear. Transfira o tecido picado para um homogeneizador de Dounce e adicione tampão de sacarose ao homogeneizador em um volume de 10 mililitros por grama de tecido.

Prossiga com a homogeneização do tecido com 10 a 15 movimentos. Após transferir os homogeneizados para um tubo de 15 mililitros, realize a centrifugação das amostras a 500 RPM durante 30 segundos. Após a centrifugação, transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo e centrifugue a 2000 RPM por cinco minutos.

Para obter o pellet celular, ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de tampão de sacarose, suplementado com 0,5% de NP-40. Transfira a amostra para um homogeneizador Dounce e realize 10 movimentos durante uma incubação de 20 minutos. Neste ponto, os núcleos são obtidos.

Examine a qualidade dos núcleos ao microscópio. Após a centrifugação dos núcleos a 2000 RPM durante cinco minutos, o sobrenadante pode ser descartado. Em seguida, re-suspenda o pellet de núcleos em três mililitros de tampão de alto sal por um grama de tecido.

Transfira a amostra para um homogeneizador pequeno e homogeneíze com cinco a 10 movimentos. Aliquote a suspensão em três tubos menores. Incube os tubos no gelo por 20 minutos.

Após a incubação, realize uma centrifugação a 14.000 RPM por 10 minutos para obter o pellet de cromatina. Após descartar o sobrenadante, extraia as histonas totais adicionando 0,8 mililitros de ácido sulfúrico 0,2 normal a cada pellet de cromatina. Utilize um pistilo para tubo eppendorf para triturar bem o pellet até que este esteja completamente dissociado.

Incube as amostras em uma plataforma rotativa a quatro graus centígrados durante a noite. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para dois tubos EOR. Adicione 2,5 volumes de etanol gelado a cada tubo.

Mantenha as amostras a menos 20 graus centígrados durante a noite; no dia seguinte, centrifugue a 14.000 RPM por 10 minutos para obter o pellet de histonas totais e descarte o sobrenadante. Após lavar o pellet três vezes com etanol a 70%, deixe os tubos abertos sobre a bancada por 20 a 30 minutos para secagem ao ar e prossiga imediatamente para a análise por HPLC. Imediatamente. Re-suspenda o pellet de histonas no volume recomendado de água bidestilada, de acordo com a capacidade da coluna de fase reversa e do instrumento de HPLC, e centrifugue a 14.000 RPM por cinco minutos.

Para remover resíduos insolúveis, injete de 50 a 100 microgramas de proteína total de histona na coluna de fase reversa do sistema de CLAE, como o purificador GE ACTA UPC 900. Carregamento. Deve-se evitar uma quantidade excessiva de proteína para prevenir o entupimento da coluna. A fração oito, a histona ligadora e as histonas centrais são eluídas com um gradiente crescente de acetonitrila conforme listado no protocolo escrito; o efluente é monitorado a 214 nanômetros e os perfis de CLAE são registrados e analisados. As frações proteicas também podem ser coletadas com o coletor automático de frações GE FRAC nine 20 para análises posteriores.

Mostradas aqui estão curvas típicas de amplificação de reações H one A-Q-P-C-R utilizando cDNA preparado a partir de fígado de camundongo e células-tronco embrionárias de camundongo. A avaliação do gráfico de amplificação mostra que as reações triplicadas de QPCR de cada amostra geraram sinais consistentes com valores de CT quase idênticos, sugerindo alta reprodutibilidade. A ausência de acúmulo de amplicons nas reações de QPCR sem RT indica que não havia contaminação por DNA genômico ou que esta era mínima. Utilizando os valores de CT dos genes H one e dos genes de manutenção, os níveis relativos de expressão de RNA de cada gene H one foram calculados.

Os gráficos mostrados aqui são exemplos de resultados calculados para os genes H one A e H one zero. Os níveis relativos de expressão de mRNA de H one A são mais altos em células-tronco embrionárias de camundongo em comparação com fígado de camundongo, enquanto a expressão de H one zero é muito mais alta no fígado do que nas células-tronco embrionárias. A diferença na expressão de H one A ou H one zero em células-tronco embrionárias de camundongo versus fígado adulto de camundongo também é evidente nos perfis de HPLC das proteínas histonas.

H um zero. A H um específica da diferenciação é acumulada em grande quantidade no fígado de camundongo adulto. Em contraste, a proteína H um zero está quase ausente em células-tronco embrionárias de camundongo indiferenciadas.

Por outro lado, a H one A é altamente expressa nas células-tronco embrionárias, mas apresenta-se em baixos níveis no fígado de camundongo adulto por meio da quantificação dos picos de H one. No perfil de HPLC, a proporção relativa de cada subtipo individual de H one dentro da família H one é determinada no fígado de camundongo adulto. Além disso, os valores de cada subtipo individual de H one por nucleossomo podem ser calculados a partir da razão entre o valor normalizado do pico de absorvância em 214 nanômetros dos subtipos correspondentes de H one e metade do valor normalizado para a H two B. Esse valor pode ser semelhantemente calculado para a H one total por nucleossomo.

Uma vez dominada, a análise Q-R-T-P-C-R do subtipo H um pode ser realizada em um dia, e a extração de histonas e a análise HPRC podem ser feitas em três dias, se realizadas corretamente. Ao tentar a análise Q-R-T-P-C-R dos genes de histona H um, é fundamental evitar a degradação do RNA e eliminar a contaminação por DNA genômico, e, mais importante, incluir primers aleatórios na reação de transcrição reversa. Durante a extração de histonas e a análise HPOC, é importante adicionar inibidores de proteínas frescos ao tampão de extração para evitar a degradação proteica, e também devemos prestar atenção para desagregar completamente a cromatina, a fim de facilitar a extração completa das histonas.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar de forma abrangente a expressão dos subtipos de histona H1 de mamíferos nos níveis de mRNA e de proteína.