Produção de Microarrays Tecido, de coloração imuno-histoquímica e de digitalização Dentro do Atlas proteína humana
31 de maio de 2012
Tissue microarrays permite a um método eficiente para obter informações simultâneas a partir de uma infinidade de tecidos. Partes representativas de tecidos são montados em um único bloco de parafina. Secções do bloco são utilizados para imuno-histoquímica e análise dos padrões de expressão da proteína. Escaneamento digital gera imagens correspondentes para distribuição de dados.
O objetivo geral deste procedimento é utilizar um método eficiente para obter simultaneamente informações de múltiplos tecidos sobre a expressão proteica em um projeto de alto rendimento, como o atlas de proteínas humanas. Isso é realizado primeiramente pela seleção de áreas representativas de tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina. Em seguida, as áreas marcadas são perfuradas e os cilindros selecionados são montados em um único bloco de parafina, formando uma matriz de microarranjos de tecidos.
Em seguida, são feitos cortes a partir da matriz de microarranjos de tecidos (TMA) e é realizada a imuno-histoquímica. Por fim, o padrão de expressão proteica é analisado e os dados são publicados no atlas de proteínas humanas. Em última instância, podem-se obter resultados que mostram a expressão proteica em tecidos e células por meio de microarranjos de tecidos e imuno-histoquímica.
A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a realização de imunohistoquímica a partir de blocos individuais de tecido parafinado, é que o material biológico valioso pode ser preservado e os experimentos tornam-se mais reprodutíveis. Outra vantagem desta técnica é que é possível reduzir os custos de ENT, bem como o tempo de processamento laboratorial. Demonstrando este procedimento será Ian Call Bay, um técnico de laboratório do meu laboratório, para obter um comprimento padronizado dos núcleos de tecido.
Marque o estilete. Recomenda-se deixar margens de 2,5 a 3,0 milímetros em cada lado do bloco de parafina para evitar rachaduras na parafina ao montar as brocas adequadas. Solte os parafusos de encaixe sextavados que prendem a broca no lugar e posicione a broca de modo que o entalhe no cubo da broca fique firmemente encostado na haste metálica do bloco em V de plástico.
Aperte os parafusos, certificando-se de que a borda do clipe metálico esteja horizontal. Insira o punção receptor à esquerda e o punção doador à direita. Utilize os botões de ajuste XY e suas leituras micrométricas digitais para mover os punções ao longo dos eixos X e Y.
Para redefinir a máquina, pressione o botão zero e o botão BS para alternar entre polegadas e milímetros, pressione o botão polegada-milímetro. Ao usar um punção de um milímetro para um molde de nove por oito, o espaço entre os orifícios deve ser de dois milímetros, medidos entre os centros dos orifícios, para evitar empurrar o punção receptor muito para baixo e danificá-lo. Defina a profundidade máxima para empurrar o punção colocando uma cassete vazia no suporte e usando o parafuso de limitador de profundidade no canto superior esquerdo do guia Z. Ajuste a posição inferior do punção receptor a um milímetro acima do fundo da cassete. Após selecionar e marcar a área relevante em uma seção de tecido e projetar um molde para a produção de microarranjos de tecidos, coloque o bloco receptor no suporte e use a chave de fenda menor para apertar os parafusos.
Evite apertar excessivamente os parafusos para prevenir que a parafina se solte do cassete. Empurre a broca receptora cerca de cinco milímetros para baixo no bloco receptor e use o cabo da broca para girá-la para frente e para trás. Em seguida, alivie lentamente a pressão para baixo, permitindo que as molas levantem a broca.
Use o estilete para esvaziar o furo e descartar o núcleo de parafina. Em seguida, mova a torreta para trocar para o furo doador. A seguir, posicione a ponte do bloco doador com o bloco doador sobre o suporte do bloco receptor.
Utilize uma lâmina corada com hematoxilina e eosina correspondente, na qual a região de interesse tenha sido marcada, para localizar o tecido que será amostrado. Segure manualmente o bloco doador na posição com a mão esquerda e empurre a broca com a mão direita. Não empurre o estilete. O limitador de profundidade não impede o movimento da broca na posição correta para o bloco doador, portanto é importante interromper o empurrão quando a segunda marca for visível no estilete.
Gire lentamente o manípulo do furador uma vez. Solte a pressão descendente mantendo ainda o bloco doador sobre a ponte do bloco doador. Remova a ponte e o bloco doador.
Certifique-se de que o perfurador doador está alinhado com o orifício feito anteriormente. Ajuste a posição do perfurador utilizando os parafusos de fixação. Se o perfurador doador e o orifício no bloco receptor não estiverem alinhados, empurre cuidadosamente o perfurador para baixo até que sua ponta atinja o topo do orifício no bloco receptor.
Mantendo esta posição, utilize o estiloide para esvaziar o fragmento de tecido no orifício. A superfície do fragmento deve estar alinhada com a superfície do bloco. Retorne a torreta para a punção receptora.
Mova-se para a próxima posição com os botões de ajuste XY e repita novamente o processo perfurando uma amostra do bloco receptor até que o arranjo esteja completo. Para remover o bloco receptor, solte os parafusos no suporte. Coloque o bloco com a face voltada para baixo sobre uma lâmina de vidro posicionada em um suporte apropriado e aqueça o bloco a 42 graus Celsius por 40 minutos.
Retire o lâmina e o bloco do forno e nivele a superfície do bloco passando suavemente a lâmina de vidro. Coloque o bloco com a lâmina de vidro sobre uma placa de resfriamento por 10 minutos. Remova a lâmina de vidro do bloco.
O bloco agora está finalizado e pronto para o corte em seções. Após o corte, realize a coloração e a digitalização da matriz de microarranjos de tecidos com um anticorpo contra uma proteína de interesse. Procure pela proteína no Atlas da Proteína Humana acessando o site www.proteinatlas.org.
Digite o nome de um conjunto de proteínas de interesse, número de acesso UniProt, ou o nome HGNC, por exemplo, insulina. Clique na proteína de interesse e role para baixo até o resumo de tecidos e órgãos normais. A visão geral mostra a expressão proteica no pâncreas.
Clique na aba. Mais dados de tecidos. A visualização dos tecidos normais organizada por órgão será exibida.
Clique no pâncreas para visualizar os resultados da IHC para três anticorpos direcionados à mesma proteína. Clique em uma imagem para ver uma imagem de alta resolução do pâncreas. Nesta figura, são mostrados exemplos da qualidade de microarranjos de tecidos: um arranjo reto e adequadamente alinhado, com espaço suficiente entre as linhas e colunas e a borda da parafina. Aqui, alguns dos núcleos estão muito próximos da borda, o que provavelmente resultará em problemas durante o corte em microtomo.
Esta matriz de microarranjo de tecidos foi assada por tempo excessivo e colapsou sem o molde correto. Aqui, uma seção adequadamente cortada, com colunas retas e alinhadas, foi corada com hematoxilina, eosina e ácido tioínico. Uma lâmina inadequada ou suja pode resultar em fissuras, como mostrado aqui, ou em secções comprimidas como esta.
Células do centro germinativo em linfonodos mostram um anticorpo titulado de forma ideal, resultando em uma marcação citoplasmática específica sem fundo, como visto aqui. Coloração negativa ou fraca é observada quando a concentração do anticorpo primário é muito baixa ou se a proteína-alvo não está presente nos tecidos imunomarcados. Esta seção de tecido está excessivamente marcada devido à concentração muito alta do anticorpo primário.
A cor escura resulta em dificuldades para determinar a localização subcelular devido a derramamento, reatividade cruzada e positividade falsa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir um arranjo de marcadores teciduais e como utilizá-lo ao analisar a expressão proteica por meio de imunohistoquímica. Você também deverá ter uma boa compreensão de como navegar no Atlas de Proteínas Humanas para verificar a expressão proteica em tecidos e células humanas.
Visão Geral
As microarranjos de tecidos fornecem um método eficiente para reunir informações simultâneas de múltiplos tecidos para análise da expressão proteica. Esta técnica envolve a montagem de amostras representativas de tecidos em um único bloco de parafina, que é então seccionado para imuno-histoquímica e imagem digital.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Histologia
Contexto
- As matrizes de microarranjos de tecidos permitem a análise de alto rendimento da expressão proteica.
- Este método conserva material biológico em comparação com os métodos tradicionais de bloco único de tecido.
- Ele aumenta a reprodutibilidade e reduz custos e tempo de processamento.
- Os dados gerados podem ser integrados em recursos como o Atlas da Proteína Humana.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o procedimento de criação de microarranjos de tecidos.
- Analisar os padrões de expressão proteica em diversos tecidos.
- Fornecer um método padronizado para análise de tecidos em alto rendimento.
Métodos Utilizados
- Seleção e marcação de áreas representativas de tecidos embebidos em parafina.
- Perfuração de núcleos de tecido e montagem em um bloco de microarranjo de tecidos.
- Realização de imunohistoquímica em cortes do microarranjo.
- Análise dos padrões de expressão proteica e publicação dos resultados.
Resultados Principais
- Montagem bem-sucedida de matrizes de microarranjos de tecidos para análise de proteínas.
- Demonstração da reprodutibilidade e eficiência em estudos de expressão proteica.
- Integração dos achados no Atlas da Proteína Humana.
- Representação visual de padrões de expressão proteica por meio de imagem digital.
Conclusões
- As microarranjos de tecidos são uma ferramenta valiosa para a análise de expressão proteica de alto rendimento.
- Este método melhora a eficiência e conserva amostras biológicas.
- Os resultados contribuem para uma melhor compreensão da distribuição de proteínas nos tecidos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A tecnologia de microarranjos de tecidos permite a análise de expressão proteica em alto rendimento, conservando material biológico escasso, e apoiando esforços de validação de alvos em larga escala na descoberta de fármacos. Ao integrar dados em recursos públicos como o Atlas da Proteína Humana, ela fornece uma base escalável para a desmistificação mecanicista e a identificação de biomarcadores translacionais em diversas áreas de doenças. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva na fase inicial da descoberta, gerando perfis reprodutíveis e quantitativos de expressão proteica a partir de amostras limitadas de pacientes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em tecidos normais e doentes para esclarecer os padrões de expressão do alvo.
- Valor Operacional: Reduz o consumo de amostras biológicas ao mesmo tempo que aumenta a produtividade em campanhas de triagem de anticorpos ou alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao fornecer evidências precoces de especificidade do alvo e distribuição tecidual.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras padronizadas e quantitativas de imunohistoquímica para avaliar a especificidade de reagentes em centenas de núcleos de tecido.
- Valor Operacional: Permite condições de ensaio reprodutíveis utilizando um único protocolo de coloração, minimizando a variabilidade experimental em telas de larga escala.
- Valor da Plataforma: Cria blocos reutilizáveis de microarranjo para perfis longitudinais de painéis de proteínas em coortes de doenças.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao analisar a expressão proteica em tecidos tumorais de coortes bem anotadas de pacientes.
- Valor Operacional: Facilita a validação de biomarcadores por meio do corte consistente e da imagem digital de seções de TMA.
- Valor Traducional: Apoia o avanço ajustado ao risco ao vincular a expressão do alvo a dados de patologia clínica em bancos de dados públicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A produção de microarranjos de tecidos insere-se no continuum de descoberta, desde a identificação de alvos até a validação pré-clínica, permitindo o perfilhamento eficiente da expressão proteica em larga escala.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a análise simultânea da expressão proteica em diversos tipos de tecidos e estados patológicos.
- Triagem: Fornece cortes de tecido prontos para ensaio e reprodutíveis, adequados para campanhas de triagem de imuno-histoquímica de alto rendimento.
- Análises: Gera dados quantificáveis de expressão proteica por meio de análise digital de imagens, permitindo a avaliação comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à continuidade pré-clínica por meio de mapas de expressão proteica associados a amostras de pacientes anotadas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada e escalável para uso repetido em múltiplos projetos de validação de anticorpos e caracterização de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio de análise tecidual multiplexada.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a padronização entre laboratórios ao minimizar a variabilidade entre lâminas.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao maximizar o rendimento de dados a partir de amostras clínicas ou pré-clínicas limitadas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização baseada em risco de alvos com base em perfis abrangentes de expressão em tecidos normais e doentes.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em histologia, manipulação de tecidos e técnicas de montagem de microarranjos.
- Depende de instrumentação de precisão para perfuração de núcleos, alinhamento e corte.
- Necessita de protocolos padronizados para coloração, obtenção de imagens e anotação de dados para garantir a comparabilidade entre estudos.
- Envolve considerações de adaptação ao ser aplicado a diversos sistemas modelo ou tecidos não humanos.
- Inclui limitações práticas relacionadas ao alinhamento de núcleos, integridade das seções e otimização da coloração, conforme observado nas demonstrações do procedimento.
