Name: Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Aprenda a gerar linfócitos T citotóxicos específicos para múltiplos vírus a partir de sangue de cordão umbilical. Este método em conformidade com GMP permite produzir células imunes para aplicações clínicas em terapia celular.

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Este trabalho foi financiado por uma L. Dan Duncan colaborativo bolsa de investigação (CMB e EJS), o Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (US4HL081007), uma Leucemia e Linfoma Sociedade prêmio Acadêmico de Pesquisa Clínica (CMB), e do Instituto Nacional do Câncer (RO1 CA06150816; EJS).

1. Isolamento de células mononucleares (dia 0) <ol><li> Insira espiga de adaptador luer fêmea no orifício de saída da fracção de 20% da unidade de sangue do cordão umbilical, anexar e remover a seringa do sangue. Transferir sangue descongeladas a 20 mL de RPMI aquecido no tubo de centrífuga de 50 mL. Enxaguar saco de sangue do cordão umbilical com 5 mL de meio RPMI e transferir para o tubo de centrífuga mesmo. </li><li> Centrifugar as células durante 10 minutos a 400 x g. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 20 ml de RPMI morno. As células da camada em 15 mL de Lymphoprep em 50 ml de tubo de centrífuga. Centrifugar 40 minutos @ 400 x g. </li><li> Colher a interface contendo as células mononucleares e lava-se em 20 mL de RPMI. Centrifugar durante 10 minutos @ 450 x g. </li><li> Aspirar o sobrenadante e lava-se em 20 mL de RPMI. Contar as células e centrifugação durante 5 minutos a 400 x g. </li><li> Aspirar células sobrenadante e ressuspender a 5 x 10 6 células mononucleares / mL de Cellgenix DC mídia (sem soro). Retirar 1 mL de EBV-LCL geração e colocados em 15 ml centrifuge tubo. </li></ol> 2. Geração de células dendríticas (a partir de dia 0) <ol><li> Placa 2 mL de células (já estão a 5 x 10 6 células / mL de meio DC) por poço numa placa de 6 poços. Deixe na incubadora por 1-2 horas. </li><li> Após 1-2 horas, lavar as células não aderentes por lavagem 3-4 vezes com PBS. Recolher as células não aderentes e congelar. Adicionar 2 mL / poço de meio DC contendo 1000 U / ml de IL-4 e 800 U / mL de GM-CSF. </li><li> 3-4 dias após a iniciação DC, encher a IL-4 e GM-CSF por adição de 100 uL / ​​poço de meio contendo uma concentração final de 1000U/mL IL-4 e 800 U / mL de GM-CSF. </li><li> No dia 5-6, colheita da DC por raspagem do poço com uma pipeta de transferência. Contar as células grandes e centrifugar durante 5 minutos @ 400 x g. Aspirado de mídia e ressuspender DC em 2x10 6 células / ml de DC mídia. Adicionar 0,5 mL / poço de uma placa de 24 poços. </li><li> Transduzir a DC utilizando o vector numa célula Ad5f35pp65 por MOI de 10 unidades infecciosas. Adicionar vector para cada poço de uma placa de 24 poços. Incubar as células durante 1,5 horas. Após 1,5 horas, adicionar 1,5 ml / poço de meio DC contendo: 1000 U / mL de IL-4, 800 U / mL de GM-CSF, 10 ng / mL de TNF-alfa, 1 ug / mL de PGE-1, de 100 ng / mL IL-6, e 10 ng / mL de IL-1beta. Estas citocinas amadurecer os DCs. </li></ol> 3. Geração de EBV-LCL (começando no dia 0) <ol><li> Centrifuga-se o tubo contendo os 5 x 10 6 células mononucleares. Adicionar 200 uL de sobrenadante concentrado EBV B95.8 e 1,8 mL de meio completo (RPMI + 10% de FBS + 2 mM de L-glutamina) contendo ciclosporina (1 ug / mL). </li><li> Alíquota de 100 uL de células em 10 cavidades de uma placa de 96 poços e 200 ul para 5 poços. Adicionam-se 100 ul de meio completo + ciclosporina aos poços contendo apenas 100 ul de células. Encher os poços restantes com água estéril. </li><li> Alimentar o semanal LCL e expandir a partir de uma placa de 96 poços para uma placa de 24 poços depois de aproximadamente 2 semanas. Depois de mais uma semana, transferir para um balão T25 e na transferência de semana subsequenteum frasco T75. Nesta fase, é recomendado que você congelar alíquotas de LCL. Ele normalmente leva um mês para gerar um número suficiente de LCL. </li></ol> 4. CTL Initiation - 7 dias após o início da DCs <ol><li> DCs de colheita e irradiar a 30 Gy. Lavar 4 x e contagem. Ressuspender DC em meios de células T que contêm soro humano (45% de RPMI, 45% CLICK, 10% de soro humano, L-glutamina 2mM) @ 1 x 10 5 DCs / mL. </li><li> Descongelar as células não aderentes a partir do passo 2.2. Lave as células, e contar. Ressuspender a 2 x 10 6 células não aderentes / mL em meio de células T contendo soro humano. Adicionam-se 10 ng / mL de IL-7 e IL-12, e 5 ng / mL de IL-15. Adicionar 1 mL de células por poço numa placa de 24 poços. Adicionar 1 mL de DC por poço. Preencher cavidades vazias de 24 poços da placa com água estéril. </li><li> 7 dias após a iniciação das células T, de alimentação e / ou separar as células com meio contendo soro de células T humanas. </li><li> 9-12 dias após o início da célula T, congelar as células T até que a LCL estão prontos. </li><li> Once LCL expandiram e são passadas em frascos T75, transduzir a LCL por centrifugação durante 5 minutos a 400 x g. Adicionar o vector para a pelete de células a um MOI de 100 unidades infecciosas por célula. Incubar durante 1,5 horas. Após 1,5 horas, ressuspender em meio completo a 5 x 10 5 LCL / mL e adicionar 2 ml por poço numa placa de 24 cavidades 12. </li><li> Após 2 dias, colher o LCL e irradiam a 40 Gy. Lavar 4 x e contagem. Ressuspender o LCL em meio de células T contendo soro humano a 2,5 x 10 5 células / mL. Adicionar 1 mL de LCL por poço de uma placa de 24 poços. Além disso, adicionam-se 5 x 10 6 LCL para um dispositivo de cultura, bem como Grex40 5 ng / mL de IL-15 13. </li><li> Colheita das células T. Centrifugar durante 5 minutos @ xg 400, aspirar o sobrenadante e ressuspender em meio de células T contendo soro humano a 1 x 10 6 células T / mL. Adicionam-se 5 ng / mL de IL-15 e adicionar 1 mL / poço de células T (total de 1 x 10 6 células T) para o LCL que já estão na placa de 24 poços. No Grex40, trazero volume total do material até 30 mL. </li><li> No dia 3-4 de pós-estimulação, se as células confluentes são dividir (na placa) 1:1 e adicionar meio fresco contendo 50 U / mL de IL-2. Se eles não são, em seguida, simplesmente confluente ½ aspirar os meios de comunicação e substitua com meio contendo 50 U / mL de IL-2. No Grex40, aspirar a metade dos meios de comunicação, substituir com novas mídias, e adicionar 50 U / mL de IL-2. </li><li> No dia 7, repetir como no passo 4,6, mas utilização de IL-2 no dia da estimulação, e não a IL-15. </li></ol> 5. Resultados representativos Um esquema do protocolo de fabricação GMP conforme aprovado pelo FDA é apresentada na Figura 1. O processo leva cerca de 50 dias. Métodos típicos de gerar células específicas do vírus T expandir pré-existentes células T de memória, no entanto, carece de sangue do cordão umbilical células T-vírus experientes e, portanto, precisamos nobre ingênuo ex vivo de células T. Para fazer isso, utilizamos células dendríticas assim como as citocinas IL-7, IL-12 e IL-15,necessária para a geração de especificidade viral. Depois de 3 estímulos, o rendimento deverá ser superior a 100x10 6 células. Se as células não estiverem disponíveis, os estímulos adicionais podem ser realizados até que o número desejado de CTLs estão disponíveis. A maioria destas células deve ser CD3 + com uma mistura de células CD4 + e CD8 +. Deverá haver menos de 15% de células NK (CD3-/CD56 +) e menos de 1% de células B CD19 + (Figura 2). O CTL expandido deve reconhecer o antigénio de pp65 de CMV, hexon e penton de adenovirus, bem como numerosos antigénios de EBV, que são expressos em EBV-LCL. Quando testados num ensaio ELISPOT, CTL deve segregar mais IFN-? em resposta a estes antigénios do que os antigénios irrelevantes (Figura 3). O CTL deve também lisar virais peptídeo-pulsados ​​alvos de blastos PHA tais. Num ensaio de libertação de 51Cr, de CTL deve lisar LCL, CMVpp65 pulsado e Adenovirus hexon e /penton ou pulsado alvos, mas não alvos pulsados ​​com peptídeos irrelevantes (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig1.jpg" alt="Figura 1."/> Figura 1. Geração de multi-virus-specific CTL a partir do sangue do cordão umbilical. Esquemática, que mostra todo o processo de fabrico de CTL a partir do sangue do cordão umbilical. Primeiro, as células mononucleares do sangue do cordão são isolados a partir da fracção de 20% da unidade de fraccionamento de sangue de cordão umbilical. Com a excepção de 5x10 6 células que são guardados para a geração de LCL, todas as células são em seguida incubadas em meio de células dendriticas, durante 1-2 horas, altura em que as células não-aderentes foram colhidas e congeladas. A DC são então alimentados DC media contendo IL-4 e GM-CSF. Após 5 dias de cultura, o DC são amadurecidas e transduzidas com um vector adenoviral contendo o antigénio imunodominante CMV pp65. Na iniciação, estas DC são combinadas com as células não-aderentes, bem como as citocinas IL-7, IL-12,e IL-15. No estimulações subsequentes, o vector adenoviral mesmo é utilizado para transduzir EBV-LCL, que são utilizadas como as células apresentadoras de antigénio. IL-15 é utilizado para a segunda estimulação de IL-2 e em seguida. <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig2.jpg" alt="Figura 2."/> Figura 2. Fenótipo de células T resultante. Mostrada a percentagem de células vivas incluídos na barreira linfocitária. CTL são CD3 + e CD4 + ou CD8 +, mas em grande parte CD3-/CD56- e CD19-. <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig3.jpg" alt="Figura 3."/> Figura 3. T funcionalidade celular. Especificidade das células T foi testada por IFN-γELISPOT. As células T foram pulsadas com peptídeos sobrepostos abrangendo toda a proteína de hexon, penton, pp65 e o antigénio irrelevante IE-1. CTL sozinho indica meio sozinho. LCL autólogas foram irradiadas e adicionado a 1x10 5 / poço. É mostrado o ponto médio formando celular count de poços em triplicado. <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig4.jpg" alt="Figura 4."/> Figura 4. A actividade citolítica de CTL. A capacidade do CTL resultante para lisar alvos que expressam antigénios virais foi testado num ensaio de Cr 51. 51 Cr-blastos autólogos marcados com PHA foram pulsadas com peptídeos sobrepostos abrangendo o antigénio inteiro ou 51Cr-marcado LCL autólogas foram co-cultivadas com CTL. Depois de 4 horas, a libertação de gama foi contada num contador gama.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

<html> As estratégias actuais no sentido de controlar as infecções virais após TCC pode ser eficaz, mas estão associadas com toxicidade significativa, são caros, e não conferem protecção a longo prazo contra a infecção posterior. Na verdade, o uso de algumas drogas antivirais podem limitar a expansão de células T específicas de vírus que de outra forma seria protectora 14. Outra opção é a infusão de doador derivados de vírus-células T específicas. Nós e outros autores mostraram que essas células T estão seguro...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td></tr><tr><td> DC mídia </td><td> CellGenix </td><td> 20801-0500 </td></tr><tr><td> EHAA (meio de Click) </td><td> Irvine Scientific </td><td> 9195 </td></tr><tr><td> Soro Humano </td><td> Gémeos Bio Products </td><td> 100-110 </td></tr><tr><td> Gás Permeável Cultureware 18 </td><td> Wilson-Wolf </td><td> 80040S </td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> Chiron (TCH Farmácia) </td><td></td></tr><tr><td> IL-12 </td><td> NCI / CTEP </td><td></td></tr><tr><td> IL-15 </td><td> CellGenix </td><td> 1013-050 </td></tr><tr><td> IL-7 </td><td> R &amp; D </td><td> AFL207 </td></tr><tr><td> IL-1beta </td><td> R &amp; D </td><td> AFL201 </td></tr><tr><td> IL-6 </td><td> CélulaGenix </td><td> 1004-050 </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> TCH Farmácia </td><td></td></tr><tr><td> IL-4 </td><td> R &amp; D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/AFL204.pdf" target="_blank">AFL204</a> </td></tr><tr><td> TNF-alfa </td><td> R &amp; D </td><td> AFL210 </td></tr><tr><td> Ad5f35pp65 </td><td> BCM CAGT Facilidade de Produção Vector </td><td></td></tr><tr><td> Transferência de plasma conjunto com adaptador luer fêmea </td><td> Carta de Medicina </td><td> 89-550-66J </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> Nycomed </td><td> 1114550 </td></tr></tbody></table>

expandindo linfócitos t citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus target, vírus de epstein-barr, e adenovirus

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Infecções por vírus após o transplante de células-tronco estão entre as causas mais comuns de morte, especialmente depois do sangue de cordão umbilical (CB) transplante (CBT), onde o BC não contém números apreciáveis ​​de células T-vírus experientes que podem proteger o destinatário da infecção 1. - 4 Nós e outros autores mostraram que o vírus-specific CTL gerados a partir de dadores seropositivos e injectada para o receptor são seguras e de protecção. 5-8 No entanto, até há pouco tempo, as células T específicas para o vírus não pode ser gerado a partir de sangue do cordão umbilical, provavelmente devido ao ausência de vírus específicos de células T de memória. Num esforço para melhor imitar a condições de estímulo in vivo de células T naive, foi estabelecido um método que utilizou células CB-derivadas dendríticas (DC) transduzida com um vector adenoviral (Ad5f35pp65) contendo o antigénio imunodominante CMV pp65, portanto dirigir a especificidade de células T para CMV e adenovírus. 9 No início, nós usamos estes maDCs estruturadas, bem como derivados de CB células T na presença das citocinas IL-7, IL-12 e IL-15. 10 Na segunda estimulação foi utilizado EBV-células B transformadas, ou EBV-LCL, que expressam tanto latente e antígenos líticos EBV. Ad5f35pp65-EBV-LCL transduzidas são usados ​​para estimular as células T na presença de IL-15 na segunda estimulação. Estimulações subsequentes usam Ad5f35pp65-EBV-LCL transduzidas e IL-2. De 50x10 6 CB células mononucleares que são capazes de gerar mais de 150 x 10 6 de vírus específicos de células T que lisam alvos pulsados ​​antigénio e libertação de citocinas em resposta a estimulação antigénica. 11 Estas células foram fabricadas de um modo compatível com GMP utilizando somente a fracção de 20% de uma unidade de fraccionamento de sangue do cordão e foram traduzidos para o uso clínico.

Aqui descrevemos a prática de fabricação primeiro (BPF) compatível com método de produção de vírus específicos linfócitos T citotóxicos (CTL) de sangue de cordão umbilical, fonte de células T predominantemente ingênua.

Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus

As infeções virais após o transplante de células estaminais estão entre as causas mais comuns de morte, especialmente após o transplante de sangue do cordão umbilical (SBU), onde...

O objetivo geral deste procedimento é gerar linfócitos T citotóxicos derivados de sangue do cordão umbilical, ou CTL, que reconheçam antígenos de múltiplos vírus. Isso é realizado primeiramente isolando as células mononucleares do sangue do cordão da fração de 20% da unidade de sangue do cordão. O segundo passo consiste em utilizar as células mononucleares para gerar células dendríticas, linhagens celulares de linfoblastos do vírus Epstein-Barr, ou E-B-V-L-C-L, e CTL específicos para o vírus.As células mononucleares, que contêm os linfócitos T, são estimuladas com células que foram transduzidas com o vetor A five F 35 PP 65. O passo final é confirmar a especificidade dos CTL específicos para múltiplos vírus e congelar os CTL. Em última análise, a especificidade da expansão dos CTL para pelo menos um antígeno viral pode ser avaliada por meio de análise de Ellie SPA e ensaios de citotoxicidade.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque o volume de sangue central disponível na fração de 20% é muito pequeno, o que significa que há muito poucas células para trabalhar. O procedimento também é bastante intricado e envolve a geração de pelo menos três tipos dif

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um protocolo rápido, simples e de baixo custo para a geração de doador-derivado multivirus específico CTLs (rctl) para infusão de células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH) destinatários em risco de desenvolver infecções CMV, EBV ou Adv. Este processo de fabricação é compatível com GMP e deve garantir a mais ampla implementação de T-cell imunoterapia além de centros especializados.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Um método novo CD independente para indução e expansão de células T antígeno-específicos é descrito. HLA A2-Ig baseada Células Antigen Presenting artificial (AAPC) são carregados com HLA-A2 peptídeos restrito a expandir de forma eficiente CTL de especificidade do antígeno diversas. Esta tecnologia tem um grande potencial para CTL baseada imunoterapia adotiva.

HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos

As células T reguladoras CD4+ são potentes imunomoduladores e desempenham funções importantes na homeostase imunológica. A escassez dessas células no sangue periférico torna os estudos funcionais desafiadores, especificamente no contexto da infecção pelo HIV-1. Descrevemos aqui um método para isolar e expandir Tregs CD4+ funcionais do sangue periférico de indivíduos infectados pelo HIV-1.

Novas ferramentas para expandir as células T reguladoras de indivíduos HIV-1-infected

Novel gerações de ensaios funcionais, tais como o interferão gama (IFN-γ) ELISpot, que detectam a produção de citoquinas ao nível de células individuais e fornecer tanto a caracterização quantitativa e qualitativa das respostas das células T pode ser utilizado para avaliar as respostas imunes mediadas por células contra a varicela zoster vírus (VZV).

Desenvolvimento de uma varicela-zoster imunidade mediada por células específicas do vírus ELISpot Ensaio para Avaliar-γ IFN Após Cordão Umbilical Transplante de Sangue

O objetivo deste protocolo é fabricar células T de grau clínico específicas para patógenos usando um dispositivo de enriquecimento celular de segunda geração automatizado de bancada que incorpora um sistema fechado de captura de citocinas e não requer equipe dedicada ou uso de uma instalação GMP. As células T específicas do citomegalovírus pp65 geradas podem ser administradas diretamente aos pacientes.

As células T de enriquecimento de células automatizado de citomegalovírus específico-para aplicações clínicas usando o Sistema de captura de citocinas

Aqui, demonstramos como os monócitos são isolados por separação de esferas magnéticas de células mononucleares do sangue periférico após centrifugação por gradiente de densidade de sangue anticoagulado humano. Após a incubação por 5 dias, os monócitos humanos são diferenciados em células dendríticas imaturas e estão prontos para procedimentos experimentais em um ambiente não clínico.

Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

Apresentamos aqui um pedido de uma norma técnica imunológica (CFSE manchado OT-eu proliferação) destinados a monitorar rapidamente mediada por adjuvante T linfócitos citotóxicos (CTL) geração in vivo. Esta estimativa rápida das capacidades CTL é útil para o desenvolvimento de vacinas profiláticas contra patógenos intracelulares, bem como as vacinas terapêuticas do câncer.

Rápida na Vivo avaliação dos recursos de geração de linfócitos de T citotóxicos do adjuvante para desenvolvimento de vacinas

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

Aqui apresentamos um protocolo para a supressão efetiva da replicação do vírus da hepatite B (HBV) em camundongos utilizando a transferência de células adotivas (ACT) de linfócitos T específicos de antígenos virais derivados de células-tronco (AG). Este procedimento pode ser adaptado para a imunoterapia baseada em ACT potencial da infecção por HBV.

Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos

Delineamos um protocolo de 9 dias para a transdução e expansão de células mononucleares periféricas rhesus macaque que produz células com excelente co-expressão dos genes de interesse em número suficiente para estudos de infusão da eficácia celular.

Transdução e expansão de células T primárias em nove dias com manutenção do fenótipo da memória central

Apresentado é um protocolo para a expansão do produto de células T Gama-Delta (γδ). Os linfócitos são isolados por elutriação e enriquecidos com ácido zoledrônico e interleucina-2. As células T alfa-beta estão esgotadas usando um dispositivo de separação magnética de grau clínico. As células γδ são co-cultivadas com células derivadas de antígenos artificiais e expandidas.

Expansão e enriquecimento de células T Gama-Delta (γδ) do produto humano aferido

Aprenda a gerar linfócitos T citotóxicos específicos para múltiplos vírus a partir de sangue de cordão umbilical. Este método em conformidade com GMP permite produzir células imunes para aplicações clínicas em terapia celular.

Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus (Vídeo) | JoVE Journal

Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus

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