Simples e robusto In vivo E In vitro Abordagem para o Estudo Assembléia Virus

O objetivo geral deste procedimento é estudar a montagem de vírus in vivo e in vitro. Isso é realizado primeiramente expressando os RNAs do vírus mosaico do brócolis em bactérias e expondo-os a células vegetais por meio de infiltração com Agrobacterium. Em seguida, os virions do BMV são purificados das folhas infiltradas.

Em seguida, são preparadas subunidades da proteína do capsídeo para montagem in vitro. Por fim, os varians do BMV são montados in vitro utilizando a proteína do capsídeo e o corante verde de indocianina. Em última análise, os resultados demonstram os varians do mosaico do brocolis montados in vitro por meio da formação de fantasmas ópticos, que podem ser determinados pela absorvância e emissão de fluorescência.

Hoje vamos demonstrar uma técnica conhecida como filtração, a qual é útil para entregar componentes virais às plantas. A principal vantagem dessa técnica é eliminar a necessidade de produzir transcritos in vitro e, ao mesmo tempo, permitir a entrega de múltiplos componentes a uma mesma célula, possibilitando uma infecção sincronizada. O trabalho que estamos atualmente desenvolvendo envolve o uso do vírus do mosaico do brócolis em combinação com um cromóforo aprovado pela FDA, o verde cianina, para fabricar um novo tipo de nanopartícula para aplicações biomédicas.

E especificamente, nosso objetivo é utilizar essas estruturas, que denominamos fantasmas de fios ópticos ou OB gs, para modalidades de imagem óptica, incluindo imagem de fluorescência e imagem fotoacústica, bem como para terapia a laser. Uma aplicação clínica específica que estamos atualmente desenvolvendo é o uso dessas estruturas para imagem de câncer de ovário em conjunto com procedimentos intraoperatórios. E a ideia é que podemos funcionalizar essas estruturas.

O OBG com o motivo de direcionamento específico que pode reconhecer células tumorais residuais, que no caso do câncer de ovário podem estar especialmente na cavidade peritoneal. A partir de uma placa de agrobactéria previamente preparada, contendo o RNA do vírus do mosaico marrom um, dois ou três, escolha uma única colônia para inocular dois mililitros de LB contendo 50 microgramas por mililitro de canamicina e 100 microgramas por mililitro de rifampicina. Incube a cultura por um dia a 28 graus Celsius em agitador orbital a 250 RPM. Inocule 50 mililitros de LB em um erlenmeyer de 500 mililitros com um mililitro da cultura e incube por 16 horas a 28 graus Celsius em agitador orbital a 250 RPM no dia seguinte. Quando as culturas atingirem uma OD 600 de 1,0, transfira-as para tubos estéreis de 30 mililitros e centrifugue por 10 minutos.

A 5.000 RPM e quatro graus Celsius, dissolva os pellets em 10 mililitros de cloreto de magnésio 10 milimolar e centrifugue por 10 minutos a 5.000 RPM e quatro graus Celsius. Repita este passo mais uma vez para garantir a remoção completa do antibiótico. Em seguida, suspenda os pellets em 10 mililitros de tampão contendo MES 10 milimolar e cloreto de magnésio 10 milimolar.

Meça a DO600 de cada cultura e ajuste para uma DO600 de 0,1 utilizando cloreto de magnésio 10 milimolar e MES 10 milimolar. Em seguida, combine 10 mililitros de cada uma das três suspensões de cultura com DO600 0,1. Adicione acetofenona até uma concentração final de 100 milimolar.

Agite suavemente e mantenha a mistura em repouso à temperatura ambiente por três horas. Após a incubação, aspire a cultura para dentro de uma seringa de um mililitro sem agulha. Infiltra a suspensão da cultura no lado axial de duas a três folhas bem expandidas de N. benthamiana pressionando suavemente a seringa contra metade da superfície abaxial de cada folha.

Mantenha as plantas infiltradas no viveiro a 24 graus Celsius por três a quatro dias antes de colher as folhas. Após purificar os viriões do BMV, prepare um litro de tampão de dissociação de vírus um x. Em seguida, prepare a membrana de diálise.

De acordo com o método de Sambrook et al., distribua de cinco a 10 miligramas por mililitro de vírus purificado em um saco de diálise e coloque o saco em um frasco contendo tampão de dissociação 1 x vírus. Realize a diálise do vírus por 24 horas a quatro graus Celsius sob agitação.

Colete a solução do saco de diálise e centrifugue a 30.000 RPM durante 30 minutos a quatro graus Celsius para formar um pellet com quaisquer partículas virais não associadas. Centrifugue o sobrenadante a 30.000 RPM durante três horas a quatro graus Celsius. Após preparar os transcritos de RNA para serem remontados em viriões, misture as subunidades da proteína do capsídeo e os transcritos de RNA numa proporção de um para cinco.

Dispense a mistura em um saco de diálise e fixe-o adequadamente para evitar vazamentos. Após preparar um litro de tampão de montagem de RNA 1X, realize a diálise da mistura da reação de remontagem no tampão a quatro graus Celsius por 24 horas; no dia seguinte, retire a mistura do saco de diálise e adicione 1,5 mililitros de tampão de montagem de RNA. Em seguida, centrifugue novamente a 30.000 RPM por três horas a quatro graus Celsius. Então, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet.

Em seguida, estime a concentração de virions em OD 260 nanômetros. Em seguida, determine a concentração das subunidades proteicas do capsídeo em OD 280 nanômetros ou por outros métodos, como o ensaio de Bradford, para avaliar a integridade das subunidades proteicas do capsídeo dissociadas. Realize eletroforese em gel de SDS 12 a 15%, seguida de western blotting. Por fim, siga o procedimento descrito no protocolo escrito para gerar fantasmas virais ópticos ou ov cheese.

É mostrada aqui uma imagem de microscopia eletrônica de transmissão de BMV Varion corado negativamente, purificado de plantas end hamana agroinfiltradas com uma mistura dos três construtos agri de BMV selvagem. Esta imagem de MET mostra fantasmas virais ópticos contendo verde indocianina corados negativamente. Aqui, os espectros de absorvência e de fluorescência para fantasmas virais ópticos são apresentados uma vez dominados.

Essa técnica pode ser realizada em cinco minutos por amostra. Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de compreender bem como encapsular componentes virais ou não virais nas subunidades proteicas do capsídeo.