Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Neste relatório nós descrevemos um método para esmagamento do nervo ciático do rato. Este método usa prontamente disponíveis pinça hemostática e facilmente reproduzível e produz esmagamento do nervo ciático completa. Além disso, nós descrevemos um método para preparar montagens de músculos inteiros adequados para análise da regeneração do nervo após esmagamento do nervo ciático.

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método reprodutível simples de esmagamento do nervo ciático e análise de montagem total da reinervação muscular após esmagamento do nervo ciático. Isso é feito expondo primeiro o nervo ciático, incluindo o arranjo adequado dos afastadores cirúrgicos para garantir um bom acesso ao nervo. Em seguida, esmague o nervo com uma pinça hemostática e marque o nervo com carvão.

Em seguida, remova os músculos individuais inervados pelo nervo ciático do membro posterior. A etapa final é dissecar os músculos individuais para análise de montagem inteira após a imunocoloração. Em última análise, os resultados demonstram que o esmagamento reprodutível do nervo ciático pode ser simplesmente realizado e as montagens de orifícios musculares podem ser usadas para analisar a regeneração subsequente.

A principal vantagem desse procedimento é que ele fornece uma técnica simples e reprodutível para esmagar o nervo ciático e, posteriormente, pontuar a regeneração axonal. Comece este procedimento anestesiando o camundongo para cirurgia usando um coquetel de 100 miligramas por quilo de cetamina e 10 miligramas por quilograma de xilazina por injeção intraperitoneal para minimizar a dor pós-operatória. O camundongo também recebe uma injeção subcutânea de 10 miligramas por quilograma de meloxicam.

Em seguida, raspe os dois quartos traseiros cuidadosamente usando um aparador cirúrgico. Em seguida, aplique o creme depilatório nare para esgotamento completo. Limpe a pele com um aplicador estéril com ponta de algodão e um esfoliante cirúrgico Betadine.

Depois disso, aplique pomada oftálmica nos olhos com um aplicador estéril com ponta de algodão. Coloque o rato em uma placa de aço inoxidável limpa sobre um cobertor homeotemático pré-aquecido e mantenha a temperatura do animal em 37 graus Celsius. Em seguida, prenda todos os membros com fita adesiva.

Posicione cuidadosamente o membro posterior simetricamente para que a articulação do joelho faça um ângulo reto com o corpo. Em seguida, cubra o campo cirúrgico com uma cortina estéril sob o microscópio. Faça uma incisão semicircular na linha média.

Separe a pele suavemente da musculatura subjacente e dobre-a de vez em quando. Aplique cerca de 0,1 mililitros de solução salina estéril para manter o local da cirurgia úmido durante o procedimento. Em seguida, abra o plano fascial entre o glúteo máximo e a cabeça anterior do bíceps femoral.

Revelar o nervo ciático para um controle cirúrgico. O nervo ciático contralateral deve ser exposto e mobilizado, mas deixado intacto. Em seguida, repouse e suture a musculatura glútea.

Exponha o nervo ciático experimental da mesma maneira com os afastadores. Para facilitar a visualização. Liberte suavemente o nervo ciático do tecido conjuntivo circundante usando uma tesoura de iridectomia.

Em seguida, use a pinça fina 5 45 para colocar o nervo na mandíbula inferior da pinça hemostática super fina, alinhe as três fáscias adjacentes, não uma sobre a outra. A pinça hemostática foi gravada com uma marca a 1,5 milímetros de sua ponta. Coloque a parte mais externa do ciático alinhada com esta marca antes do esmagamento.

Isso garante um esmagamento de largura uniforme e que o nervo não se estenda além das mandíbulas da pinça hemostática quando achatado devido à força de esmagamento. Se o nervo se estender além das pontas da pinça, o nervo será apenas parcialmente esmagado. Use um segundo par de pinças hemostáticas que foi pré-mergulhado e carvão em pó para marcar o local do esmagamento.

Esmague o nervo no mesmo local de esmagamento por 15 segundos com três cliques. Nenhuma marcação de carbono deve se estender além do limite do esmagamento inicial. Isso é particularmente importante se for necessária uma marcação precisa do local do esmagamento para pré-mergulhar a pinça em carbono e impedir a disseminação de carbono no local da cirurgia.

Abra a pinça em carbono em pó. Em seguida, feche-os com cuidado. Use gaze estéril para limpar o carbono do lado de fora dos hemostáticos.

Verifique a pinça com pelo menos três vezes de ampliação para verificar se as superfícies de britagem estão uniformemente revestidas com carbono em pó. Se necessário, eles são mergulhados e limpos em repouso e suturam a musculatura glútea da mesma forma que o lado contralateral. Por fim, feche a incisão na pele usando os clipes reflexos de nove milímetros.

Se clipes reflexos de nove milímetros restringirem o movimento, clipes reflexos menores ou seis suturas aut podem ser usados. Em vez disso, depois de sacrificar o mouse, remova quatro músculos. As tíbias extensor longo anterior dos dedos, fibular longo e sóleo no membro posterior cuidadosamente, prendendo seus tecidos conjuntivos a um prato revestido de sardinha preta.

Em seguida, lave-os em PBS. Em seguida, fixe-os em aldeído paraforme a 4% por 30 minutos. Para dissecar cada músculo em uma placa de Petri revestida de sardinha preta, remova os tendões usando a tesoura de iridectomia.

Depois disso, afine os músculos descascando as fibras musculares internas Preserve cuidadosamente a superfície externa do músculo, incluindo as bandas da placa terminal. Em seguida, monte os músculos resultantes em lâminas positivas com escudo vetorial e lamínulas de vidro de 22 por 40 milímetros, sele os dois lados com esmalte transparente. Quando estiverem devidamente montadas na corrediça, as bandas nplate devem estar em contato com as lamínulas.

Aqui está um exemplo de um local de esmagamento in situ no membro posterior esquerdo. O local de esmagamento é indicado por carbono negro. O asterisco marca um ramo do nervo tibial que inerva a musculatura da coxa e serve como um ponto de referência útil.

Durante a cirurgia de esmagamento, a divisão tibial do nervo ciático é delineada em azul, fibular e verde e srel e amarelo. Esta seção semifina demonstra um esmagamento completo realizado com a pinça hemostática. As pontas das setas indicam fibras esmagadas aqui.

Um esmagamento incompleto realizado com a pinça angulada é indicado em outra seção de semiquilha. A ponta da seta novamente indica fibras esmagadas, enquanto as setas indicam axônios preservados. Estas são as imagens renderizadas de todos os músculos da montaria.

Após a remoção do tecido conjuntivo e subsequente afinamento, as bandas de nplate são delineadas em cada músculo. Aqui é mostrado o músculo montado inteiro. 14 dias após o esmagamento do nervo ciático.

As setas indicam áreas da junção neuromuscular que foram reinervadas por um axônio. Aqui está a demonstração da junção neuromuscular desnervada. A lacuna 43 processos de células de schwan positivas são indicados pelas pontas das setas.

Nenhum axônio é visto nesta junção neuromuscular desnervada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como esmagar o nervo estático de forma reprodutível e preparar montagens de hormônios musculares para a análise da regeneração.