Isolamento e Expansão da Human Glioblastoma Multiforme Células Tumorais Utilizando o Ensaio Neurosphere
30 de outubro de 2011
Este protocolo vídeo demonstra o isolamento e expansão de células-tronco como de mutliforme glioblastoma humano ressecado cirurgicamente (GBM) tecido tumoral utilizando o método de cultura neurosphere ensaio.
O objetivo deste protocolo é o isolamento e a expansão de células tumorais de glioblastoma multiforme humano utilizando o método de neuroesferas. Isso é alcançado inicialmente pela trituração do tecido tumoral colhido, seguida pela dissociação mecânica e, finalmente, pelo plaqueamento das células resultantes para crescerem em cultura de neuroesferas. Neste vídeo, vamos mostrar como isolar e expandir células semelhantes a células-tronco a partir de tecido tumoral de glioblastoma humano utilizando o método de cultura de neuroesferas.
Este método também pode ser utilizado para cultivar células de outros tumores cerebrais, bem como tumores sólidos, como os de mama, próstata, fígado e pulmão. Pronto, vamos começar. Após receber o tecido tumoral de GBM ressecado proveniente da cirurgia, o meio é removido.
O tumor é lavado duas ou três vezes usando PBS estéril para remover contaminantes como sangue e debris. Após a lavagem, coloque o tumor ressecado em uma placa de Petri estéril. Primeiro, corte o tumor em porções menores, depois transfira uma porção do tecido tumoral para uma placa de Petri separada e pique o tecido usando uma lâmina número 10 em pedaços minúsculos.
Isso aumentará a área superficial disponível para a dissociação enzimática. O picamento pode levar de um a três minutos, dependendo do tamanho do tumor. Agora, adicione de três a cinco ml de tripsina pré-aquecida ao tecido picado e transfira-o para um tubo falcon estéril de 15 ml.
Coloque o tubo de 15 mL em banho-maria a 37 graus por 10 a 15 minutos. Agite o tubo a cada cinco minutos. Para garantir uma melhor digestão do tecido, adicione um volume igual de inibidor de tripsina para interromper a reação.
A ativação da tripsina é garantida pipetando para cima e para baixo várias vezes. Centrifugue a suspensão a 800 RRP M ou 110 G durante cinco minutos. Remova o sobrenadante, depois re-suspenda o pellet em um mL de meio basal para células-tronco neurais, colocando a ponteira contra o fundo do tubo.
Pipete para cima e para baixo de três a sete vezes para desfazer grumos até obter uma suspensão leitosa, pois pipetar em excesso pode resultar em morte celular. Coloque um filtro de 40 micrômetros sobre um tubo de 50 ml. Agora, adicione 10 a 15 ml de meio basal à suspensão celular e misture suavemente, passando a suspensão celular através do filtro de 40 micrômetros para remover detritos e grumos não associados.
PT as células e remova o sobrenadante a vácuo. Re-suspenda as células em um a dois mL de meio completo. Em seguida, pipete suavemente para cima e para baixo para homogeneizar a suspensão.
Misture 10 microlitros da suspensão celular em 90 microlitros de azul de tripano. Homogeneíze bem a suspensão e transfira 10 microlitros para o hemocitômetro. Realize uma contagem celular conforme mostrado aqui.
É necessária uma suspensão de células únicas, sem agregados, para obter uma contagem celular precisa. Não inclua células positivas para azul de tripano. Ao contar para semear as células em um frasco T80.
Adicione 20 ml de meio completo para células-tronco neurais a um tubo de 50 ml. Adicione a quantidade apropriada de suspensão celular para atingir uma densidade de 200.000 células por ml. Agora, adicione EGF para obter uma concentração final de 20 nanogramas por ml.
Adicione heparina 0,2% na concentração de um microlitro por ml. Por fim, adicione BFGF para atingir uma concentração final de 10 nanogramas por ml. Misture as células em meio completo suplementado com fatores de crescimento.
Em seguida, transfira a suspensão para um frasco T 80. Coloque o frasco no incubador a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por sete a dez dias. Após oito dias em cultura, as esferas estão completamente desenvolvidas e prontas para serem repassadas.
Colete o conteúdo do frasco e transfira para duas centrífugas de 50 ml. Centrifugue as células a 800 RPM por cinco minutos. Remova o sobrenadante a vácuo, depois re-suspenda o pellet em 1 ml de tripsina pré-aquecida.
Incube as células em banho-maria a 37 graus Celsius por dois minutos. Adicione uma quantidade igual de inibidor de tripsina e misture bem para garantir uma ativação. Em seguida, peloteie as células.
Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 ml de meio completo, pipetando suavemente para cima e para baixo para homogeneizar a suspensão celular. Realize uma contagem celular conforme descrito anteriormente, para semear as células em um frasco T80 com 20 ml de meio completo em um tubo de 50 ml. Adicione uma quantidade apropriada de suspensão celular para atingir uma densidade de 50.000 células por ml.
Agora adicione fatores de crescimento, incluindo E-G-F-B-F-G-F e heparina, na concentração descrita anteriormente. Misture suavemente a suspensão celular resultante e, em seguida, transfira a suspensão para um frasco T 80 e coloque no incubador por sete a dez dias. Este é um exemplo de cultura primária de GBM.
Após quatro dias nesta fase, é possível observar que as células estão se proliferando e começando a formar esferas. Você não deve observar grandes aglomerados esféricos de células nesta fase. Isso teria resultado de um preparo inadequado do tecido.
Após sete a 10 dias em cultura, esferas de tamanhos variados se formaram; quando as esferas atingem um diâmetro médio de 150 a 200 micrômetros, estão prontas para serem subcultivadas. Este é um exemplo de cultura de passagem de GBM após oito dias. Novamente, é possível observar esferas de tamanhos variados; esferas saudáveis exibem microespículas em sua periferia.
Preparar uma suspensão de células isoladas é uma questão muito importante em qualquer cultura de esferoides. Caso contrário, você poderá acabar observando agregados celulares mesmo no dia seguinte ao plaqueamento das células. Esses agregados podem ser considerados esferoides, mas deve-se notar que leva pelo menos uma semana para que as células perfurem e formem esferoides verdadeiros.
A quantidade de detritos em culturas de esferas de tumor primário varia conforme diversos fatores, como a origem do tecido, o quão preciso foi o seu isolamento e também a técnica de processamento do tecido. Esperamos que este vídeo seja útil e desejamos boa sorte em seus experimentos.
Visão Geral
Este protocolo em vídeo demonstra o isolamento e a expansão de células semelhantes a células-tronco a partir de tecido tumoral de glioblastoma multiforme humano (GBM) ressecado cirurgicamente, utilizando o método de cultura por ensaio de neuroesferas. O protocolo descreve as etapas desde o preparo do tecido até o cultivo celular, fornecendo informações sobre as técnicas utilizadas para a expansão bem-sucedida das células.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Oncologia
Antecedentes
- O glioblastoma multiforme (GBM) é um tumor cerebral altamente agressivo.
- O isolamento de células semelhantes a células-tronco é fundamental para o estudo da biologia tumoral.
- Os métodos de cultura de neuroesferas permitem o crescimento dessas células in vitro.
- Este protocolo também pode ser aplicado a outros tumores cerebrais e sólidos.
Objetivo do Estudo
- Isolar e expandir células semelhantes a células-tronco a partir de tecido de GBM.
- Fornecer um método confiável para estudar a biologia do glioblastoma.
- Facilitar a pesquisa sobre possíveis alvos terapêuticos.
Métodos Utilizados
- Coleta e lavagem do tecido tumoral.
- Fragmentação e dissociação enzimática do tecido.
- Contagem celular e semeadura em cultura de neuroesferas.
- Suplementação com fatores de crescimento para expansão celular.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de células semelhantes a células-tronco a partir de tecido de GBM.
- Formação de neuroesferas indicando crescimento celular saudável.
- Demonstração da importância da suspensão unicelular para o cultivo.
- Observação da morfologia das esferas como indicador da saúde do cultivo.
Conclusões
- O ensaio de neuroesferas é eficaz para o cultivo de células semelhantes a células-tronco de glioblastoma.
- A preparação adequada do tecido é fundamental para resultados bem-sucedidos.
- Este método pode auxiliar na compreensão do glioblastoma e no desenvolvimento de tratamentos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O ensaio de neuroesferas permite o isolamento e a expansão de células semelhantes a células-tronco de glioblastoma, fornecendo um sistema relevante para a doença, útil na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos oncológicos. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva ao modelar populações de células iniciadoras de tumores, essenciais para compreender a progressão do GBM e a resistência terapêutica. Facilita os fluxos de trabalho iniciais de descoberta ao gerar modelos celulares escalonáveis e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios e identificação de compostos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de populações de células iniciadoras de tumor para esclarecer hipóteses terapêuticas e dependências de vias em GBM.
- Valor Operacional: Fornece um método reprodutível para isolar células semelhantes a células-tronco a partir de tecido humano ressecado cirurgicamente, para validação funcional de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos pré-clínicos ao modelar a capacidade de autorrenovação e tumorigênica de células-tronco cancerígenas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera culturas uniformes de neuroesferas adequadas para triagem de alto conteúdo de compostos que visam vias de indiferenciação celular.
- Valor Operacional: Estabelece condições padronizadas de cultura com suplementação definida de fatores de crescimento (EGF, bFGF, heparina) para reprodutibilidade do ensaio.
- Escalabilidade: Permite repicagem e expansão de culturas primárias, viabilizando estudos longitudinais de resposta a fármacos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a relevância da doença ao preservar as características genômicas e fenotípicas de tumores primários de GBM in vitro.
- Valor Operacional: Facilita o alinhamento de biomarcadores por meio da morfologia das esferas e métricas de tamanho (150-200 µm) como indicadores da saúde do cultivo.
- Mitigação de Riscos: Permite avaliar o impacto terapêutico sobre a autorrenovação de células semelhantes a células-tronco, orientando decisões de avanço ou interrupção no desenvolvimento pré-clínico.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio de neuroesferas insere-se na fase inicial da descoberta, apoiando a validação de alvos por meio de ensaios funcionais em modelos de células semelhantes a células-tronco antes da identificação de compostos líderes e dos testes de eficácia pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir o isolamento de células iniciadoras de tumor para investigar os fatores que impulsionam a progressão e a recorrência de GBM.
- Triagem: Fornece a formação quantitativa e reprodutível de neuroesferas como leitura funcional para triagem de compostos e modulação de vias.
- Análises: Oferece parâmetros mensuráveis, incluindo diâmetro, contagem e morfologia das esferas, para avaliar a integridade do cultivo e a resposta a fármacos.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta científica ao trabalho pré-clínico, mantendo as propriedades de células semelhantes a células-tronco essenciais para modelar a heterogeneidade tumoral.
- Reutilização em Ambiente Corporativo: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo de múltiplos tumores sólidos, incluindo cânceres de mama, próstata, fígado e pulmão, conforme mencionado no protocolo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo ao modelar a subpopulação celular responsável pela iniciação, progressão e recorrência do tumor.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de etapas padronizadas de dissociação, filtração e semeadura para obtenção de suspensões monocelulares.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos em alvos por meio de ensaios funcionais de células-tronco.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco ao identificar compostos que modulam a autorrenovação e diferenciação de células-tronco cancerígenas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em manipulação estéril de tecidos, dissociação enzimática e técnicas de cultivo de neuroesferas.
- Depende do acesso a incubadoras de cultura celular estéreis, centrífugas e hemocitômetros para contagem celular e avaliação de viabilidade.
- Necessita de protocolos padronizados para o processamento de tecidos, a fim de minimizar a formação de detritos e agregados que comprometam a qualidade das esferas.
- Requer adaptação das concentrações de fatores de crescimento com base na origem do tumor e na qualidade do tecido, já que a variabilidade afeta a formação de neuroesferas.
- Limitado pela necessidade de tecido tumoral fresco ou adequadamente preservado para garantir o isolamento e a expansão de células com características de células-tronco viáveis.
