Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar uma avaliação rápida da função gênica no desenvolvimento do córtex cerebral utilizando fatias organotípicas. Isso é conseguido pela introdução de plasmídeos, coex, expressando RNA inibitório e um marcador GFP no córtex cerebral murino. Breves pulsos elétricos são aplicados ao cérebro, permitindo que o DNA plasmidial transfecte as células progenitoras neuronais.

Em seguida, os cérebros são dissecados, embutidos e seccionados para produzir fatias organotípicas que podem passar por morfogênese neuronal ex vivo. As fatias organotípicas podem ser examinadas em busca de subpopulações de neurônios corticais com defeitos migratórios ou morfológicos mediante a observação direta das células marcadas com GFP. Olá, bem-vindos ao meu laboratório na Universidade Brown, no departamento de biologia molecular. Hoje, a Dra. Liza e dois estudantes, Kat Zer e Mark Seba, demonstrarão a técnica de eletroporação ex vivo e o cultivo de fatias organotípicas, uma técnica muito útil para estudos de neurodesenvolvimento.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em diversos aspectos do desenvolvimento neural, incluindo neurogênese, migração neuronal e morfogênese neuronal. Como essa análise é realizada em uma aproximação próxima ao ambiente IBU, ela fornece uma alternativa de baixo custo e rápida à geração de animais transgênicos ou com genes knockout para genes de função desconhecida. Por fim, em comparação com a tecnologia de eletroporação in vivo, o sucesso desses experimentos de eletroporação in vivo não depende de cirurgia qualificada, desenvolvimento de habilidades especializadas e pode ser realizado com um período de treinamento mais curto e menor exigência de habilidade.

Após eutanasiar um camundongo fêmea grávida, dissecar os embriões em HBSS completo gelado, mantendo-os em suas bolsas placentárias individuais. Em seguida, na solução de HBSS fria, liberar um embrião da bolsa e cortar sua cabeça após a primeira vértebra para uma injeção, colocar a cabeça sobre um pedaço de papel de paraform em cima de uma placa de Petri usando uma seringa Hamilton personalizada. Injetar seis a oito microlitros da mistura de DNA com verde rápido através do terceiro ventrículo.

A partir daí, a mistura preencherá ambos os ventrículos laterais nas vesículas corticais. Para a eletroporação, são utilizados eletrodos de platina em forma de pinça BTX. Posicione o eletrodo positivo voltado para o lado do córtex que será eletroporado.

Por exemplo, o eletrodo deve ser posicionado no topo da cabeça para o córtex dorsal. Para obter alta eficiência de transfeção, ajuste sempre a concentração de DNA para um micrograma por microlitro e utilize DNA isolado a partir de um preparo Maxi. Se necessário, utilize um kit livre de endotoxinas para purificar o DNA após a eletroporação.

Incube a cabeça no gelo por pelo menos cinco minutos antes de dissecá-la. É muito importante usar a quantidade correta de pulsos elétricos e corrente ao realizar a eletroporação para evitar danificar os cérebros embrionários mais jovens. Após a eletroporação, o tecido torna-se muito frágil.

É importante realizar as dissecações com muita cautela, pois a pele e o crânio podem puxar as meninges das vesículas corticais, o que pode danificar as vesículas corticais ao removê-las do crânio. Após cinco minutos, dissecar o cérebro em meio frio. HBSS começa-se fazendo uma pequena incisão na lateral da cabeça e destacando a pele das laterais do crânio.

Em seguida, com pinças finas, retire suavemente a pia do cérebro. Remova o cérebro intacto do crânio. Ao finalizar, mantenha o cérebro em HBSS gelado e prepare-se para embutir o tecido.

Comece a encher as moldes com ponto de fusão baixo a 3%.Agros. Coloque as moldes sobre gelo para que o agros solidifique próximo à base da molde. Primeiro, certifique-se de que os cérebros permaneçam suportados e centralizados.

Agora, com pinças finas, remova cuidadosamente um cérebro do HBSS, absorva o excesso de tampão com um lenço de papel kim ou papel filtro e coloque o cérebro no ponto de fusão baixo. Agros. Em seguida, use a ponta de uma pipeta para girar o cérebro dentro do molde, maximizando o contato entre o agros e o tecido. Com todos os cérebros transferidos, posicione cada cérebro aproximadamente na mesma orientação e profundidade dentro do respectivo molde.

Os aros irão solidificar em cerca de cinco minutos. Portanto, trabalhe rapidamente. Deixe os aros solidificarem completamente incubando por mais cinco minutos em gelo.

Retire o excesso de aros antes de montar os blocos. Em seguida, fixe os blocos de agros uns aos outros usando um adesivo plástico de secagem rápida, posicionando cada cérebro em uma pilha com os bulbos olfativos voltados para cima. Uma vez que os blocos estejam fixados, aparar os aros para garantir que cada cérebro seja cortado pelo vibrátomo.

Em seguida, mergulhe-os imediatamente em HBSS gelado. Para cortar os blocos, ajuste a velocidade do vibrátomo para uma velocidade baixa, cerca de metade do máximo, e defina a frequência de vibração da lâmina na configuração mais alta. Em seguida, gere cortes coronais com espessura de 250 mícrons, recupere os cortes usando uma espátula fina curvada e transfira-os para poços de cultura com uma escova fina ou pinça.

Se o tecido cair do agar, o contato entre o tecido e o agar não foi suficientemente formado em uma câmara de cultura de tecidos; prepare uma placa de seis poços com 1,8 mililitros de meio de cultura de fatias por poço e coloque os insertos organotípicos com código de lisina policlônica de laminina em cada poço. Adicione 500 microlitros de meio de cultura de fatias na parte superior dos insertos de fatias organotípicas. Em seguida, transfira até cinco fatias para cada inserto.

Em seguida, remova qualquer meio em excesso da superfície das fatias para garantir que elas preservem sua morfologia ao máximo e apresentem morte celular mínima. É importante manter uma interface ar-líquido saudável e evitar que as fatias flutuem no meio. Por fim, incube as fatias a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada.

Substitua metade do volume do meio sob a membrana a cada dois dias. As fatias não devem flutuar no meio; os neurônios que expressam construtos eletroporados podem ser visualizados já após oito horas da eletroporação, após os dias desejados de cultivo. Fixe as fatias na membrana para análise.

Lave cada inserto orgânico típico com PBS morno durante cinco minutos. Realize três lavagens com PBS no total e, em seguida, fixe o tecido com paraformaldeído a 4% por uma hora a quatro graus Celsius. Após a fixação, os tecidos podem ser analisados com marcadores celulares ou simplesmente corados com coloração de hooks. Após uma hora, lave as fatias com três lavagens de 10 minutos cada em PBS 1X.

Em seguida, permeabilize as fatias por duas horas à temperatura ambiente em uma solução de soro de cabra a 10% em um XPBS com agitação suave. Em seguida, marque os tecidos com anticorpos por uma hora à temperatura ambiente com agitação suave. Remova a marcação com três lavagens de 10 minutos em um XPBS com agitação suave durante a espera.

Coloque lâminas de vidro fosco em uma câmara de água com profundidade suficiente para cobrir os tecidos após serem colocados sobre as lâminas. Para montar as fatias, primeiro corte a membrana com um bisturi.

Segundo, utilizando pinças finas, transfira até cinco fatias com membrana aderida para cada lâmina submersa em água. Terceiro, remova qualquer água em excesso de cada lâmina. Quarto, aplique uma gota de solução de montagem permanente sobre cada fatia cerebral.

E, por último, coloque suavemente uma lamínula sobre as fatias e remova quaisquer bolhas de ar. As fatias estão então prontas para microscopia, dependendo da quantidade de DNA eletroporado e do estágio embrionário. Na eletroporação, verificou-se que a eficiência de transfeção variava.

Oito horas após a transfeção com um silenciador P, as células do vetor GFP começaram a expressar GFP. Durante um período de cultivo mais longo, as células passam por uma sequência normal de eventos neurogênicos, incluindo proliferação, migração e diferenciação neuronal inicial. Essas fatias mantiveram sua morfologia por cinco dias, desde que a interface ar-meio fosse bem mantida durante a tentativa deste procedimento.

É importante realizar todo o experimento, desde o momento em que o animal é eutanasiado até o momento em que os cortes são colocados nos insertos de membrana, em menos de duas horas, para minimizar a morte celular após este procedimento. Outras adições, como fatores exógenos à lisificação organotípica, podem ser realizadas para responder perguntas como: qual é o papel de diferentes fatores de crescimento ou agentes farmacológicos nos diversos mecanismos neurodesenvolvimentais?