Métodos de Estudo da morfogênese neuronal: Ex vivo Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias
18 de maio de 2012
Para realizar uma avaliação rápida da função de genes no desenvolvimento de córtex cerebral, que descrevem métodos que envolvem a Ex vivo Electroporação de plasmídeos co-expressando RNA inibitória (RNAi) e GFP no córtex embrionário de murídeo. Este protocolo é favorável ao estudo de vários aspectos do neurodesenvolvimento, como neurogênese, migração neuronal e morfogênese neuronal incluindo dendrito e crescimento axonal.
O objetivo geral do experimento a seguir é realizar uma avaliação rápida da função gênica no desenvolvimento do córtex cerebral usando fatias organotípicas. Isso é conseguido pela introdução de plasmídeos, coex, RNA expressivo e inibitório e marcador A GFP no córtex cerebral murn. Rajadas elétricas curtas são aplicadas ao cérebro, permitindo que o DNA do plasmídeo transfecte as células progenitoras neuronais.
Em seguida, os cérebros são dissecados, incorporados e seccionados para produzir fatias organotípicas que podem sofrer morfogênese neuronal ex vivo. As fatias organotípicas podem ser pesquisadas em busca de subpopulações de neurônios corticais com defeitos migratórios ou morfológicos, observando diretamente as células marcadas com GFP. Olá, bem-vindo ao meu laboratório na Brown University no departamento de biologia molecular hoje, a Dra. Liza e dois alunos, Kat Zer e Mark Seba, demonstrarão a técnica de eletroporação ex vivo e a cultura de fatias organotípicas, que é uma técnica muito útil para estudos de neurodesenvolvimento.
Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em vários aspectos do neurodesenvolvimento, incluindo neurogênese, migração neuronal e morfogênese neuronal. Como essa análise é feita em uma aproximação próxima do ambiente IBU, ela fornece uma alternativa rápida e de baixo custo para a geração de animais transgênicos ou nocautes para genes de função desconhecida. Finalmente, em comparação com a tecnologia de eletrooperação in vivo, o sucesso desses experimentos de eletrooperação in vivo não depende de cirurgia proficiente, desenvolvimento de habilidades e pode ser realizado com um tempo de treinamento mais curto e uma habilidade.
Depois de sacrificar uma rata grávida, disseque os embriões em HBSS completo e gelado, mantendo-os em seus sacos placentários individuais. Em seguida, na solução fria de HBSS, solte um embrião do saco e corte sua cabeça após a primeira vértebra para uma injeção, coloque a cabeça em um pedaço de papel paraforme em cima de uma placa de Petri usando uma seringa Hamilton feita sob medida. Injete de seis a oito microlitros de mistura verde rápida de DNA através do terceiro ventrículo.
A partir daí, a mistura preencherá os dois ventrículos laterais nas vesículas corticais. Para eletroporação, são utilizados eletrodos de platina com pinça BTX. Coloque o eletrodo positivo em direção ao lado do córtex que será eletroporado.
Por exemplo, o eletrodo deve estar no topo da cabeça Para córtex dorsal. Para alta eficiência de transfecção, sempre ajuste a concentração de DNA para um micrograma por microlitro e use DNA isolado de uma preparação Maxi. Se necessário, use um kit livre de endotoxinas para purificar o DNA após a eletroporação.
Incube a cabeça no gelo por pelo menos cinco minutos antes de dissecá-la. É muito importante usar a quantidade certa de pulsos elétricos e corrente ao fazer a eletroporação para evitar danos aos cérebros embrionários mais jovens. Após a eletroporação, o tecido torna-se muito frágil.
É importante fazer as dissecções com muito cuidado, pois a pele e o cardume podem puxar as meninges das vesículas corticais, e isso pode danificar as vesículas corticais ao serem removidas do crânio. Após cinco minutos, disseque o cérebro no frio. O HBSS começa fazendo uma pequena incisão na lateral da cabeça e descascando a pele das laterais da cabeça.
Em seguida, com uma pinça fina, retire suavemente a pia do cérebro. Remova o cérebro intacto do crânio. Quando terminar, mantenha o cérebro em HBSS gelado e prepare-se para incorporar o tecido.
Comece a encher os moldes com 3% de baixo ponto de fusão. Agros. Coloque os moldes no gelo para que os agros solidifiquem perto do fundo do molde. Primeiro, garantir que os cérebros permaneçam apoiados e centrados.
Agora, com uma pinça fina, remova suavemente um cérebro do HBSS, absorva o excesso de tampão com um lenço kim ou papel de filtro e coloque o cérebro no ponto de fusão baixo. Agros. Em seguida, use uma ponta de pipeta para girar o cérebro dentro do molde para maximizar o contato entre os agros e o tecido. Com todos os cérebros transferidos, posicione cada cérebro aproximadamente na mesma orientação e profundidade dentro de seu molde.
O aros se solidificará em cerca de cinco minutos. Portanto, trabalhe rapidamente. Deixe o aros solidificar completamente incubando mais cinco minutos no gelo.
Apare o excesso de aros antes de montar os blocos. Em seguida, prenda os blocos agros uns aos outros usando um adesivo plástico de ligação rápida, cada cérebro em uma pilha deve ser posicionado com seus bulbos olfatórios para cima. Depois que os blocos estiverem presos, apare o aros para garantir que cada cérebro seja cortado pelo vibrato.
Em seguida, mergulhe-os imediatamente em HBSS gelado. Para cortar os blocos, defina a velocidade dos vibratos para uma velocidade baixa, cerca de metade do máximo, e defina a frequência de vibração da lâmina na configuração mais alta. Em seguida, gere fatias coronais de 250 mícrons de espessura, recupere as fatias usando uma espátula fina dobrada e transfira-as para poços de tecido com uma escova fina ou pinça.
Se o tecido cair do agros, o contato do tecido agros não foi suficientemente formado em uma capa de cultura de tecidos, prepare uma placa de seis poços com 1,8 mililitros de meio de cultura de fatias por poço e coloque inserções organotípicas de código de lisina de política de laminina em cada um. Bem, adicione 500 microlitros de meios de cultura de fatia no topo das inserções de fatia organotípicas. Em seguida, transfira até cinco fatias para cada inserção.
Em seguida, remova qualquer excesso de mídia do topo das fatias Para garantir que as fatias preservem sua morfologia o máximo possível e tenham o mínimo de morte celular. É importante que uma interface ar líquido saudável seja mantida e as fatias não flutuem no meio. Por fim, incube as fatias a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada.
Substitua metade do volume de mídia sob a membrana a cada dois dias. As fatias não devem estar flutuando no meio que os neurônios que expressam construções eletroporadas podem ser visualizadas tão cedo quanto oito horas após a eletroporação após os dias desejados de cultivo. Fixe as fatias na membrana para análise.
Lave cada inserção orgânica típica com PBS quente por cinco minutos. Realize três lavagens de PBS no total e, em seguida, fixe o tecido com aldeído paraforme a 4% por uma hora a quatro graus Celsius. Após a fixação, os tecidos podem ser analisados com marcadores celulares ou simplesmente corados com ganchos Após uma hora, lave as fatias com três lavagens de 10 minutos em um XPBS.
Em seguida, permeável as fatias por duas horas à temperatura ambiente em uma solução de soro de cabra a 10% em um XPBS com agitação suave. Em seguida, pinte os tecidos com ganchos por uma hora em temperatura ambiente com agitação suave. Remova a mancha com três lavagens de 10 minutos em um XPBS com agitação suave enquanto espera.
Coloque lâminas de vidro fosco em uma câmara de água profunda o suficiente para banhar os tecidos depois de colocados nas lâminas. Para montar as fatias. Primeiro, corte a membrana com um bisturi.
Em segundo lugar, usando uma pinça fina, transfira até cinco fatias ligadas à membrana para cada lâmina submersa em água. Terceiro, remova o excesso de água de cada lâmina. Quarto, aplique uma gota de solução de montagem no chão em cada fatia de cérebro.
E, por último, coloque delicadamente uma lamínula em cima das fatias e remova as bolhas de ar. As fatias estão então prontas para microscopia, dependendo da quantidade de DNA eletroporado e do estágio embrionário. Na eletroporação, a eficiência da transfecção variou.
Oito horas após a transfecção com silenciador de P, as células vetoriais GFP começaram a expressar GFP. Durante um período de cultura mais longo, as células passam por uma sequência normal de eventos neurogênicos, incluindo proliferação, migração e diferenciação neuronal precoce. Essas fatias mantiveram sua morfologia por cinco dias, desde que a interface aérea do meio fosse bem mantida durante a tentativa deste procedimento.
É importante realizar todo o experimento desde o momento em que o animal é sacrificado até o momento em que as fatias são colocadas nas inserções de membrana em menos de duas horas para minimizar a morte celular após esse procedimento. Outras adições semelhantes de fatores exógenos à lise organotípica podem ser realizadas para responder a perguntas como: qual é o papel de diferentes fatores de crescimento ou agentes farmacológicos nos vários mecanismos de neurodesenvolvimento?
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para avaliar a função gênica no desenvolvimento do córtex cerebral por meio de eletroporação ex vivo. Ao usar plasmídeos que co-expressam RNA inibitório e GFP, os pesquisadores podem investigar processos de neurodesenvolvimento, como neurogênese e migração neuronal.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neurodesenvolvimento
- Genética
Contexto
- O córtex cerebral é crucial para várias funções cerebrais.
- Entender a função gênica é essencial para insights sobre o neurodesenvolvimento.
- Técnicas ex vivo permitem o estudo detalhado do comportamento neuronal.
- A eletroporação é um método usado para introduzir DNA em células.
Objetivo do Estudo
- Avaliar rapidamente a função gênica no desenvolvimento do córtex cerebral.
- Explorar neurogênese, migração neuronal e morfogênese.
- Utilizar fatias organótipos para observar mudanças neuronais.
Métodos Utilizados
- Eletroporação ex vivo de plasmídeos no córtex embrionário murino.
- Aplicação de curtos pulsos elétricos para facilitar a transfecção.
- Dissecção e incorporação de cérebros para criar fatias organótipos.
- Observação de células marcadas com GFP para identificar defeitos neuronais.
Principais Resultados
- Transfecção bem-sucedida de células progenitoras neuronais com plasmídeos.
- Identificação de subpopulações de neurônios corticais com defeitos.
- Demonstração da utilidade das técnicas ex vivo no neurodesenvolvimento.
- Confirmação visual da morfogênese neuronal por meio de marcação GFP.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem rápida para estudar a função gênica.
- A eletroporação ex vivo é eficaz para pesquisas em neurodesenvolvimento.
- Os insights obtidos podem informar a compreensão do desenvolvimento cortical.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Rapid ex vivo RNAi electroporation in embryonic murine cerebral cortex enables functional interrogation of gene candidates implicated in neuronal morphogenesis and migration. This approach provides a scalable, low-cost alternative to generating transgenic or knockout models, accelerating early discovery and target validation in neurodevelopmental research. Its mosaic analysis capability supports predictive confidence in gene function assessment, informing portfolio triage and risk-adjusted advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid functional screening of candidate genes in a near-physiological tissue context.
- Supports biological de-risking by clarifying gene roles in neuronal morphogenesis and migration.
- Facilitates predictive confidence in target selection for neurodevelopmental disorders.
- Allows mosaic analysis to distinguish cell-autonomous effects from broader tissue responses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organotypic slice systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative readouts via GFP labeling of transfected neuronal populations.
- Enables assay standardization and scalability for gene function studies.
- Supports reliable evaluation of gene knockdown effects on neuronal morphology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant neurodevelopmental mechanisms by preserving tissue architecture.
- Provides continuity from gene discovery to preclinical validation in complex tissue environments.
- Reduces reliance on whole-animal models for initial functional assessment.
- Offers mechanistic de-risking for genes of unknown cortical function.
Pipeline & Workflow Integration
This ex vivo RNAi electroporation method fits at the interface of early discovery and lead identification, bridging in vitro gene function studies and in vivo validation. It streamlines hypothesis testing and supports rapid iteration in neurodevelopmental target pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of gene function in neuronal morphogenesis and migration.
- Screening: Provides assay-ready organotypic slices with quantitative, reproducible outputs.
- Analytics: Supports direct measurement of morphological and migratory phenotypes in GFP-labeled neurons.
- Translational Research: Maintains tissue context for alignment with disease-relevant neurodevelopmental processes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for rapid gene function assessment across multiple candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental gene function studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for gene knockdown analysis.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing reliance on transgenic models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic brain dissection and organotypic slice culture.
- Needs access to electroporation equipment and fluorescence microscopy for GFP detection.
- Demands careful standardization of DNA concentration and electroporation parameters for reproducibility.
- Adaptable to various gene constructs and embryonic stages, but tissue fragility and timing are critical.
- Limited to early postnatal developmental windows and may not capture long-term phenotypes.
