Name: Produção de Microarrays Tecido, de coloração imuno-histoquímica e de digitalização Dentro do Atlas proteína humana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprenda a produzir microarrays de tecido para análise de expressão proteica usando imuno-histoquímica e digitalização. Este método padronizado permite estudos de alta vazão integrados ao Atlas de Proteínas Humanas.

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Este trabalho foi suportado por concessões do Knut e Alice Wallenberg Foundation. As equipes inteiras dos centros de proteínas humanas Atlas em Uppsala, Estocolmo e Índia são reconhecidos por seus esforços para gerar o Atlas proteína humana. Os autores gostariam de agradecer especialmente a Frank Hammar e Sofie Gustafsson para obter ajuda com as fotos e Karlberg Elene de assistência com a produção TMA quando as filmagens.

1. Como se preparar tecidos para a produção de tissue microarray (Animação 1) <ol><li> Selecionar material de parafina relevante formalina fixo incorporado (amostras de tecidos ou células), incluindo correspondente secção de tecido manchado hematoxilina. </li><li> Marcar área relevante na secção de tecido. Recomenda-se a ter uma secção corada com hematoxilina acabada de cortar correspondente ao bloco de parafina. </li><li> Projete o modelo usado para a produção de TMA. Randomize as amostras dentro do modelo para evitar artefatos causados ​​por problemas técnicos, tais como cobertura do anticorpo sobre a seção TMA todo e problemas de seccionamento. Adicionar marcadores de orientação adicionais para o modelo para orientação. </li><li> Organizar os tecidos de acordo com o modelo. </li></ol> 2. Produção Microarray manual de Tissue (essencial para a filmagem) <ol><li> Para ser capaz de obter um comprimento normalizado de os fragmentos de tecido, marcar o estilete 4,5 milímetros por exemplo, (Figura 2). Guidelines para o espaçamento entre os centros de exemplo: núcleo de tamanho 0,6 milímetros - 0,8-1,0 milímetros núcleo milímetros de tamanho 1.0 - 1,8-2,0 mm núcleo de tamanho 1,5 milímetros - 2,0-3,0 milímetros núcleo tamanho 2,0 milímetros - 2,5-4,0 milímetros Recomenda-se para deixar 2,5-3,0 margens mm em cada lado do bloco de parafina para evitar rachaduras da parafina. </li><li><ol class="lalpha"><li> Monte os socos selecionado para ser usado. Comece por afrouxar os parafusos da chave sextavada que prende o soco no lugar. O punção é correctamente posicionada, quando a ranhura no cubo punção é colocado firmemente contra a haste de metal no plástico v-bloco. Apertar os parafusos e certificar-se que a borda do clipe de metal é horizontal. </li><li> O soco destinatário (marcados em verde e vermelho, específico para o distribuidor) deve ser colocado para a esquerda. O perfurador dador (marcado em verde e azul, específico para o distribuidor), que tem um diâmetro ligeiramente maior, deve ser colocado para a direita (Figura 3). </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Mova os socos ao longo dos x e y eixos usando os botões de ajuste XY. O botão de ajuste direita move os socos ao longo do eixo-x e o botão de ajuste esquerdo move os socos ao longo do eixo y. Existe uma leitura digital na micrómetro botões tanto de ajustamento. Estes são ativados quando se deslocam os botões. </li><li> Redefinir → pressione o botão ZERO / ABS. Mudança entre polegadas e mm → pressione o botão IN / mm. O espaço entre os furos deve ser de 2,0 mm (medido entre os centros dos furos) quando se utiliza um perfurador 1 mm para um modelo de 9x8. </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Para garantir que não empurrar o soco demasiado baixo para dentro do bloco, atingindo a cassete e destruir o soco, colocar uma cassete sem parafina no suporte e definir a posição inferior da punção receptora a 1 mm acima da parte inferior da cassete usando o parafuso batente de profundidade nacanto esquerdo superior da guia de Z-(Figura 3). </li><li> Colocar o bloco receptor no suporte e usar o menor chave de parafusos para fixar os parafusos. Não aperte os parafusos apertados ou a parafina pode libertar-se da cassete. </li><li> Empurrar o perfurador destinatário para baixo cerca de 5 mm para dentro do bloco receptor e usar o identificador no soco para girar o perfurador para trás e para a frente uma vez (Figura 3). O orifício será de 5 mm de profundidade ao empurrar o soco, tanto para baixo para dentro do bloco quanto possível. </li><li> Aliviar a pressão descendente empurrando lentamente, de modo que as molas podem mover o perfurador para cima. Use o estilete para esvaziar o soco e descartar o núcleo de parafina. </li></ol></li><li> Mover a torre para mudar para o dador perfurador (Figura 3). </li><li> Coloque a ponte bloco dador com o bloco dador sobre o suporte de bloco receptor (Figura 3). </li><li><ol class="lalpha"><li> Empurre a punção de doadoresh para a área seleccionada do bloco dador. Usar uma hematoxilina e eosina correspondente lâmina corada onde a região de interesse foi marcado para localizar o tecido que está a ser amostrado. Manualmente segurar o bloco de doadores na posição com a mão esquerda e empurre o soco com a mão direita. Note que você não deve empurrar o estilete. O limitador de profundidade não bloqueia o movimento perfurador na posição apropriada para o bloco dador, por isso, é importante que pára de empurrar quando a segunda marca é visível na estilete. </li><li> Rodar a pega do perfurador uma vez (Figura 3). Lentamente, liberte a pressão para baixo enquanto mantém o bloco de doadores na ponte bloco doador. </li><li> O tecido do dador é de preferência perfurado 0,5 milímetros mais curto do que o núcleo do destinatário. Este processo irá garantir um alinhamento ajustável dos núcleos na superfície bloco receptor, evitando a perda de tecido representativo valioso. </li></ol></li><li> Remover a ponte e do bloco dador. Fazercerteza de que o doador perfurador é alinhado com o furo que foi feita anteriormente (ponto 4). É necessário ajustar a posição de perfuração utilizando os parafusos de fixação se o perfurador dador e do orifício no bloco receptor não estão alinhados. </li><li> Cuidadosamente empurrar o perfurador para baixo até que a sua ponta atinge o topo do furo no bloco receptor. Mantendo esta posição, usar o estilete para esvaziar o núcleo tecido dentro do buraco. A superfície do núcleo deve estar em alinhamento com a superfície do bloco. </li><li> Mova o revólver de volta para o soco destinatário. </li><li> Mova para a posição seguinte com os botões de ajuste XY. </li><li> Repita a partir do ponto 4c acima até que a matriz está completa. </li><li> Quando o bloco receptor inteiro tenha terminado, desapertar os parafusos no suporte do bloco receptor. Coza no bloco em 42 ° C durante 40 minutos. Colocar o bloco com a área de corte voltado para baixo sobre uma lâmina de vidro. Coloque a lâmina de vidro com o bloco no topo de um suporte de tubos de ensaio (ou a construção apropriada outro) e colocar em tele forno. Após o cozimento, remover o suporte do tubo de ensaio do forno e achatar a superfície do bloco suavemente alisando a lâmina de vidro. </li><li> Colocar o bloco com a lâmina de vidro sobre uma placa de arrefecimento durante 10 minutos. Para garantir tecido representativo em todo o TMA um controle de qualidade em cada seção 50 º é realizada. </li></ol> 3. Como TMAs Seção (Animação 2) <ol><li> Corte 4 mm de espessura usando um micrótomo com sistema de transferência de seção (HM 355S, Microm). O sistema pode ser usado com todos os actuais micrótomos rotativos. O sistema é composto por um transportador de lâmina com ponte de transferência integrado, um banho de água aquecida e uma unidade de controlo. A partir da lâmina as secções deslizar sobre a superfície de transferência de molhada através de uma ponte de transferência para o banho de água. </li><li> As secções devem ser tomadas a partir do banho de água imediatamente depois de terem esticados para fora, para evitar a fusão das manchas de tecidos sensíveis (ex. tecidos lipídicos ricos como da mama e do cérebro). Place a seção sobre uma lâmina de vidro SuperFrost. O tempo das secções pode ser deixado na água depende do tipo de parafina encerado utilizado e da temperatura da água. O nosso laboratório cera de parafina utilização a partir de HistoLab Products AB, que têm um ponto de fusão de 56-58 ° C e recomendamos uma temperatura de banho de água de 37-39 ° C. </li><li> Colocar as lâminas no porta-lâminas para a secagem à temperatura ambiente (RT) durante a noite. </li><li> As lâminas são cozidos em 50 ° C durante 12-24 horas. Usando um microtom sem STS que tem de transportar a secção da lâmina para um banho de água manualmente utilizando, por exemplo uma escova. </li></ol> 4. Teste e procedimento de titulação de imuno-histoquímica (Animação 3) Cada anticorpo é submetido a um procedimento de ensaio normalizado utilizando especialmente concebidos TMAs contendo uma mistura de tecidos e tipos de células diferentes. O objetivo é avaliar um protocolo de imunomarcação individual e otimizada para cada anticorpo. Inicialmente diluição um, com base em formigaiBODY concentração estoque do anticorpo primário é testada. O resultado deste teste de coloração é usado para guiar as diluições posteriores e optimização do protocolo. <ol><li> Desparafinização e hidratação em etanol xileno e graduada para a água destilada são realizadas antes da imunocoloração. </li><li> Um passo de bloqueio para extinguir a peroxidase endógena é realizada em 0,3% de H2O 2 em etanol a 95% durante 5 minutos. </li><li> Induzido pelo calor Epitope Recuperação (HIER) é realizada de um tampão de recuperação 6 pH, utilizando uma caldeira de pressão (câmara de Decloaking, Biocare Médico) como fonte de calor durante 4 minutos a 125 ° C. Depois de completada a ferver, as lâminas permanecem na caldeira de pressão e são deixados arrefecer até 90 ° C. O tempo total de processamento para HIER é de aproximadamente 45 minutos. </li><li> Se nenhum resultado conclusivo é obtido no teste inicial, outros testes são feitos com base no padrão de coloração observada 5 6. Um estudo piloto, dentro do HPA de alto rendimento set-up, mostrouque a recuperação de antigénio mais útil onde HIER pH 6, mas outros métodos de recuperação, tais como pré-incubação com microondas proteinase, e destila em tampão com pH mais alto ou mais baixo pode, evidentemente, ser usado. Ao alterar a condição de IHC por exemplo, tempos de mudança de anticorpos de incubação, diluições e tempos de diaminobenzidina (DAB) de incubação do padrão de coloração pode dar resultados mais conclusivos. </li></ol> 5. Programa de coloração, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Todas as incubações são realizadas à temperatura ambiente e este protocolo pode também ser utilizado como um instalação manual com os mesmos reagentes. <ol><li> Lavar em tampão de lavagem. </li><li> A incubação com o bloco V Ultra durante 5 minutos. </li><li> Lavar em tampão de lavagem. </li><li> A incubação com anticorpo primário durante 30 minutos. </li><li> Lavar em tampão de lavagem (x2). </li><li> A incubação com peroxidase de rábano rotulado polímero durante 30 minutos. </li><li> Lavar em tampão de lavagem (x2). </li><li> Desenvolver em solução DABdurante 10 minutos. </li><li> Lavar em tampão de lavagem (x2). </li><li> Contracoloração em hematoxilina Mayers para 5 * minutos. Quando se utiliza um método de coloração progressiva (por exemplo Mayers hematoxilina) a intensidade depende do tempo e não é necessária a diferenciação. Um método de coloração regressiva por exemplo hematoxilina de Harris requer diferenciação para remover o excesso de corante dos tecidos, a fim de acentuar uma estrutura. </li><li> Enxágüe com água da torneira *. </li><li> Enxaguar em água de carbonato de lítio, diluído 1:5 a partir de uma solução saturada de 1 minuto *. </li><li> Enxágüe em água corrente por 5 minutos *. </li><li> As lâminas são desidratadas em etanol graduado e slides são as lamínulas (PERTEX, Histolab) </li></ol> Todos os reagentes são aplicados a um volume de 300 uL por lâmina. * Os Passos 10-14 são feitas em um instrumento histostaining (Autostainer XL, Leica) e lamínulas é adicionalmente feito em um sistema coverslipper (coverslipper vidro automatizada CV5030, Leica). 6. Como digitalizarum slide O método de lâminas de digitalização é dependente do scanner digital a ser utilizada, este protocolo apenas define como digitalizar uma lâmina utilizando o sistema de digitalização automatizada Aperio XT (Aperio Technologies). Na proteína Atlas Humano set-up ampliação de 20x para o tecido e 40x para as células são usadas. Digitalização automatizados poderiam encontrar problemas de focagem, devido à heterogeneidade do tecido e do número de diferentes tecidos e incluídos num TMA. <ol><li> Limpe a lâmina de vidro de cola, sujeira e verificar se há bolhas de ar entre as lamelas e da seção. Em caso de bolhas de ar remontar o slide. </li><li> Coloque o slide em um rack e colocar o suporte no scanner digital. O tempo de varredura de uma TMA com ampliação de 20x é de aproximadamente 6 minutos. Um software de Aperio é usado para selecionar área de interesse. Seleção de ponto de foco é feito automaticamente dentro do software. Manualmente seleção de área de digitalização e pontos de foco também é possível. </li><li> Após a imagem hcomo foi gerado pode ser usado para a avaliação e anotação da coloração IHC. As imagens permanecem como um arquivo de resultado da experiência e pode ser distribuído aos colegas para o debate, ainda utilizado para publicação dos dados. As imagens podem ser visualizadas em um software disponível gratuitamente Aperio. </li></ol> 7. Como procurar sua proteína favorita no Atlas proteína humana <ol><li> Navegue até <a href="http://www.proteinatlas.org." target="_blank">www.proteinatlas.org.</a> </li><li> Digite o nome de sua proteína favorita, Ensembl ID, número de acesso UniProt ou insulina por exemplo HGNC nome. </li><li> Entre na página de resumo e desloque-se para o tecido normal e resumo do órgão. A visão geral mostra a expressão da proteína no pâncreas. </li><li> Clique em &quot;mais dados de tecidos&quot;. Você entra nos tecidos normais ver onde você pode ver todos os tecidos incluídos ordenadas por órgão. </li><li> Clique no pâncreas para ver os resultados da IHQ para 3 anticorpos dirigidos para a mesma proteína. Para visualizar um oigh-resolução de imagem de pâncreas clique na imagem. </li><li> Mais informações sobre a expressão da proteína no tecido de câncer, as células e validação de dados complementares no Atlas Proteína humana pode ser encontrada pela procura da proteína humana website Atlas. </li></ol> 8. Os resultados representativos Animação 1. Como preparar os tecidos para a produção de tissue microarray. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_1_Web.mov" target="_blank">Clique aqui para ver uma animação</a> . Animação 2. Como TMAs seção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_2_Web.mov" target="_blank">Clique aqui para ver a animação 2</a> . 3 Animação. A técnica de imuno-histoquímica é descrito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_3_Web.mov" target="_blank">Clique aqui para ver a animação 3</a> .<img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema geral do processo dentro da Human Protein Atlas Uppsala. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig2.jpg" /> Figura estilete Doador 2. Marcado para o comprimento normalizado de núcleos de tecidos, por exemplo, 4,5 mm. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig3.jpg" /> Figura 3. Microarrayer tecido Manual. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig4.jpg" /> Figura 4. Exemplos de qualidade diferente de TMAs produzidos. (A) Um. Recta e devidamente alinhados TMA com espaço suficiente entre as linhas e colunas, bem como para a borda da parafina (B) Um TMA com alguns dos núcleos demasiado perto da borda resultando em prováveis ​​dificuldades quando seccionamento. (C) Um TMA que tenham sido cozido para too tempo, resultando em uma TMA colapso sem o modelo correto. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig5.jpg" /> Figura 5. Hematoxilina e eosina TMAs. (A) Uma secção adequadamente cortadas com colunas rectas e alinhados e linhas. Usando uma lâmina mau ou suja pode resultar em divisão (B) ou secções comprimido (C). <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig6.jpg" /> Figura 6. Titulação de anticorpos. (A) Reação células center em linfonodo mostra um anticorpo ideal titulada resultando em uma coloração específica citoplasmática (mostrado em castanho) sem fundo. (B) A secção de tecido mostra coloração fraca. Coloração negativa ou fraco é encontrado quando a concentração de anticorpo primário é demasiado baixa, ou se a proteína alvo não está presente nos tecidos imunocoradas. (C) A secção de tecido é overstained devido ao uso de concentração demasiado elevada do anticorpo primário. A dresultados de cores arca em dificuldades que determinam a localização subcelular devido a transbordar, reatividade cruzada e falsa positividade.

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</ol>

Não temos nada a divulgar.

A imunohistoquímica é de longe a aplicação mais comumente usado para TMAs. A combinação de IHC e TMAs pode ser usado em várias configurações diferentes, o rastreio de alto rendimento, por exemplo de padrões de proteínas de expressão em tecidos 7 8 9 10 e células, estudos de descoberta de biomarcadores com base em amostras de tecido de coortes grandes 11 12 e mais biologia tumor básica estudos, incluindo diferentes fenótipos / genótipos, os estágios de diferenciação, progressão e metástase 13. Uma vantagem de usar TMAs é que o material a partir de grandes grupos podem ser analisadas de uma só vez, ambas as experiências de poupança de material biológico valioso e assegurando mais reprodutíveis. Além disso, a utilização de TMA tecnologia reduz os custos dos reagentes e tempo de processamento de laboratório. Como um TMA contém apenas uma quantidade limitada de tecido, a heterogeneidade dos tecidos é um problema. Dependendo do tipo de tecido e questões a serem tratadas, várias amostras podem ser necessários a partir do mesmo specimen. Para tecidos tumorais, a utilização de dois a quatro núcleos a partir de cada amostra é recomendada como foi mostrado para resultar em um alto grau de precisão na representação de secções de tecido inteiras 13 14. Dependendo da composição do tecido do diâmetro dos punções (variando de 0,6 mm a 2 mm) pode ser ajustada. Os tecidos são complexos e composto de ambos os vários tipos de células diferentes, estruturas e de matriz extra-celular. A composição de cada tipo de tecido diferente contendo quantidade variável de gordura, os vasos sanguíneos, tecido conjuntivo, cartilagem etc, vai afetar a pressão necessária para perfurar e coleta de núcleos separados. É, portanto, de importância para a prática de todas as etapas do procedimento em material que não é de qualquer valor, antes de produzir uma TMA com tecidos definidos para os experimentos pretendidos. Quando a secção de uma variedade de diferentes tecidos dentro de um bloco de TMA a composição do bloco poderia influenciar a capacidade de adquirir secções de alta qualidade. Cetecidos rtain, por exemplo, pele, medula óssea, do cérebro, gordura e da mama, tornar o seccionamento do bloco de TMA difícil devido ao efeito das diferenças de textura que efectuam como secções esticar no banho de água e como dureza diferente é cortado pela lâmina etc Portanto, é recomendável para os tecidos do grupo com características semelhantes, por exemplo, tecido adiposo rico em uma TMA, quando aplicável. A maioria dos tecidos de cancro são, neste sentido, homogénea, o que facilita o corte de TMAs cancerosas. Um método alternativo para a estabilização de seccionamento dos núcleos microarray pode ser empregue quando manusear uma TMA com tipos heterogéneos de tecidos. A utilização de uma fita adesiva pode ser útil para evitar a perda de núcleos e cair para fora na TMA-seccionado. A utilização de fita adesiva deve ser empregada com cautela, dado que a fita pode influenciar a espessura de núcleos, seccionados e, posteriormente, também o resultado de IHC coloração 15. No Human Protein Atlas set-up modelo de uma TMA de 9x8 (excluindo marcadores) núcleos de are utilizado. É de importância para se obter o número máximo de secções e manter todos os tecidos representados em todo o bloco. Para poupar reagentes e do tempo de digitalização, 2 secções são colocadas sobre uma lâmina de vidro, permitindo um modelo máximo de 9x8. O maior repositório de informações de proteína, 16 Universal Resource Protein inclui aproximadamente 20,300 analisadas entradas de proteínas humanas, das quais apenas aproximadamente 66% têm evidência ao nível das proteínas. Também para a maioria dos genes para os quais há evidência da existência sobre o nível de proteína, existe pouca ou nenhuma informação sobre a função da proteína e da distribuição de expressão. Um desafio importante para o futuro é analisar o padrão de distribuição e abundância relativa destas proteínas desconhecidas em vários tipos de tecido humano. A informação a partir de bases de dados tais como UniProt, Ensembl, os dados publicados de PubMed pode ser utilizado como um guia para determinar se os padrões de coloração imuno-histoquímica utilizando anticorpos paraenfermarias proteínas desconhecidas representam perfis de proteínas reais da proteína alvo pretendido. Além disso, várias estratégias de validação outros são necessários para garantir a funcionalidade de anticorpos, por exemplo, a funcionalidade de anticorpos em matrizes de proteína, Western blot, imunofluorescência, imuno-precipitação e pull-down experimentos. Talvez o mais importante ferramenta para a validação da funcionalidade do anticorpo é a utilização de anticorpos emparelhados, isto é, dois anticorpos diferentes criado contra separados, não sobrepostos epítopos na proteína alvo mesmo, para comparar-ensaio específico resultado 17. Com base na informação recolhida, os anticorpos são testadas e ajustadas de acordo com padrões de IHC e da experiência de testar e validar mais de 35.000 anticorpos no projeto Human Protein Atlas. Durante mais de 20% de todos os genes com perfis de proteínas, os dados de anticorpos emparelhados (2 ou mais anticorpos em relação de não sobreposição epítopos sobre a mesma proteína) tem sido usado para determinar uma melhor estimativacompanheiro do padrão correspondente expressão da proteína. Anticorpos emparelhados proporcionar uma estratégia final para a validação específicas imunohistoquímica baseados padrões de expressão de proteínas. Esta estratégia é valiosa porque a multidão de diferentes tecidos incluídos na seleção de base aumenta o risco de reatividade cruzada. Deve também ser notado que certos tecidos são em geral mais propenso a mostrar fundo coloração macrófagos por exemplo, músculo liso, túbulos distais no rim e hepatócitos no fígado. Outras questões a considerar incluem variações de técnicas de processamento de tecidos ao longo do tempo para os tecidos retirados de material de arquivo, que pode resultar em falsos negativos ou positivos inadequado padrões de coloração IHQ. Este fenômeno também é encontrado na análise de grande parte. Controles negativos e positivos são vitais e devem ser usados ​​sempre que possível. Para estudos mais aprofundados, incluindo análises funcionais, linhas de células com expressão forçada e específica knock-down de tr correspondentesanscripts (tecnologia siRNA) pode ser usado para criar controles. Para melhores resultados em IHC, é importante para testar e utilizar sistemas de recuperação de antigénio, uma vez que a fixação de formalina induz modificações químicas diferentes, por exemplo, de ligação cruzada, a hidrólise de bases de Schiff de mascaramento do antigénio 18. Em conclusão, baseados em anticorpos proteômica empregando tecnologia e TMA IHC é uma estratégia eficaz para gerar dados de expressão de proteínas em grande escala. The Human Protein Atlas projeto foi criado para criar um mapa de expressão da proteína humana em tecidos humanos normais e cancerosas. O objetivo deste projeto é apresentar um primeiro esboço de um Atlas Proteína abrangente Humano até 2015. Além de fornecer perfis de proteína em órgãos e tecidos normais, esse esforço também fornece um ponto de partida para projectos de investigação biomédica, incluindo esforços de descoberta de biomarcadores clínicos. O objetivo final é adicionar uma camada de informação seguinte no topo da seqüência do genoma humano que wivai ser crucial para uma compreensão mais profunda da biologia subjacente a vários estados de doença, e fornecer uma base para o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico e terapêutica.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> O tampão de lavagem </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-999-TT </td></tr><tr><td> Tampão citrato pH 6 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-250-Pm1X </td></tr><tr><td> Diluente anticorpo </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UD </td></tr><tr><td> UltraVision LP HRP polímero </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> DAB sistema de substrato mais </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-HDX </td></tr><tr><td> Ultra V Bloco </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UB </td></tr><tr><td> Anticorpo primário-Enhancer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td> Mayers hematoxilina </td><td> Histológicoab </td><td> 01820 </td></tr><tr><td> PERTEX </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Nome do equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Manual de tecido micro arrayer </td><td> Estigen, Instrumento Beecher </td><td> MTA-1 </td></tr><tr><td> Cachoeira micrótomo </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Microm HM 355S </td></tr><tr><td> Scanner de imagem automatizado </td><td> Aperio Technologies </td><td> XT </td></tr><tr><td> Sistema de coloração automática corrediça </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Autostainer 480S-2D </td></tr><tr><td> Sistema automático de imunoistoquímica slide para desparafinização e desidratação </td><td> Leica Biosystems </td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td> Coverslipper vidro automatizada </td><td> Leica Biosfo r </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Câmara Decloaking </td><td> Biocare Medical </td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

produção de microarrays tecido, de coloração imuno-histoquímica e de digitalização dentro do atlas proteína humana

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

O tecido microarray tecnologia (TMA) fornece os meios para alto rendimento análise de múltiplos tecidos e células. A técnica é utilizada dentro do projecto da proteína humana Atlas para análise global de padrões de proteínas de expressão em tecidos humanos normais, o cancro e linhas celulares. Aqui apresentamos a montagem de núcleos de 1 mm, recuperados de tecidos representativos microscopicamente selecionados, em um único bloco receptor TMA. O número e tamanho dos núcleos em um bloco de TMA pode ser variado de aproximadamente 40 mm 2 núcleos para centenas de 0,6 mm núcleos. A vantagem de usar TMA tecnologia é que grande quantidade de dados pode rapidamente ser obtido usando um protocolo de imunocoloração único para evitar a variabilidade experimental. Importante, apenas a quantidade limitada de tecido de escassos, é necessário, o que permite a análise de coortes de pacientes grandes 1 2. Aproximadamente 250 secções consecutivas (4 mm de espessura) pode ser cortado a partir de um bloco de TMA e utilizado para imuno-histoquímica staining para determinar os padrões de expressão específicos de proteína por 250 anticorpos diferentes. No ser humano projecto Proteína Atlas, os anticorpos são gerados para todas as proteínas humanas e usada para adquirir perfis de proteínas correspondentes em ambos os tecidos humanos normais a partir de 144 indivíduos e tecidos cancerosas de 216 pacientes diferentes, que representam as 20 formas mais comuns de cancro humano. Seções imunohistoquímica, TMA em lâminas de vidro são digitalizados para criar imagens de alta resolução a partir do qual podem interpretar os patologistas e anotar o resultado da imuno-histoquímica. Imagens juntamente com os correspondentes dados baseados em patologia de anotação são feitas publicamente disponível para a comunidade de pesquisa através da Human Protein Atlas portal ( <a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ) (Figura 1) 3 4. O Atlas proteína humana fornece um mapa mostrando a distribuição e abundância relativa das proteínas no corpo humano. A versão atualSion contém mais de 11 milhões de imagens com dados de proteínas de expressão para 12.238 proteínas únicas, correspondentes a mais de 61% de todas as proteínas codificadas pelo genoma humano.

Tissue microarrays permite a um método eficiente para obter informações simultâneas a partir de uma infinidade de tecidos. Partes representativas de tecidos são montados em um único bloco de parafina. Secções do bloco são utilizados para imuno-histoquímica e análise dos padrões de expressão da proteína. Escaneamento digital gera imagens correspondentes para distribuição de dados.

Produção de Microarrays Tecido, de coloração imuno-histoquímica e de digitalização Dentro do Atlas proteína humana

A tecnologia de microarranjo de tecidos (TMA) fornece os meios para a análise de alto rendimento de múltiplos tecidos e células. A técnica é utilizada no âmbito do...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar um método eficiente para obter simultaneamente informações de múltiplos tecidos quanto à expressão proteica em um projeto de alto rendimento, como o atlas de proteínas humanas. Isso é realizado primeiramente pela seleção de áreas representativas de tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina. Em seguida, as áreas marcadas são perfuradas e os cilindros selecionados são montados em um único bloco de parafina, formando uma matriz de microarranjos de tecidos.Em seguida, são cortadas seções do MAT e é realizada a imunohistoquímica. Por fim, o padrão de expressão proteica é analisado e os dados são publicados no atlas de proteínas humanas. Em última instância, podem ser obtidos resultados que mostram a expressão proteica em tecidos e células por meio de microarranjos de tecidos e imunohistoquímica.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a realização de imunohistoquímica a partir de blocos individuais de tecido parafinado, é que é possível economizar material biológico valioso e os experimentos são mais reprodutíveis. Outra vantagem desta técnica é que é possível reduzir os custos de ENT, bem como o tempo de processamento laboratorial. Demonstrando este procedimento será Ian call Bay, um técnico de laboratório do meu laboratório, para obter um comprimento padronizado dos núcleos de tecido.Marque o estilete. Recomenda-se deixar margens de 2,5 a 3,0 milímetros em cada lado do bloco de parafina para evitar rachaduras na parafina ao montar as brocas adequadas. Solte os parafusos de encaixe sextavados que prendem a broca no lugar e posicione a broca de modo que o entalhe no cubo da broca fique firmemente encostado na haste metálica do bloco em V de plástico.Aperte os parafusos, certificando-se de que a borda do clipe metálico esteja horizontal. Insira o punção receptor à esquerda e o punção doador à direita. Utilize os botões de ajuste XY e suas leituras digitais micrométricas para mover os punções ao longo dos eixos X e Y.Para redefinir a máquina, pressione o botão zero a BS para alternar entre polegadas e milímetros, pressione o botão polegada milímetro. Ao usar um furador de um milímetro para um molde de nove por oito, o espaço entre os orifícios deve ser de dois milímetros, medidos entre os centros dos orifícios, para evitar empurrar o furador receptor muito para baixo e danificá-lo. Defina a profundidade máxima para empurrar o furador colocando um cassete vazio no suporte e utilizando o parafuso de limitação de profundidade no canto superior esquerdo do guia Z. Ajuste a posição inferior do furador receptor a um milímetro acima do fundo do cassete. Após selecionar e marcar a área relevante em uma seção de tecido e projetar um molde para a produção de microarranjo de tecidos, coloque o bloco receptor no suporte e use a chave de fenda menor para apertar os parafusos.Evite apertar em excesso os parafusos para impedir que a parafina se solte do cassete. Empurre o ponteiro receptor cerca de cinco milímetros para baixo no bloco receptor e use o cabo do ponteiro para girá-lo para frente e para trás. Em seguida, libere lentamente a pressão para baixo, permitindo que as molas levantem o ponteiro.Use o estilete para esvaziar o furo e descartar o núcleo de parafina. Em seguida, mova a torreta para alternar para o furo doador. Depois, posicione a ponte do bloco doador com o bloco doador sobre o suporte do bloco receptor.Utilize um lâmina correspondente corada com hematoxilina e eosina em que a região de interesse tenha sido marcada para localizar o tecido que será amostrado. Segure manualmente o bloco doador na posição com a mão esquerda e empurre a punção com a mão direita. Não empurre o estilo. O limitador de profundidade não impede o movimento da punção na posição correta para o bloco doador, portanto é importante interromper o empurrão quando a segunda marca for visível no estilo.Gire o manípulo da punção uma vez lentamente. Libere a pressão descendente mantendo ainda o bloco doador sobre a ponte do bloco doador. Remova a ponte e o bloco doador.Certifique-se de que a fresa doador esteja alinhada com o orifício feito anteriormente. Ajuste a posição da fresa utilizando os parafusos de ajuste. Se a fresa doadora e o orifício no bloco receptor não estiverem alinhados, empurre cuidadosamente a fresa para baixo até que sua ponta alcance o topo do orifício no bloco receptor.Enquanto mantém essa posição, use o estiloide para esvaziar o fragmento de tecido no orifício. A superfície do fragmento deve estar alinhada com a superfície do bloco. Retorne a torreta para a punção receptora.Mova para a próxima posição usando os botões de ajuste XY e repita o processo novamente, perfurando uma amostra do bloco receptor até que o arranjo esteja completo. Para remover o bloco receptor, afrouxe os parafusos no suporte. Coloque o bloco com a face voltada para baixo sobre uma lâmina de vidro posicionada em uma grade apropriada e aqueça o bloco a 42 graus Celsius por 40 minutos.Retire a lâmina e o bloco do forno e alise a superfície do bloco passando suavemente a lâmina de vidro. Coloque o bloco com a lâmina de vidro sobre uma placa de resfriamento por 10 minutos. Remova a lâmina de vidro do bloco.O bloco agora está finalizado e pronto para o corte em seções. Após o corte, realize a coloração e a digitalização da matriz de microarranjos de tecidos com um anticorpo contra uma proteína de interesse. Procure pela proteína no Atlas da Proteína Humana acessando o site www.proteinatlas.org.Digite o nome de um conjunto de proteínas de interesse, número de acesso UniProt, ou o nome HGNC, por exemplo, insulina. Clique na proteína de interesse e role para baixo até o resumo de tecidos e órgãos normais. A visão geral mostra a expressão proteica no pâncreas.Clique na guia. Mais dados de tecidos. A visualização dos tecidos normais organizada por órgão será exibida.Clique no pâncreas para visualizar os resultados da IHC para três anticorpos direcionados à mesma proteína. Clique em uma imagem para ver uma imagem de alta resolução do pâncreas. Nesta figura, são mostrados exemplos da qualidade de microarranjos de tecidos: um arranjo reto e adequadamente alinhado, com espaço suficiente entre as linhas e colunas e a borda da parafina. Aqui, alguns dos núcleos estão muito próximos da borda, o que provavelmente resultará em problemas durante o corte.Esta microarrumação de tecidos foi assada por tempo excessivo e colapsou sem o molde correto. Aqui, uma seção cortada adequadamente, com colunas retas e alinhadas, foi corada com hematoxilina, eosina e tioina. Uma lâmina inadequada ou suja pode resultar em divisão, como mostrado aqui, ou em seções comprimidas como esta.Células do centro germinativo em n&oacute;dulos linf&aacute;ticos mostram um anticorpo titulado de forma ideal, resultando em uma marca&ccedil;&atilde;o citoplasm&aacute;tica espec&iacute;fica sem fundo, como visto aqui. A marca&ccedil;&atilde;o negativa ou fraca ocorre quando a concentra&ccedil;&atilde;o do anticorpo prim&aacute;rio &eacute; muito baixa ou se a prote&iacute;na-alvo n&atilde;o est&aacute; presente nos tecidos imunomarcados. Esta se&ccedil;&atilde;o de tecido est&aacute; excessivamente marcada devido &agrave; alta concentra&ccedil;&atilde;o do anticorpo prim&aacute;rio.A cor escura resulta em dificuldades na determinação da localização subcelular devido a vazamento, reatividade cruzada e positividade falsa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir um arranjo de marcadores teciduais e como utilizá-lo ao analisar a expressão proteica realizando imunohistoquímica. Você também deverá ter uma boa compreensão de como navegar no atlas de proteínas humanas para verificar a expressão proteica em tecidos e células humanas.

production-tissue-microarrays-immunohistochemistry-staining

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O protocolo visa à otimização da construção e qualidade de microarrays de tecido para pesquisa com biomarcadores. Ele inclui aspectos do planejamento e design, patologia digital anotação de slides virtual, e arraying tecido automatizado.

A próxima geração de tissue microarray (ngTMA) Protocolo de Estudos biomarcadores

A imuno-histoquímica é uma poderosa técnica de laboratório para avaliar a localização e expressão de proteínas nos tecidos. Os métodos semiautomatizados atuais de quantificação introduzem subjetividade e muitas vezes criam resultados irreproduzíveis. Aqui, descrevemos métodos para imuno-histoquímica multiplexada e quantificação objetiva da expressão e co-localização de proteínas usando imagens multiespectrais.

A quantificação da expressão da proteína e co-localização Usando multiplexada Imuno-histoquímica Coloração e Multispectral Imagiologia

Um protocolo detalhado para um painel de seis-marcador multiplex imunofluorescência é otimizado e executado, usando um corante automatizado para resultados mais consistentes e um menor tempo de procedimento. Esta abordagem pode ser adaptada directamente por qualquer laboratório de estudos imuno-oncologia.

Painel de imunofluorescência Multiplex automatizada para estudos imuno-oncologia em amostras de Carcinoma fixada em formol

A proteína de interação ZW10 (ZWINT) participa no ponto de verificação mitotic do eixo e na patogénese da carcinoma. Aqui, apresentamos uma metodologia de imunocoloração de ZWINT em tecidos de câncer de pulmão humano, seguido pela digitalização digital de slides inteiros e análise de imagem. Esta metodologia pode fornecer imagens digitais de alta qualidade e resultados confiáveis.

Análise digital de imunocoloração da proteína ZW10 interagindo em tecidos pulmonares humanos

Aqui, descrevemos uma estratégia simples e acessível para visualizar, quantificar e mapear células imunes em seções de tecido tumoral parafina fixada em formalina. Essa metodologia combina técnicas de imagem e análise digital existentes com o objetivo de ampliar a capacidade de multiplexação e a análise multiparâmetro de ensaios de imagem.

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Aqui, descrevemos um protocolo para ajuste fino de regiões de interesse (ROIs) para tecnologias de Ômica Espacial para melhor caracterizar o microambiente tumoral e identificar populações celulares específicas. Para ensaios proteômicos, protocolos personalizados automatizados podem orientar a seleção de ROI, enquanto os ensaios transcriptômicos podem ser ajustados utilizando ROIs tão pequenos quanto 50 μm.

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Neste artigo, um protocolo para amplificação manual do sinal de tiramida (TSA) por imunofluorescência multiplex (mIF) combinado com análise de imagem e análise espacial é descrito. Este protocolo pode ser usado com cortes fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) para a coloração de dois a seis antígenos por lâmina, dependendo do scanner de lâminas disponível no laboratório.

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Ensaio de Imunofluorescência Multiplexada para Avaliação Espacial de Marcadores de Senescência in vivo

Aprenda a produzir microarrays de tecido para análise de expressão proteica usando imuno-histoquímica e digitalização. Este método padronizado permite estudos de alta vazão integrados ao Atlas de Proteínas Humanas.

Produção de Microarrays Tecido, de coloração imuno-histoquímica e de digitalização Dentro do Atlas proteína humana

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