Em Assembléia in vitro de Semi-artificial máquina molecular e sua utilização para detecção de danos no DNA

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como montar e utilizar um sensor de dano ao DNA com marcação dupla que identifica dois tipos principais de quebras no DNA em cortes de tecido. O sensor é composto por um oligonucleotídeo de DNA de 30 tumores, marcado duplamente com ZI e Rumina, e uma enzima, a topoisomerase um do vírus vaccinia ou vac topo, que se auto monta. Quando a vac topo se liga ao oligonucleotídeo de 30 tumores, a operação da máquina começa quando a topo cliva o oligonucleotídeo na extremidade três prima da sequência de reconhecimento, resultando em uma unidade ativada de vac topo marcada com fitza e um hairpin livre marcado com amina.

Com um hidroxila terminal no extremo três-primo, as unidades têm vida curta e são rapidamente remontadas de volta ao construto original, que posteriormente é clivado. Na ausência de quebras adicionais de DNA extramoleculares, essas duas unidades se separam e se reorganizam continuamente de maneira cíclica. Quando o sensor molecular é aplicado em seções de tecido com dano ao DNA, a unidade detectora marcada com Fitz liga-se seletivamente às quebras de DNA com extremidades rombas e hidroxila no extremo cinco-primo.

A unidade detectora marcada com o domínio R ligará a uma quebra romba com fosfato na extremidade cinco-prime. Na presença da DNA ligase T4, são obtidos resultados que mostram a presença e distribuição dos tipos de quebras de DNA um e dois nas células, com base na microscopia de fluorescência. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes para detecção de HESIs, como o teste TUNEL, é que ela é mais específica e fornece informações adicionais ao marcar tanto as fases autônomas quanto as fagocíticas da apoptose.

Do ponto de vista da nanotecnologia, o sensor exemplifica uma abordagem habilitada por bio que adapta estruturas e arquiteturas biológicas reais para a construção de dispositivos não tóxicos em escala molecular. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois seu sucesso depende do uso de uma preparação altamente ativa de Toro SOM e do processamento correto das seções para evitar superdigestão pela proteinase K. As seções de tecido para este procedimento devem ser preparadas antes da montagem do dispositivo molecular. Cortes com espessura de cinco a seis mícrons obtidos de paraldeído.

Recomendam-se blocos de tecido emblocados em parafina fixada. Coloque a lâmina com a seção de tecido em uma rack para lâminas e desparafine em xilol durante 15 minutos. Após 15 minutos, transfira para um banho fresco de xilol por mais cinco minutos.

Reidrate a seção passando a lâmina através dessas concentrações graduadas de etanol: etanol 96% duas vezes, por cinco minutos cada; etanol 80% por cinco minutos, seguido por água.

Duas vezes, cinco minutos cada vez. Após a reidratação, digerir a seção com proteinase K. Usando 100 microlitros de uma solução de 50 microgramas por mililitro por seção, incubar por 15 minutos à temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Dependendo do tipo de tecido, o tempo de digestão pode precisar ser ajustado, mas é necessário ter cuidado para evitar superdigestão, pois ela causa desaparecimento do sinal e ruptura da seção quando a digestão estiver completa.

Lave a lâmina em água destilada duas vezes, durante 10 minutos cada. Aplique BSA 2% para pré-bloqueio e incube por 15 minutos à temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Durante esse tempo, monte a máquina molecular conforme mostrado a seguir neste vídeo.

Todos os reagentes para a montagem da máquina molecular são dimensionados para um volume total de 25 microlitros, o que é suficiente para uma única detecção em uma seção de tecido de tamanho médio. O volume pode ser aumentado conforme necessário em um tubo plástico pequeno. Combine os seguintes reagentes nesta ordem com água destilada.

Tampão de DNA Ligase 15% polietileno glicol 8.000 T quatro, oligonucleotídeo duplamente marcado vaccinia topoisomerase um e DNA Ligase T quatro misturados suavemente por pipetagem. A construção molecular irá se auto-montar quase instantaneamente nesta solução e pode ser usada imediatamente à temperatura ambiente. Para iniciar o procedimento de marcação de quebras de DNA, aspire a solução de pré-bloqueio da lâmina.

Adicione 25 microlitros da mistura de reação completa em cada seção. Coloque uma lamínula de plástico sobre a seção e posicione a lâmina em uma câmara umidificada. Proteja da luz envolvendo a câmara com papel alumínio e incube por uma hora à temperatura ambiente.

Embora os sinais de ligase e topo possam ser observados após a incubação de uma hora, em muitos casos, o sinal da ligase pode ser ainda mais intensificado. Para aumentar o sinal, reaplique a mistura de reação sem vac topo e oligonucleotídeo um, mas com oligonucleotídeo três e T four DNA Ligase, coloque uma lamínula de plástico sobre a seção e incube em uma câmara umidificada por 18 horas. No dia seguinte, à temperatura ambiente, imerga suavemente a lâmina verticalmente em um frasco Coplin contendo água à temperatura ambiente para remover a lamínula.

Em seguida, lave a seção com água destilada três vezes, durante 10 minutos cada. Enxágue a seção com tampão de bicarbonato de sódio. Esse enxágue com solução alcalina potencializa a fluorescência da fitzina, que é sensível ao pH e é significativamente reduzida abaixo de um pH de sete.

Por fim, cubra o corte com uma solução antidesbotamento que também contém DPI para contracoloração dos núcleos e aplique uma lamínula. Os cortes estão agora prontos para microscopia de fluorescência. Mostrado nesta figura está um corte de tecido do timo tratado com dexametasona, no qual a máquina molecular detectou quebras de DNA do tipo um e do tipo dois com extremidades rombas, em áreas corticais do timo que estão passando por apoptose, com fluorescência citoplasmática verde indicando quebras do tipo DNA dois e macrófagos corticais de Marx digerindo o material nuclear de timócitos apoptóticos.

Esse sinal é produzido por vac topo e se localiza em lisossomos FGA com DNA contendo hidroxila em cinco primas. Quebras de dupla fita com fluorescência vermelha indicam rótulos de um tipo de quebra do DNA, núcleos de timócitos apoptóticos não fagocitados por macrófagos. Grandes quantidades de timócitos realizam apoptose simultaneamente.

Acompanhado pela geração de quebras em dupla fita com fosfato na extremidade 5' visualizadas por marcação baseada em ligase. Essas quebras estão localizadas na periferia nuclear e formam padrões em forma de anel. Todos os núcleos celulares estão em azul, visualizados por contra-coloração com dpi.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de nunca permitir que os cortes sequem entre a adição de diferentes soluções. Mantenha também todas as preparações enzimáticas em gelo antes de adicionar os cortes e proteja suas sondas fluorescentes da luz durante a reação de marcação após o seu desenvolvimento. A técnica permitiu a visualização de todas as fases da desmontagem de células heterólogas.

Este sensor em si é um exemplo da abordagem de nanotecnologia verde para o projeto de partículas, sondas e máquinas em escala nanométrica. Essa abordagem combina componentes artificiais com partes de máquinas moleculares naturalmente ocorrentes. O objetivo é eliminar a toxicidade e a reatividade biológica adversa desses materiais nanoestruturados altamente dispersos.