Chromosomics: Detecção de alterações numéricas e estruturais em todos os 24 cromossomos humanos ao mesmo tempo usando um ensaio de FISH Novel OctoChrome
6 de fevereiro de 2012
Um de fluorescência romance In situ Hibridização (FISH) método que, simultaneamente, examina alterações cromossômicas, tanto numéricas e estruturais, particularmente as translocações específicas cromossômicas associados com leucemia e linfoma, de todos os 24 cromossomos humanos em um único dispositivo em uma hibridação, é descrito.
O ensaio Octa Chrome Fish examina simultaneamente todos os 24 cromossomos humanos em uma única hibridização em um único lâmina. Primeiro, prepare espalhamentos metafásicos na lâmina específica de oito quadrados. Em seguida, realize uma varredura automatizada da lâmina da amostra para facilitar a localização de todas as metáfases e a reavaliação futura de todas as imagens celulares.
Na próxima posição, os oito quadrados deslizam sobre o dispositivo Octa chrome e hibridizam as sondas. Os resultados obtidos podem mostrar três cromossomos inteiros pintados de maneira distinta em cada quadrado, com base no arranjo das combinações cromossômicas no dispositivo RO. Tive a ideia inicial deste método RO FISH quando comecei a aplicar a técnica FISH em estudos populacionais humanos no início da década de 1990.
Então apresentei minha ideia de pintura tricolor, oito lâminas quadradas para posicionar a célula na conferência anual da A A CR em 1994. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a curvatura clássica de cromossomos e a prototipagem espectral moderna, é que ela pode analisar prontamente todos os 24 cromossomos humanos em um número maior de células. Comece com a preparação de células em metáfase fixadas em suspensão como controle, pipete um gota de células sobre uma lâmina e verifique a densidade apropriada.
Agora mergulhe em oito quadrados de cromo OC, deslize em etanol puro por dois minutos. Em uma sequência de quadrados alternados, distribua cinco microlitros de suspensão celular sobre a lâmina modelo para evitar que as espalhamentos celulares interfiram uns nos outros. Seque as amostras ao ar antes de aplicar pares adjacentes.
Adicione 20 microlitros de corante DAPI a 0,2 microgramas por mililitro ao centro de cada metade da lâmina e coloque uma lamínula. Em seguida, realize uma varredura automatizada da lâmina de amostra para localizar as células em metáfase. Utilize o software metaverse para facilitar a localização de todas as metáfases e a reavaliação futura de todas as imagens celulares.
Visualize manualmente os resultados da digitalização e exclua artefatos não metafásicos. Primeiro, remova a coloração DPI em dois tampões XSSC, depois desidrate as amostras por meio de uma série de lavagens com etanol. Seque a lâmina ao ar e, em seguida, coloque-a em uma placa térmica a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Agora, equilibre a sonda cromagênica, a câmara de hibridização multiprova e o tampão de hibridização em banho-maria a 37 graus Celsius com o lado da etiqueta voltado para baixo. Coloque o dispositivo OC chrome em uma placa aquecedora a 37 graus Celsius. Adicione dois microlitros da solução de hibridização pré-aquecida a cada uma das oito áreas.
Inverta e oriente cuidadosamente o molde. Deslize sobre o dispositivo OC Chrome. Verifique se o molde está alinhado ao dispositivo Octa Chrome.
Em seguida, abaixe cuidadosamente a lâmina sobre as gotas da solução de hibridização e aplique uma pressão suave e uniforme para espalhar a solução de hibridização até as bordas de cada uma das áreas elevadas no dispositivo OC chrome. Levante pela extremidade fosca da lâmina de vidro e inverta, de modo que a lâmina fique abaixo do dispositivo OC chrome. Coloque sobre uma placa aquecedora a 37 graus Celsius por 10 minutos.
Em seguida, transfira para uma placa aquecida a 75 graus Celsius por cinco minutos. Para desnaturar as amostras para a etapa de hibridização, transfira para um chroma probe, câmara de hibridização multiprobe. Substitua a tampa e deixe a câmara flutuando no banho-maria a 37 graus Celsius durante a noite.
Retire cuidadosamente a lâmina do aparelho e lave com 0,4 volumes em excesso de SC a 72 graus Celsius por dois minutos. Realize a segunda lavagem à temperatura ambiente por 30 segundos. Prossiga adicionando 20 microlitros de DPI ao centro de cada metade da lâmina e posicione uma lamínula.
Incube as amostras no escuro por 10 minutos à temperatura ambiente antes da observação por microscopia de fluorescência. O ensaio de peixes Octa chrome permite a análise simultânea de todos os 24 cromossomos humanos utilizando uma única hibridização em um único lâmina. Cada quadrado contém três sondas diferentes de pintura de cromossomos inteiros marcadas diretamente com fluorocromos de cores diferentes.
A análise de uma célula metafásica normal no quadrado dois do sistema Octa CHRO mostra que os cromossomos 8, 21 e 12 são pintados com as cores vermelha, verde e azul. Eles podem ser visualizados individualmente usando filtros respectivos ou visualizados simultaneamente por meio de um filtro triplo DAPI Fitzy, Texas Red. Essa abordagem cromossômica tem utilidade na detecção de células anormais com translocações cromossômicas específicas de leucemia e aneuploidia.
Por exemplo, a translocação cromossômica T 8 21 é comum na leucemia mieloide aguda. A trissomia 21, com 3 cópias do cromossomo 21, é uma aneuploidia frequente na leucemia após o desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para que cientistas na área de citogenética molecular e epidemiologia molecular investigassem as rearranjo cromossômicos mais comuns detectados na leucemia e no linfoma, e examinassem a ploidia seletiva entre todos os cromossomos humanos em pacientes clínicos ou populações expostas a substâncias químicas tóxicas.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como examinar simultaneamente todos os 24 cromossomos humanos em uma única hibridização em um único lâmina pelo ensaio Octo Chrome Fish. E definimos isso como cromossomos.
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Visão Geral
Este artigo descreve um novo método de hibridização fluorescente in situ (FISH) conhecido como ensaio Octa Chrome Fish. Ele permite a análise simultânea de todos os 24 cromossomos humanos em uma única hibridização em um único lâmina, com foco nas alterações cromossômicas associadas à leucemia e ao linfoma.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Hibridização fluorescente in loco (FISH)
- Análise cromossômica
- Oncologia
Contexto
- A FISH é uma técnica utilizada para detectar e localizar a presença ou ausência de sequências específicas de DNA em cromossomos.
- As translocações cromossômicas são significativas no estudo da leucemia e do linfoma.
- O método permite uma análise abrangente de alterações cromossômicas.
- Os métodos anteriores exigiam múltiplas hibridizações, tornando esta abordagem mais eficiente.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método que simplifique a detecção de anormalidades cromossômicas.
- Aumentar a eficiência da análise cromossômica em ambientes clínicos.
- Fornecer uma ferramenta para melhor compreensão da base genética das neoplasias hematológicas.
Métodos Utilizados
- Preparação de lâminas de metáfase em um lâmina especializada com oito quadrados.
- Varredura automatizada da lâmina para localizar metáfases destinadas à análise.
- Hibridização de sondas utilizando o dispositivo Octa Chrome.
- Visualização dos resultados mostrando diferentes cromossomos inteiros pintados com base nos arranjos.
Resultados Principais
- O ensaio visualiza com sucesso todos os 24 cromossomos em uma única hibridização.
- Os resultados podem exibir três cromossomos pintados diferentes em cada quadrado da lâmina.
- Facilita a reavaliação de imagens celulares para uma análise abrangente.
- Demonstra potencial para aplicação em estudos de populações humanas.
Conclusões
- O ensaio Octa Chrome Fish representa um avanço significativo na metodologia FISH.
- Este método pode melhorar a detecção de anomalias cromossômicas em cânceres hematológicos.
- Oferece uma abordagem mais eficiente para pesquisadores e clínicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O ensaio OctoChrome-FISH permite a detecção simultânea de alterações cromossômicas numéricas e estruturais em todos os 24 cromossomos humanos em uma única hibridização, solucionando um gargalo fundamental na análise citogenética de malignidades hematológicas. Ao consolidar a triagem do genoma completo em um único fluxo de trabalho baseado em lâmina, o método aumenta a produtividade e a reprodutibilidade na pesquisa de leucemias e linfomas, apoiando a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta pré-clínica. Essa capacidade melhora a confiança preditiva na identificação de oncogenes impulsionados por translocações e padrões de aneuploidia relevantes para a leucemogênese induzida por benzeno e outras exposições a agentes tóxicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização de translocações específicas de leucemia, como t(9;22), t(15;17), t(8;21) e t(14;18), em seu contexto cromossômico nativo.
- Valor Operacional: Reduz a necessidade de múltiplas hibridizações FISH sequenciais, conservando amostras e acelerando a confirmação de alvos na biologia de descoberta.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao fornecer avaliação simultânea de rearranjos estruturais e aneuploidia em todo o genoma, aumentando a confiança nas associações entre alvos e doenças.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas cromossômicos validados para triagem subsequente, estabelecendo cariótipos de referência e detectando taxas de alteração de fundo em populações expostas.
- Valor Operacional: Padroniza leituras citogenéticas por meio de marcação consistente de sondas e arquitetura de lâminas, aumentando a reprodutibilidade entre laboratórios e campanhas de triagem.
- Valor de Escalabilidade: Permite análise de alto conteúdo de metáfases por meio de varredura automatizada, facilitando a reavaliação e o acompanhamento longitudinal da estabilidade cromossômica em estudos toxicológicos longitudinais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Conecta a descoberta e a validação pré-clínica ao permitir a comparação direta de alterações cromossômicas em modelos celulares, amostras de pacientes e coortes populacionais expostas a leucemogênicos como o benzeno.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece se as aneuploidias ou translocações observadas são eventos aleatórios ou padrões associados à exposição, orientando a avaliação de risco no desenvolvimento de biomarcadores translacionais.
- Valor de Continuidade: Apoia a transição contínua dos achados in vitro para relevância in vivo, mantendo a resolução cromossômica entre sistemas modelo e espécimes humanos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se na continuidade entre descoberta e pré-clínico, permitindo a análise cromossômica em estágios iniciais de testes de hipóteses e apoiando a identificação de compostos líderes por meio da redução de riscos mecanicistas relacionados à instabilidade genômica.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação de hipóteses sobre mecanismos cromossômicos na leucemogênese ao permitir o rastreamento simultâneo de múltiplas alterações conhecidas e novas ao longo do genoma.
- Rastreamento: Fornece resultados quantitativos e multiplexados (por exemplo, frequência de translocações, taxas de aneuploidia) que permitem comparar os efeitos de compostos ou exposições sob diferentes condições.
- Análises: Gera sinais fluorescentes multiplexados compatíveis com imagem automatizada e cariótipos assistidos por software, possibilitando comparações objetivas dos estados cromossômicos.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro à relevância humana ao detectar padrões cromossômicos idênticos em estudos populacionais, apoiando o alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma plataforma citogenética reutilizável, aplicável em programas de oncologia, toxicologia e farmacogenômica que exijam avaliação da integridade cromossômica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir falsos negativos por meio de cobertura cromossômica abrangente.
- Valor Operacional: Melhora a padronização e reprodutibilidade por meio de conjuntos padronizados de sondas e formato de lâmina, minimizando a variabilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Aumenta a eficiência do capital ao reduzir o consumo de reagentes e o tempo de manipulação manual em comparação com abordagens sequenciais de FISH ou SKY.
- Impacto no Portfólio: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco ao fornecer evidências precoces de estabilidade ou instabilidade genômica em candidatos principais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência e preparação citogenética para a geração precisa de metáfases espalhadas e interpretação de sinais.
- Depende do acesso ao dispositivo OctoChrome e câmaras de hibridização compatíveis para a entrega simultânea de múltiplos sondas.
- Necessita padronização dos protocolos de manipulação de lâminas, desnaturação e lavagem para garantir penetração consistente das sondas e relações sinal-ruído estáveis.
- A adaptação a sistemas modelo não humanos pode exigir revalidação da especificidade das sondas e da eficiência de pintura cromossômica.
- As limitações práticas incluem a dependência de amostras de qualidade metafásica e a possível sobreposição de sinais em genomas altamente rearranjados, exigindo desmistura espectral cuidadosa.
