Name: Simples e robusto In vivo E In vitro Abordagem para o Estudo Assembléia Virus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a montagem viral in vivo e in vitro usando Agrobacterium em plantas Nicotiana benthamiana. Este método permite purificar vírios do BMV e criar fantasmas ópticos para aplicações biomédicas avançadas.

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Os autores gostariam de agradecer a vários membros do laboratório para as suas sugestões valiosas para o desenvolvimento de agroinfiltration e em ensaios in vitro de montagem. Este trabalho foi financiado por uma bolsa da Universidade da Califórnia. Este estudo foi financiado em partes por uma concessão do National Science Foundation (CBET-1144237).

1. O material vegetal <ol><li> Plantas de Nicotiana benthamiana a serem utilizados no ensaio de encapsidação deve estar na fase 4 folhas (plantas semana aproximadamente 3-4 de idade). </li></ol> 2. Entrega e expressão de componentes funcionais do genoma viral para plantar células por agroinfiltration <ol><li> Dia 1: A estirpe de Agrobacterium (por exemplo, EH 105 ou GV 3101) abrigando o RNA pCass-BMV 1, BMV RNA 2 e 3 BMV RNA 1,2 são cultivadas em placas de LB agar suplementado com 50 mg / ml de canamicina (selecciona para o vetor pCASS) e 100mg/ml de rifampicina (seleciona para o Agrobacterium). A incubação é realizada a 28 ° C durante dois dias. </li><li> Dia 3: única colónia Inocular a partir da placa de agar LB em 2 ml de caldo LB contendo 50 mg / ml de canamicina e 100 mg / ml de rifampicina durante 1 dia a 28 ° C em agitador orbital fixado em 250 RPM. </li><li> Dia 4: Inocular 50 ml de suplemento de caldo LBed com 50 mg / ml de canamicina e 100 mg / ml de rifampicina, 10 mM de MES pH 5,6 e 100 mM de acetoseringona com um ml de cultura em um 250 ml de Erlenmeyer durante 16 horas a 28 ° C em agitador orbital a 250 rpm . </li><li> Dia 5: Transferência da cultura (quando OD 600 atingiu 1,0) para um tubo Oak Ridge ou tubo Falcon estéril e centrifugar durante 10 minutos a 5000 rpm a 4 ° C. </li><li> Dissolve-se o pellet em 10 ml de 10 mM de MgCl2 e centrifuga-se durante 10 minutos a 5000 rpm a 4 ° C, Repetir este passo mais uma vez para assegurar a remoção completa do antibiótico. </li><li> Suspender o sedimento em 10 ml de tampão contendo 10 mM de MgCl2 e 10 mM de MES (pH 5,6). </li><li> Medir a OD 600 para cada cultura de BMV RNA 1, 2 e RNA do RNA 3 e ajusta-se 0,1 OD 600 utilizando 10 mM de MgCl2 e 10 mM de MES (pH 5,6). </li><li> Misturar 1 ml cada todos os três 0,1 OD 600 suspensões de cultura. </li><li> Adicionar 100 mM de acetoseringona, mix gently e manter a mistura não perturbada à temperatura ambiente durante 3 horas. </li><li> Desenhar a suspensão de cultura em 1 ml. seringa sem agulha. </li><li> Infiltrar-se na suspensão cultura acima no lado abaxial de 2-3 bem expandidos folhas de N. benthamiana (5 folhas, as plantas fase de 3-4 semanas de idade), pressionando cuidadosamente a seringa para uma metade da superfície abaxial de folha. </li><li> Repita este procedimento de infiltração para outras folhas. </li><li> Mantenha as plantas infiltradas na casa verde com 24 ° C. </li><li> Colheita infiltrada folhas de 3 a 4 dias depois da infiltração (dpi). </li></ol> 3. Purificação de viriões BMV <ol><li> Colete N. benthamiana deixa agroinfiltrated com uma mistura contendo todos os três agrotransformants tipo selvagem BMV. </li><li> Moer folhas em um pilão e almofariz estéril com um volume igual (w / v) de tampão de extracção BMV (0,5 M NaAc; 0,08 M ​​MgAc, pH 4,5 e volume 1/100 de β-mercaptoetanol, que é para ser adicionado imediatamente antes da utilização) 3. Para maximizar o rendimento do vírus, é recomendável adicionar areia lavada ácido (~ 0,5-1 g) que facilita rompimento celular fácil trituração e eficiente. </li><li> Filtrar o extrato da folha através de 2-3 camadas de musselina e recolher a enxurrada. </li><li> Novamente moer a parte retida sobre o pano de musselina com igual volume de tampão de extracção BMV ao peso inicial do material de folha. </li><li> Repita o procedimento de filtração, utilizando pano de musselina. Estes passos devem ser realizadas a 4 ° C. </li><li> Transferir a solução de filtrado para um tubo de centrífuga e adicionar volume igual de pré-refrigeradas clorofórmio e vórtice (ou agitação) durante 5 minutos à temperatura ambiente até que a cor da suspensão vira verde claro. </li><li> Centrifugar a solução emulsionada durante 15 minutos a 12.000 rpm a 4 ° C. </li><li> Recolher a fase aquosa e agita-se durante 30 minutos em um agitador magnético para remover qualquer clorofórmio residual. </li><li> Transferir a suspensão para um tubo de ultracentrifuga estéril. </li><li&gt; Underlay 1 ml. Sacarose a 10% (preparada no tampão de extracção de vírus) como um 3 almofada. </li><li> Centrifugar a 30.000 rpm durante 3 horas numa ultracentrífuga Beckman a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante e suspender o pellet em volume desejado de BMV tampão de suspensão (para preparar a suspensão de tampão de tampão de extracção diluído BMV a 1/10 com água destilada estéril). </li><li> A preparação do virião parcialmente purificada a partir do passo acima é submetida a 10-40% centrifugação em gradiente de sacarose de densidade para 150 min a 28000 rpm a 4 ° C. </li><li> Coletar a banda de vírus manualmente ou por um fraccionamento. A banda vírus aparecem em azul sob iluminação de luz branca. </li><li> Dilui-se a solução de sacarose contendo amostra de vírus pelo menos 50% com tampão de suspensão de vírus. </li><li> Centrifugar diluída vírus solução de sacarose contendo durante 3 horas à 30.000 rpm numa ultracentrífuga Beckman a 4 ° C. </li><li> Finalmente suspender o vírus altamente purificada pelete num volume desejado de Virnos suspensão buffer. </li><li> Medir a concentração do virião (mg / ml) usando espectrofotómetro a OD 260. </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/3645/3645eq1.jpg" /> Nota: Com base no conteúdo de ARN, o coeficiente de extinção para BMV é 5 4. <ol start="19"><li> Verificar a pureza de viriões por visualização sob MET (Fig. A) </li></ol> 4. Preparação de subunidades de proteínas da cápside de montagem in vitro <ol><li> Prepare 1 litro de tampão 1x vírus dissociação (0,5 M de CaCl2, 50 mM Tris HCl, pH 7,5; 1,0 mM de EDTA, 1,0 mM de DTT e 0,5 mM de PMSF) 5. </li><li> Preparar membrana de diálise de acordo com Sambrook et ai 6. </li><li> Pipetar concentração necessária de vírus purificado em um saco de diálise. </li><li> Coloque o vírus saco de diálise contendo a um copo contendo o vírus 1x tampão de dissociação. </li><li> Dialisar 24 horas a 4 ° C whilagitação e. </li><li> Recolher a solução a partir do saco de diálise, após 24 horas e centrifugar a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Isto irá separar o ARN a partir dos viriões BMV dissociados. </li><li> Recolher o sobrenadante e centrifugar a 35.000 rpm em centrífuga Beckman durante 3 horas a 4 ° C para sedimentar quaisquer partículas de vírus un-dissociados. </li><li> Recolher o sobrenadante. </li><li> Nesta fase é fundamental para remover todos os contaminantes a partir de RNA virion dissociados subunidades da proteína do capsídeo. Para fazer isto, o sobrenadante do passo 8 deve ser submetido a outro ciclo de noite sobre a remontagem das subunidades de proteínas da cápside, sem adicionar qualquer RNA (em tampão de montagem RNA 1x, ver abaixo), seguido de uma centrifugação a alta velocidade (30.000 rpm, durante 3 horas à 4 ° C) para sedimentar quaisquer viriões montadas. Após este passo remontagem, o sobrenadante contendo subunidades de proteína revestimento seria livre de quaisquer contaminantes residuais RNA. No entanto, para garantir que esta, é aconselhável realizar um adicional em vitro remontagem com subunidades da proteína usando casaco apenas RNA tampão 1x montagem. Depois de durante a noite remontagem, a preparação deve estar livre do vírus da montados (verificar usando MET). </li><li> Determinar a concentração de subunidades de proteína da cápside por medição em OD 254 e 280 nm ou por outros métodos, como ensaio de Bradford. </li><li> Realizar 12-15% de SDS-PAGE seguido por Western blot para determinar a integridade dos dissociados subunidades da proteína da cápside. </li></ol> 5. In vitro montagem de RNA contendo os viriões <ol><li> Preparar transcritos de RNA de ser re-montados em viriões e calcular a concentração de 7. </li><li> Misturar subunidades da proteína da cápside e RNA transcrito a uma razão de 1:5 (peso / peso) 5. </li><li> Distribua a mistura acima para um saco de diálise e garantir de forma adequada para evitar vazamentos. </li><li> Prepare 1.000 ml. de RNA 1x montagem tampão (50 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,2; 10 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 1,0 mM de DTT) 5. </li><li> Coloque o saco de diálise contendo a mistura de reacção contra a 1x tampão de montagem para o copo e agitar. </li><li> Dialisar a reacção a montagem, a 4 ° C durante 24 horas por agitação suave. </li><li> Recolher-se a mistura a partir do saco de diálise, após 24 horas e adicionar 1,5 ml de tampão de RNA de montagem. </li><li> Passa esta mistura através de uma coluna Centricon-100 por centrifugação a baixa velocidade (2000 xg) durante 30 minutos. </li><li> Lavar a coluna uma vez com 1,5 ml de tampão de montagem, a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Repetir o passo de lavagem acima duas vezes. </li><li> Finalmente, eluir os viriões re-montado por centrifugação a 10.000 g, a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Estimar a concentração de OD virion 260 nm. </li></ol> 6. Fabricação de óptica Ghosts Viral (OVGs) <ol><li> Adicionar verde de indocianina (ICG) 8 para a proteína purificada da cápside em rácio de concentração desejada (a proporção em peso de Indocianina proteína verde e cápside utilizado neste relatório foi 1:10) um<html> d misture bem por pipetagem. </li><li> Dialisar a proteína da cápside e solução ICG contra o tampão de montagem OVG (1 M de NaCl, 50 mM de NaAc; 1 mM de EDTA e 1 mM de DTT, pH4.8), a 4 ° C durante 24 horas. </li><li> Após 24 horas, recolher a solução a partir do saco de diálise (12 kDa tamanho de poro) e centrifugar a 90.000 rpm durante 1 hora a 4 ° C (Fig. B) </li><li> Remover o sobrenadante e suspender o sedimento em tampão BMV suspensão em vórtice ou permitindo que a suspensão, por si só em tampão BMV suspensão durante a noite a 4 ° C. </li><li> Verifique a morfologia de OVGs por TEM (Fig. C). </li><li> Medir a absorvância de 240 nm a 950 nm utilizando espectrofotômetro (Cary 50, Varian Inc.); a presença de ICG é confirmada por picos de absorvância de assinatura cerca de 700 nm e 790 nm 8. (Fig. D) </li><li> Os típicos ICG picos de fluorescência em ~ 700 nm e ~ 800 nm pode ser visto sobre 620 nm de excitação de solução OVG (Fig. D) utilizando espectrofluorímetro (Fluorolog 3, Jobin-Yvon). </li></ol>_title &quot;&gt; 7. resultados representativos <img alt="Figura A" src="/files/ftp_upload/3645/3645figA.jpg" /> Figura A. Imagem TEM de viriões coradas negativamente VMB purificadas de N. benthamiana plantas agroinfiltrated com uma mistura de todos os três agroconstructs tipo selvagem BMV (Barra de escala = 100 nm). <img alt="Figura B" src="/files/ftp_upload/3645/3645figB.jpg" /> Figura B. Pellet da in vitro montado ICG OVGs contendo sequência de alta velocidade de centrifugação. <img alt="Figura C" src="/files/ftp_upload/3645/3645figC.jpg" /> Figura C. imagem TEM de coradas negativamente ICG OVGs contendo (barra de escala = 100 nm). <img alt="Figura D" src="/files/ftp_upload/3645/3645figD.jpg" /> Figura Absorbância D. (Top) e fluorescência de espectros (fundo) de OVGs. O comprimento de onda de excitação utilizado para OVG emissão wcomo 620 nm.

<ol><li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta%3A+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li>
<li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses%3A+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li>
<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnnamalai%2C+P+%22Plant+Virology+Protocols%22">Plant Virology Protocols</a>. Foster, N., Johansen, H. 451, Humana Press. 251-264 (2008).</li>
<li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li>
<li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li>
<li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrrok%2C+J+%22Molecular+Cloning.+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning. A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
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<li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22A.C.S.+Nano%22%5BJournal%5D)">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li>
<li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li>
<li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce%2C+tomato+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

Abordagem Agroinfiltration aqui apresentadas podem ser amplamente aplicável a uma ampla gama de vírus de plantas. Uma característica marca desta abordagem é sincronizado entrega de agroconstruct múltipla para a célula-a mesma desvantagem importante geralmente associado com rotineiramente utilizado inoculação mecânica de vírus de plantas. In vivo e in vitro de montagem, utilizando brome vírus do mosaico como um modelo pode ser conduzida de forma eficiente pela a seguir algumas dicas. (i) para a infiltra...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Sódio sais MES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2993 </td></tr><tr><td> Indocianina verde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2633 </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga Beckman </td><td> Beckman Coulter </td><td> Modelo: L8-70M </td></tr><tr><td> Centricon-100 coluna </td><td> Millipore </td><td> YM-100 </td></tr><tr><td> Espectrofotômetro </td><td> Cary 50, Varian Inc. </td><td> Número da peça 10068900 </td></tr><tr><td> Espectrofluorímetro </td><td> Fluorolog 3, Jobin-Yvon. </td><td> Número da peça FL3-21 </td></tr></tbody></table>

simples e robusto in vivo e in vitro abordagem para o estudo assembléia virus

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Em vírus com sentido positivo patogênico genomas RNA de seres humanos, animais e plantas, de encapsidação progênie em viriões maduros e estáveis ​​é uma fase cardeal durante o estabelecimento da infecção em um determinado host. Consequentemente, o estudo de encapsidação decifra as informações sobre o know-how do mecanismo de regulação montagem do vírus para formar virions infecciosos. Essa informação é vital na formulação de novos métodos de contenção propagação do vírus e controle da doença. Encapsidação vírus pode ser estudada in vivo e in vitro. Encapsidação Genoma in vivo é um processo altamente regulado seletiva envolvendo interações macromoleculares e compartimentalização subcelular. Portanto, estudar levando a dissecar eventos abrangendo encapsidação vírus in vivo seria fornecer conhecimentos básicos para compreender como os vírus se proliferam e montar. Recentemente, em encapsidação vitro tem sido explorada para a pesquisa na área de biomédica imaging e aplicações terapêuticas. Vírus não-envelopados plantas estão muito à frente no empreendimento de encapsidação em vitro da matéria carregada negativamente estrangeira. Brome vírus do mosaico (BMV), um não encapsulado multicomponente patogenicidade do vírus de RNA para plantas, tem sido utilizado como um sistema modelo para estudar embalagem genoma in vivo e in vitro. Para os ensaios de encapsidação em plantas de Nicotiana benthamiana, mediada por Agrobacterium de expressão transiente, se referem como agroinfiltration, é uma técnica eficiente e fiável para a entrega sincronizado e expressão de componentes múltiplos para a mesma célula. Nesta abordagem, uma suspensão de células de Agrobacterium tumefaciens que transportam binários vectores plasmídicos transportando cDNAs de mRNAs desiredviral é infiltrado no espaço intercelular folha withina usando nada mais sofisticado que uma seringa de 1 ml descartável (sem agulha). Este processo resulta na transferência de inserção de ADN em células vegetais; o T-DNAinserto permanece transientemente no núcleo e, em seguida, é transcrito pelo hospedeiro polimerase II, que conduz à expressão transiente. A transcrição do mRNA resultante (nivelado e poliadenilado) é então exportado para o citoplasma para a tradução. Após aproximadamente 24 a 48 horas de incubação, as secções de folhas infiltradas pode ser amostrada para microscopyor análises bioquímicas. Agroinfiltration permite um grande número (centenas a milhares) de células a serem transfectadas simultaneamente. Para na encapsidação vitro, partículas virais purificadas de BMV são dissociados em proteína da cápside por diálise contra a dissociação de cloreto de cálcio tampão contendo seguido por remoção de RNA e un-dissociados viriões por centrifugação. Genoma empobrecido subunidades da proteína da cápside são reagrupados com desejados componentes do genoma viral ou não virais, tais como componentes indocianina corante.

Uma maneira simples, eficiente e robusta para sincronizar a entrega de múltiplos componentes virais para as células vegetais através<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada expressão transiente é descrito. Esta abordagem é favorável para estudar a replicação, encapsidação seguido por<em&gt; In vitro</em&gt; Remontagem de componentes não-virais do genoma empobrecido ópticos fantasmas virais adequados para aplicações biomédicas.

Simples e robusto In vivo E In vitro Abordagem para o Estudo Assembléia Virus

Em vírus com genomas de RNA de sentido positivo patogênicos para humanos, animais e plantas, a encapsidação da progênie em vírions maduros e estáveis é um ponto crucial...

O objetivo geral deste procedimento é estudar a montagem de vírus in vivo e in vitro. Isso é realizado primeiramente expressando os RNAs do vírus mosaico do brócolis em bactérias e expondo-os a células vegetais por meio de infiltração com Agrobacterium. Em seguida, os virions do BMV são purificados das folhas infiltradas.Em seguida, são preparadas subunidades da proteína do capsídeo para montagem in vitro. Por fim, os varians do BMV são montados in vitro utilizando a proteína do capsídeo e o corante verde de indocianina. Em última análise, os resultados demonstram os varians do mosaico do brocolis montados in vitro por meio da formação de fantasmas ópticos, que podem ser determinados pela absorvância e emissão de fluorescência.Hoje vamos demonstrar uma técnica conhecida como filtração, a qual é útil para entregar componentes virais às plantas. A principal vantagem dessa técnica é eliminar a necessidade de produzir transcritos in vitro e, ao mesmo tempo, permitir a entrega de múltiplos componentes a uma mesma célula, possibilitando uma infecção sincronizada. O trabalho que estamos atualmente desenvolvendo envolve o uso do vírus do mosaico do brócolis em combinação com um cromóforo aprovado pela FDA, o verde cianina, para fabricar um novo tipo de nanopartícula para aplicações biomédicas.E especificamente, nosso objetivo é utilizar essas estruturas, que denominamos fantasmas de fios ópticos ou OB gs, para modalidades de imagem óptica, incluindo imagem de fluorescência e imagem fotoacústica, bem como para terapia a laser. Uma aplicação clínica específica que estamos atualmente desenvolvendo é o uso dessas estruturas para imagem de câncer de ovário em conjunto com procedimentos intraoperatórios. E a ideia é que podemos funcionalizar essas estruturas.O OBG com o motivo de direcionamento específico que pode reconhecer células tumorais residuais, que no caso do câncer de ovário podem estar especialmente na cavidade peritoneal. A partir de uma placa de agrobactéria previamente preparada, contendo o RNA do vírus do mosaico marrom um, dois ou três, escolha uma única colônia para inocular dois mililitros de LB contendo 50 microgramas por mililitro de canamicina e 100 microgramas por mililitro de rifampicina. Incube a cultura por um dia a 28 graus Celsius em agitador orbital a 250 RPM. Inocule 50 mililitros de LB em um erlenmeyer de 500 mililitros com um mililitro da cultura e incube por 16 horas a 28 graus Celsius em agitador orbital a 250 RPM no dia seguinte. Quando as culturas atingirem uma OD 600 de 1,0, transfira-as para tubos estéreis de 30 mililitros e centrifugue por 10 minutos.A 5.000 RPM e quatro graus Celsius, dissolva os pellets em 10 mililitros de cloreto de magnésio 10 milimolar e centrifugue por 10 minutos a 5.000 RPM e quatro graus Celsius. Repita este passo mais uma vez para garantir a remoção completa do antibiótico. Em seguida, suspenda os pellets em 10 mililitros de tampão contendo MES 10 milimolar e cloreto de magnésio 10 milimolar.Meça a DO600 de cada cultura e ajuste para uma DO600 de 0,1 utilizando cloreto de magnésio 10 milimolar e MES 10 milimolar. Em seguida, combine 10 mililitros de cada uma das três suspensões de cultura com DO600 0,1. Adicione acetofenona até uma concentração final de 100 milimolar.Agite suavemente e mantenha a mistura em repouso à temperatura ambiente por três horas. Após a incubação, aspire a cultura para dentro de uma seringa de um mililitro sem agulha. Infiltra a suspensão da cultura no lado axial de duas a três folhas bem expandidas de N. benthamiana pressionando suavemente a seringa contra metade da superfície abaxial de cada folha.Mantenha as plantas infiltradas no viveiro a 24 graus Celsius por três a quatro dias antes de colher as folhas. Após purificar os viriões do BMV, prepare um litro de tampão de dissociação de vírus um x. Em seguida, prepare a membrana de diálise.De acordo com o método de Sambrook et al., distribua de cinco a 10 miligramas por mililitro de vírus purificado em um saco de diálise e coloque o saco em um frasco contendo tampão de dissociação 1 x vírus. Realize a diálise do vírus por 24 horas a quatro graus Celsius sob agitação.Colete a solução do saco de diálise e centrifugue a 30.000 RPM durante 30 minutos a quatro graus Celsius para formar um pellet com quaisquer partículas virais não associadas. Centrifugue o sobrenadante a 30.000 RPM durante três horas a quatro graus Celsius. Após preparar os transcritos de RNA para serem remontados em viriões, misture as subunidades da proteína do capsídeo e os transcritos de RNA numa proporção de um para cinco.Dispense a mistura em um saco de diálise e fixe-o adequadamente para evitar vazamentos. Após preparar um litro de tampão de montagem de RNA 1X, realize a diálise da mistura da reação de remontagem no tampão a quatro graus Celsius por 24 horas; no dia seguinte, retire a mistura do saco de diálise e adicione 1,5 mililitros de tampão de montagem de RNA. Em seguida, centrifugue novamente a 30.000 RPM por três horas a quatro graus Celsius. Então, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet.Em seguida, estime a concentração de virions em OD 260 nanômetros. Em seguida, determine a concentração das subunidades proteicas do capsídeo em OD 280 nanômetros ou por outros métodos, como o ensaio de Bradford, para avaliar a integridade das subunidades proteicas do capsídeo dissociadas. Realize eletroforese em gel de SDS 12 a 15%, seguida de western blotting. Por fim, siga o procedimento descrito no protocolo escrito para gerar fantasmas virais ópticos ou ov cheese.É mostrada aqui uma imagem de microscopia eletrônica de transmissão de BMV Varion corado negativamente, purificado de plantas end hamana agroinfiltradas com uma mistura dos três construtos agri de BMV selvagem. Esta imagem de MET mostra fantasmas virais ópticos contendo verde indocianina corados negativamente. Aqui, os espectros de absorvência e de fluorescência para fantasmas virais ópticos são apresentados uma vez dominados.Essa técnica pode ser realizada em cinco minutos por amostra. Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de compreender bem como encapsular componentes virais ou não virais nas subunidades proteicas do capsídeo.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Aqui descrevemos um procedimento para imagem de complexos virais em liquidez em resolução de nanômetros usando um microscópio eletrônico de transmissão.

In situ TEM de Assembleias Biológicas em Líquido

A fixação de virions a uma superfície é um requisito para imagens de virion única por imagens de fluorescência de super resolução ou microscopia de força atômica (AFM). Aqui demonstramos um método de preparação de amostras para adesão controlada de virions a superfícies de vidro adequadas para uso em AFM e imagens de fluorescência de super resolução.

Preparação da amostra para microscopia da força atômica de virion único e imagem de fluorescência de super-resolução

Este artigo descreve a metodologia de microscopia crioeletrônica, que é usada para obter imagens microscópicas de alta qualidade de macromoléculas em seu estado quase nativo. O método produz imagens adequadas para processamento computadorizado adicional usando a abordagem de partícula única, concebida para gerar a reconstrução 3D de uma macromolécula.

Fazer e não fazer de Microscopia Cryo-elétron: uma cartilha sobre Preparação de Amostras e coleta de dados de alta qualidade para a Reconstrução Macromolecular 3D

Métodos de deteção de rotina utilizando a amplificação do genoma viral são limitados pela sua incapacidade de discriminar infecciosas de partículas não-infecciosas. O objetivo deste artigo é fornecer protocolos detalhados para métodos alternativos ajudar na discriminação de partículas infecciosas norovírus usando vinculação aptamer, espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão.

Métodos de alternativas In Vitro para a determinação da integridade estrutural do capsídeo Viral

Um método de microscopia de elétron luz correlativo (CLEM) é aplicado às estruturas intracelulares induzida por vírus imagem através de microscopia eletrônica (EM) em células que são previamente selecionadas pela microscopia de luz (LM). LM e eme são combinados como uma abordagem de imagem híbrida para alcançar uma visão integrada das interações do vírus-anfitrião.

Correlativo luz microscopia eletrônica de varredura (CLEM) para rastreamento e Imaging proteína Viral associado estruturas nas células Cryo-imobilizado

Para uma análise mecanicista aprofundada da síntese de RNA do vírus sincicial respiratório (RSV), relatamos um protocolo de utilização da fosfoproteína acompanhante (P) para coexpressão da nucleoproteína livre de RNA (N0) para posterior montagem in vitro dos nucleocapsídeos específicos do vírus (NCs).

Geração e montagem de nucleocapsídeos específicos do vírus do vírus sincicial respiratório

Aqui os protocolos são descritos para preparar conjuntos de vírus adequados para análise líquido-EM e crio-EM em nanoescala usando microscopia eletrônica de transmissão.

Avançando a imagem de alta resolução de conjuntos de vírus em líquido e gelo

Apresentamos um protocolo detalhado para microscopia eletrônica e de luz correlativa pós-incorporação de Epon usando uma proteína fluorescente chamada mScarlet. Este método pode manter a fluorescência e a ultraestrutura simultaneamente. Esta técnica é passível de uma ampla variedade de aplicações biológicas.

Epon Post Embedding Correlative Light e Microscopia Eletrônica

Este protocolo de vídeo ilustra como realizar a tomografia por microscopia eletrônica de transmissão de varredura de espécimes virológicos. Para obter os melhores resultados, as amostras são preparadas por congelamento de alta pressão e subsequente substituição por congelamento.

Tomografia por Microscopia Eletrônica de Transmissão de Varredura em Virologia: Imagem 3D de Amostras Congeladas de Alta Pressão e Substituídas por Congelamento

Aprenda a montagem viral in vivo e in vitro usando Agrobacterium em plantas Nicotiana benthamiana. Este método permite purificar vírios do BMV e criar fantasmas ópticos para aplicações biomédicas avançadas.

Simples e robusto In vivo E In vitro Abordagem para o Estudo Assembléia Virus

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