De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster

O objetivo geral deste procedimento é monitorar a atividade neuronal por meio de imagem de cálcio simultaneamente à observação do comportamento alimentar. Isso é realizado primeiramente inserindo uma mosca no aparelho para moscas. Em seguida, a cabeça da mosca é dissecada para expor o cérebro.

O aparelho com a mosca dissecada é então posicionado sobre a platina do microscópio. O passo final do procedimento é a estimulação do pro Bois com um pavio de açúcar. Por fim, podem-se obter resultados que demonstram a ativação de um neurônio identificado por meio de imagem de cálcio, correlacionada à protrusão do Probus por meio de gravação em vídeo do comportamento.

Tive pela primeira vez a ideia deste método quando pensei nos olhos de cervejas batentes que nadam na superfície da água. Nós, cervejas, temos olhos divididos e conseguimos enxergar tanto acima quanto abaixo da superfície da água. Um ponto delicado do meu experimento é que o cérebro e as UCIs estão próximos um do outro, mas se forem separados de maneira adequada, como os olhos de nós, cervejas, podemos manter as UCIs secas enquanto o cérebro é exposto no satélite.

Fiz uma divisão muito simples logo acima das UCAs para separar a face seca do local da largura, moldando uma plataforma a partir da tampa de uma placa Falcon de 35 milímetros, derretendo a parede lateral e esculpindo-a para formar um ângulo e espessura apropriados. Faça um furo na plataforma para acomodar a cabeça da mosca, de modo que as peças bucais fiquem livremente expostas ao exterior da câmara. Corte a extremidade de uma ponteira de pipeta com largura suficiente para acomodar o corpo da mosca e, em seguida, cole a ponteira à plataforma.

Após privar uma mosca adulta por 24 horas a 25 graus Celsius, anestesie a mosca colocando-a em um tubo plástico de 15 mililitros, sobre gelo, utilizando pinças. Insira uma mosca na câmara das moscas e empurre-a suavemente até que não consiga mais se mover.

Selar as partes circundantes da probóscide proximal ou rostro à borda interna do orifício, aplicando uma pequena quantidade de cola fotoativada nas laterais e acima do rostro, utilizando um cílio ou ferramenta semelhante para espalhar cuidadosamente a cola. Aplique também a cola do interior das moscas para o espaço entre a parte dorsal da cabeça e a borda interna do orifício. Por fim, polimerize a cola com a iluminação mais fraca de luz azul suficiente para a polimerização, evitando danificar a mosca.

Para estabilizar a cabeça da mosca e expor a parte ventral do SOG, prenda um fio para segurar o rostro parcialmente elevado. Com a mosca posicionada, preencha a superfície da plataforma com solução salina sem sacarose. Abra a cápsula cefálica para expor o SOG utilizando uma lâmina de tungstênio e pinças com pontas afiadas, que chamamos de pinças afiadas.

Scis zips. Esta é uma demonstração de scis zips, cortando uma fibra de um lenço Kim para comparação. Primeiro, isso é realizado com tesoura de íris no campo visual, e depois diante de uma régua graduada de um milímetro.

Primeiro, usando a lâmina de tungstênio, faça uma incisão através da borda posterior. Em seguida, corte as bordas lateral e anterior usando a pinça afiada. Levante o pedaço de cutícula cortado com a pinça e remova-o.

Corte as antenas e os nervos das antenas usando a pinça. Em seguida, remova seletivamente as bolsas de ar entre o SOG e o cutículo para estabilizar o cérebro e evitar artefatos de movimento. A seguir, corte o esôfago na extremidade voltada para a faringe e na extremidade que entra no SOG, a fim de remover a conexão entre a faringe e o cérebro.

Em seguida, após identificar e puxar o músculo 16, remova qualquer traqueia que conecte o cérebro à cutícula. Coloque as moscas na platina de um microscópio confocal de disco giratório e mude para a objetiva de imersão em água para aquisição de imagens. Em seguida, obtenha uma única seção óptica a quatro hertz, com um tempo de exposição de 122 milissegundos, utilizando um laser de excitação de 491 nanômetros focalizado na região de interesse.

Use uma agulha de seringa com uma pequena mecha de papel japonês saliente na ponta para oferecer sacarose à mosca. Libere uma pequena gota de solução de sacarose sobre a mecha, em seguida aspire-a com um injetor conectado à agulha por meio de uma tubulação flexível, utilizando um manipulador com joystick para segurar a agulha.

Aplicar o pavio de papel-toalha embebido na ponta das antenas, mas apenas por um instante, para evitar saciação. Monitorar a resposta de extensão do PROBUS ou o comportamento PER utilizando uma câmera CCD acoplada a um microscópio estereoscópico simultaneamente com a imagem de cálcio, e certificar-se de coletar os dados dentro de uma hora após a dissecação.

Mostrado aqui está uma resposta típica de protrusão do Bois à estimulação com uma WIC contendo sacarose 100 milimolar. Solução aquosa obtida com um laser de 491 nanômetros para fluorescência de G CAMP. A imagem simultânea de cálcio durante o comportamento de resposta à protrusão, mostrada aqui primeiro antes e depois da estimulação, permite a visualização das respostas induzidas por sacarose ao GAMP 3.0 no neurônio motor do músculo protractor do rostrum.

No início da quantificação do estado da resposta GAMP 3.0 induzida por sacarose, observa-se que os neurônios motores respondem a um estímulo de sacarose com um acentuado aumento na fluorescência, seguido por uma fase de restauração de vários segundos até a linha de base. A plataforma permite outros métodos, como eletrofisiologia ou optogenética ou psicogenética, ou ativação química de neurônios ou imagens de lapso de tempo de estruturas marcadas com GFP, a fim de responder perguntas adicionais, como a correlação entre plasticidade sináptica e memória.