De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster

O objetivo geral deste procedimento é monitorar a atividade neuronal por imagem de cálcio simultaneamente com a observação do comportamento alimentar. Isso é feito inserindo primeiro uma mosca no aparelho de moscas. Em seguida, a cabeça da mosca é dissecada para expor o cérebro.

O aparelho da mosca com a mosca dissecada é então posicionado no estágio do microscópio. A etapa final do procedimento é a estimulação de pro Bois com um pavio de açúcar. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a ativação de um neurônio identificado por meio de imagens de cálcio correlacionadas à extensão do Probus por meio de filmagem do comportamento.

Tive a ideia desse método pela primeira vez quando pensei em olhos de cervejas batendo que nadam na superfície da água. Nós, cervejas, temos olhos divididos e podemos ver acima e abaixo da superfície da água. Um ponto complicado do meu experimento é que o cérebro e as SCUs estão próximos um do outro, mas se eles estiverem bem separados como os olhos de nós, podemos manter as SCUs secas enquanto o cérebro está exposto no satélite.

Isso eu fiz uma partição muito simples logo acima das SCUs para separar a face seca do local de largura, Molde uma plataforma a partir da tampa de um prato de falcão de 35 milímetros derretendo a parede lateral e esculpindo-a para formar um ângulo e espessura apropriados. Faça um furo na plataforma para aceitar a cabeça da mosca, de modo que as partes da boca fiquem livremente expostas ao exterior da câmara. Corte a ponta de uma pipeta apenas o suficiente para aceitar o corpo da mosca e, em seguida, cole a ponta na plataforma.

Depois de morrer de fome, um adulto voa por 24 horas a 25 graus Celsius. Anestesie a mosca colocando-a em um tubo de plástico de 15 mililitros, em pé sobre o gelo usando uma pinça. Insira uma mosca na câmara das moscas e empurre-a suavemente até que ela não consiga se mover.

Sele as partes circundantes do probos proximal ou rostro na borda interna do orifício aplicando uma pequena quantidade de cola fotopolimerizável nas laterais e acima do rostro, usando um cílio ou ferramenta semelhante para espalhar cuidadosamente a cola. Aplique também a cola de dentro das moscas no espaço entre a parte dorsal da cabeça e a borda interna do orifício. Finalmente, cure a cola com a iluminação mais fraca de luz azul suficiente para curar para evitar danificar a mosca.

Para estabilizar a cabeça da mosca e expor a parte ventral do SOG, prenda um fio para manter o rostro parcialmente levantado. Com a mosca no lugar, preencha a superfície da plataforma com solução salina sem sacarose. Abra a cápsula da cabeça para expor o SOG usando uma lâmina de tungstênio e uma pinça com pontas afiadas que chamamos de pinça afiada.

Zíperes Scis. Esta é uma demonstração de zíperes scis, cortando uma fibra de um lenço Kim para comparação. Isso é realizado primeiro com uma tesoura de íris no campo visual e, em seguida, na frente de uma régua graduada de um milímetro.

Primeiro, usando a lâmina de tungstênio, faça uma incisão na borda posterior. Em seguida, corte o lado e as bordas anteriores usando a pinça afiada. Levante a peça da cutícula cortada com a pinça e remova-a.

Corte as antenas e os nervos da antena usando a pinça. Em seguida, remova seletivamente os sacos de ar entre o SOG e a cutícula para estabilizar o cérebro e evitar artefatos de movimento. Em seguida, corte o esôfago no final em direção à faringe e no final indo para o SOG para remover a conexão entre a faringe e o cérebro.

Então, depois de identificar e retirar o músculo 16, descole qualquer traqueia que conecta o cérebro e a cutícula. Coloque as moscas no palco de um microscópio confocal de disco giratório e mude para a lente de imersão em água para obter imagens. Em seguida, faça uma única seção óptica a quatro hertz com um tempo de exposição de 122 milissegundos usando laser de excitação de 491 nanômetros focando na região de interesse.

Use uma agulha de seringa com um pequeno pavio de japonês. Ela estava com papel saindo da ponta para oferecer sacarose à mosca? Descarregue uma pequena gota de solução de sacarose no pavio e, em seguida, aspire-a com um injetor conectado à agulha através de um tubo flexível usando um manipulador de joystick para segurar a agulha.

Aplique o pavio de papel lavado embebido na ponta das gotas, mas apenas por um instante. Para evitar a saciedade. Monitore a resposta de extensão PROBUS ou o comportamento de PER usando uma câmera CCD conectada a um microscópio de dissecção simultaneamente com imagens de cálcio e certifique-se de coletar os dados dentro de uma hora após a dissecação.

Aqui é mostrada uma resposta típica de extensão de Bois à estimulação com um WIC contendo sacarose 100 milimolar. Solução aquosa fotografada usando um laser de 491 nanômetros para fluorescência G CAMP. A imagem simultânea de cálcio durante o comportamento da resposta de extensão da prosa mostrada aqui primeiro antes e depois da estimulação permite a visualização das respostas GAMP 3.0 induzidas por sacarose no neurônio motor para o transferidor do músculo rostro.

Na estrela de estado, a quantificação da resposta GAMP 3.0 induzida por sacarose mostra que os neurônios motores respondem a um estímulo de sacarose por um aumento acentuado na fluorescência, seguido por uma fase de restauração de vários segundos para a linha de base. A plataforma voa permite outros métodos, como eletrofisiologia ou optogenética ou psicogenética, ou ativação química para neurônios ou imagens laboratoriais TimeLapse de estruturas marcadas com GFP, a fim de responder a perguntas adicionais, como correlação entre plasticidade sináptica e memória.