Chromosomics: Detecção de alterações numéricas e estruturais em todos os 24 cromossomos humanos ao mesmo tempo usando um ensaio de FISH Novel OctoChrome

O ensaio Octa Chrome Fish examina simultaneamente todos os 24 cromossomos humanos em uma única hibridização em uma lâmina. Primeiro, prepare spreads de metáfase no slide específico de oito quadrados. Em seguida, execute uma varredura automatizada da lâmina de amostra para facilitar a localização de todas as metafases e a reavaliação futura de todas as imagens celulares.

Na próxima posição, o oitavo quadrado desliza sobre o dispositivo cromado Octa e hibridiza as sondas. Os resultados obtidos podem mostrar três cromossomos inteiros pintados diferentes em cada quadrado com base no arranjo das combinações de cromossomos no dispositivo RO. Tive a ideia para este método RO FISH quando comecei a aplicar peixes em estudos populacionais humanos no início dos anos 1990.

Então apresentei minha ideia de pintura em três cores, oito slides quadrados para definir a célula na conferência anual AA CR em 1994. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a flexão cromossômica clássica e a prototipagem espectral moderna, é que ela pode analisar prontamente todos os 24 cromossomos humanos em um número maior de células. Comece com uma preparação de células metafásicas fixadas em suspensão como uma pipeta de controle soltar células em uma lâmina e verifique a densidade apropriada.

Agora mergulhe em oito cromos OC quadrados, deslize em etanol puro por dois minutos. Em uma sequência de quadrados alternados, distribua cinco microlitros de suspensão celular na lâmina do molde para evitar que as células se espalhem interferindo umas nas outras. Seque as amostras ao ar antes de detectar pares adjacentes.

Aplique 20 microlitros de 0,2 microgramas por mililitro de mancha DAPI no centro de cada metade da lâmina e coloque uma lamínula. Agora, execute uma varredura automatizada da lâmina de amostra para localizar as células da metáfase. Use o software do metaverso para facilitar a localização de todas as metafases e a reavaliação futura de todas as imagens celulares.

Visualize os resultados da varredura manualmente e exclua artefatos não metafásicos. Primeiro, remova a mancha de DPI em dois tampão XSSC e, em seguida, desidrate as amostras por meio de uma série de lavagens com etanol. Seque o slide ao ar livre e coloque-o em uma placa de lúpulo de 37 graus Celsius por cinco minutos.

Agora equilibre a sonda de croma, a câmara de hibridização de várias sondas e o tampão de hibridização em um banho-maria de 37 graus Celsius com o lado da etiqueta voltado para baixo. Coloque o dispositivo cromado OC em uma placa de aquecimento de 37 graus Celsius. Adicione dois microlitros de solução de hibridização pré-aquecida a cada uma das oito áreas.

Inverta e oriente cuidadosamente o modelo. Deslize sobre o dispositivo OC Chrome. Verifique se o slide do modelo está alinhado ao dispositivo Octa Chrome.

Em seguida, abaixe cuidadosamente o slide sobre as gotas da solução de hibridização e aplique uma pressão suave e uniforme para espalhar a solução de hibridização nas bordas de cada uma das áreas elevadas no dispositivo cromado OC. Levante a extremidade fosca da lâmina de vidro e inverta para que a corrediça fique embaixo do dispositivo cromado OC. Coloque em uma chapa quente a 37 graus Celsius por 10 minutos.

Em seguida, transfira-o para uma placa quente de 75 graus Celsius por cinco minutos. Para desnaturar as amostras para a etapa de hibridização, transfira para uma sonda de croma, câmara de hibridização de várias sondas. Recoloque a tampa e flutue a câmara no banho-maria de 37 graus Celsius durante a noite.

Remova a lâmina cuidadosamente do dispositivo e lave em excesso de 0.4 SC a 72 graus Celsius por dois minutos. Realize a segunda lavagem em temperatura ambiente por 30 segundos. Prossiga para adicionar 20 microlitros de DPI ao centro de cada metade do slide e posicione uma lamínula.

Incubar as amostras no escuro durante 10 minutos à temperatura ambiente antes de as visualizar por microscopia de fluorescência. O ensaio Octa chrome fish facilita o exame simultâneo de todos os 24 cromossomos humanos usando uma única hibridização em uma única lâmina. Cada quadrado carrega três diferentes sondas de pintura de cromossomos inteiros diretamente rotulados com flúor de cores diferentes.

O exame de quatro de uma célula metafásica normal no quadrado dois do sistema Octa CHRO mostra que os cromossomos 8, 21 e 12 são pintados de vermelho, verde e azul. Eles podem ser visualizados individualmente usando os respectivos filtros ou visualizados simultaneamente através de um filtro triplo DAPI Fitzy, Texas Red. Essa abordagem cromossômica tem utilidade na detecção de células anormais com leucemia cromossômica específica, translocação e aneuploidia.

Por exemplo, T 8 21 é uma translocação cromossômica comum na leucemia mieloide aguda. Trissomia 21 3 cópias do cromossomo 21 é uma aneuploidia comum na leucemia Após o desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para os cientistas no campo da citogenética molecular e epidemiologia molecular explorarem os rearranjos cromossômicos mais comuns detectados na leucemia e no linfoma e examinarem a ploidia seletiva entre todos os cromossomos humanos em pacientes clínicos ou populações expostas a produtos químicos tóxicos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como examinar simultaneamente todos os 24 cromossomos humanos em uma única hibridização em uma lâmina pelo ensaio Octo Chrome Fish. E definimos isso como cromossomos.