Silk Sistema de Cultura de Cinema para In vitro Análise e Desenho Biomaterial

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um sistema de cultura in vitro de filme de seda. Isso é feito produzindo primeiro a solução de seda para fazer o filme desejado. O segundo passo é fundir a solução de seda na superfície de moldagem de borracha de silicone e permitir que o filme seque.

O filme de seda é posteriormente processado para cultura de células. Em seguida, o sistema de cultura é montado usando a técnica estéril. A etapa final é semear os filmes de seda com o tipo de célula desejado.

Em última análise, as superfícies da cultura do filme de seda podem ser diretamente fotografadas ou testadas dentro da cultura. As placas ou amostras podem ser removidas para fixação e processamento posterior, conforme necessário. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a cultura em plástico de cultura de tecidos padrão, é que os biomateriais de filme de seda são altamente biocompatíveis e podem ser facilmente transferidos pelos pesquisadores para aplicações in vivo e in vitro a jusante.

Este método pode ser usado para responder a questões-chave nos campos da biologia celular e biomateriais, como a topografia da superfície pode ser usada para afetar a resposta celular? Embora esse método possa fornecer informações sobre a resposta epitelial da córnea, ele também pode ser aplicado a outros sistemas onde experimentos iniciais in vitro podem fornecer respostas preliminares a sistemas in vivo mais complexos. Para iniciar a fabricação de moldes de borracha de silicone, obtenha a superfície topográfica desejada para fundição Para esta demonstração.

Um wafer de silício gravado padrão de 100 milímetros é usado na saída. Solução de envasamento e catalisador PDMS em uma proporção de nove para um, conforme fornecido a partir de um kit adquirido. Misture bem as soluções para iniciar o processo de cura.

Após a colocação da superfície do wafer de silício dentro de um prato de fundição, pesar 4.5 gramas de solução PDMS no wafer de silício. Depois que a solução PDMS se espalhar uniformemente sobre o wafer, cubra o wafer com uma tampa de placa de Petri de 100 milímetros de diâmetro e coloque-o a 10 milímetros de mercúrio por duas horas. Para desgaseificar as bolhas de ar da solução PDMS, coloque a configuração de fundição em uma superfície plana em um forno a 60 graus Celsius durante a noite no dia seguinte, coloque o wafer de silício PDMS curado em um banho de etanol 100%.

Antes da remoção do PDMS, comece a remover o PDMS do wafer usando uma lâmina de barbear para levantar a borda da circunferência usando uma pinça Puxe suavemente o PDMS dentro do banho de 100% de etanol. Tomando cuidado para não rasgar a fundição de borracha de silicone, perfure os moldes PDMS individuais usando um furador de 14 milímetros. Este diâmetro é projetado para caber nos poços de uma placa de 24 poços.

Para preparar a solução de seda, leve dois litros de água destilada para ferver. Em um alto-falante de vidro, corte cinco gramas de casulos de bicho-da-seda bombex Maori em terços, descarte os casulos amplamente contaminados, conforme indicado pelo excesso de partículas de insetos que revestem a superfície interna do casulo. Adicione 4,24 gramas de carbonato de sódio lentamente ao volume de água fervente para evitar que transborde.

Assim que o carbonato de sódio se dissolver, adicione os pedaços de casulo à água fervente e mexa com uma barra de mistura revestida de Teflon por 40 minutos. Após a fervura, escorra cuidadosamente a água destilada na pia e limpe o extrato de seda com a mão para remover o excesso de água. Em seguida, lave o extrato de seda colocando-o em um copo de plástico com um litro de água destilada e mexendo por 20 minutos.

Repita este processo de lavagem com água doce duas vezes. Retire o extrato de seda lavado com a mão e coloque o extrato de fibra de seda dentro de um capuz químico para permitir a secagem por um período de 12 horas. No dia seguinte, pese as fibras de seda secas, que normalmente têm aproximadamente 3,5 gramas.

Em seguida, prepare uma solução de brometo de lítio de 9,3 molares para uma solução de seda de 20% de peso a volume de acordo com o protocolo escrito. Após a colocação do extrato de seda no copo. Despeje a solução de brometo de lítio sobre as fibras de seda.

Certifique-se de que as fibras de seda estejam imersas na solução. Usando uma espátula de laboratório, coloque a seda dissolvida em um forno a 60 graus Celsius por quatro horas. Após quatro horas, use uma seringa de tamanho apropriado para extrair 12 mililitros da solução de seda.

Após a colocação de uma agulha de calibre 18. Na extremidade da seringa, injete a solução em um de diálise. Após o enchimento do, retire o ar restante do com a seringa vazia.

Coloque o de diálise cheio em um litro de água destilada. Troque a água após uma hora, quatro horas, oito horas e depois três vezes a cada 12 horas para um total de seis trocas. Após a diálise.

Recolha lentamente a solução de seda dos com a seringa e transfira para os tubos de centrifugação. Centrifugar a solução a 10 000 g e a quatro graus Celsius durante 20 minutos após a centrifugação. Coloque o super natin em um novo tubo.

Depois de repetir este processo uma segunda vez, pipete duas amostras de solução de seda de 0,5 mililitros em pequenos pratos de soro de leite separados. Coloque os pratos de soro de leite dentro de um forno seco a 60 graus Celsius por 12 horas ou até que a solução de seda diminua. A solução de seda a granel pode ser armazenada a quatro graus Celsius.

Pesar a película de seda sólida restante de ambas as amostras para medir a densidade de concentração de proteína da seda da solução. Prepare as superfícies de fundição do PDMS usando fita adesiva transparente para remover qualquer poeira. Em seguida, limpe os substratos PDMS mergulhando-os em etanol 100% por um minuto.

Em seguida, retire-os e deixe secar. Para produzir um filme de 50 micrômetros de espessura, espalhe 70 microlitros de solução de seda a 8% em moldes PDMS. Usando uma ferramenta de espalhamento de líquido, como uma ponta de seringa de um mililitro, deixe os filmes de seda secarem descobertos em uma bancada de limpeza de fluxo laminar, executando uma pressão de fluxo de ar de 150 pascals por um período de 90 minutos ou até que os filmes estejam secos.

Quando os filmes estiverem secos, coloque todo o conjunto de filmes, incluindo moldes PDMS, em uma câmara de água e ajoelhada por mais de quatro horas para produzir um filme insolúvel em água. Esta é tipicamente uma câmara desidratada vazia com água no fundo da bacia, puxada a um vácuo de 25 quilopascais após a remoção dos filmes de seda da água e da câmara ajoelhada. Trabalhe em uma bancada limpa de fluxo laminar para preparar um banho de etanol a 70% em uma placa de Petri de 35 milímetros.

Em seguida, coloque quaisquer substratos de controle e anéis de aço inoxidável no prato por pelo menos 10 minutos para esterilizá-los. Em seguida, remova os filmes de seda dos moldes PDMS usando uma pinça. Mergulhe-os em etanol a 70% e coloque cada filme em um único poço de uma placa de 24 poços pré-preenchida com um mililitro de etanol a 70%.

Certifique-se de que o lado do padrão esteja voltado para cima para permitir a adesão celular Para garantir o sucesso nesta etapa, é importante que os filmes de seda sejam colocados correta e estérilmente dentro dos poços Coloque os anéis de aço inoxidável em cima dos filmes SILT e deixe-os incubar por 10 minutos Após a lavagem do filme de amostra, conforme as instruções do texto, Prepare a linhagem celular para assentar conforme indicado lá. Nesta demonstração, uma linha de células epiteliais límbicas da córnea humana é usada como etapa final Amostra de 500 microlitros de suspensão de HCLE por poço, normalmente usando uma densidade de 10.000 células por centímetro quadrado e prossiga para executar o protocolo experimental desejado. Aqui são mostradas micrografias eletrônicas de varredura da linha celular HCLE, aderindo a filmes de seda padronizados e planos no segundo dia.

Na cultura HCLE, as culturas continuam a proliferar para confluência em superfícies padronizadas e planas no oitavo dia. Na cultura aqui, cultura de filmes de seda padronizados e planos, as células HCLE são comparadas aos substratos de controle de vidro no primeiro dia, dia quatro e oitavo dia. Na quantificação da cultura com conteúdo de ácido nucleico SQU e dados de ensaio de atividade metabólica MTT demonstram a viabilidade do HCLE em substratos de filme de seda padronizados e planos quando comparados às superfícies de controle de vidro ao longo do tempo.

Aqui é mostrada a imagem de contraste de fase de lapso de tempo de células HCLE migrando sobre uma superfície de filme de seda padronizada. Durante um período de 18 horas, as células foram assentadas a uma densidade de 10.000 células por centímetro quadrado e cultivadas por duas horas antes da imagem para comparação, a imagem de contraste de fase de lapso de tempo de células HCLE migrando sobre uma superfície de controle plana é mostrada durante um período de 18 horas sob as mesmas condições de cultura. Uma vez preparada a solução de seda e a moldagem de silicone, esta técnica pode ser feita em oito horas se for realizada corretamente Seguindo este procedimento.

Outros métodos, como varredura de imunofluorescência, microscopia eletrônica e técnicas de biologia molecular, como western blots e imunoensaios, juntamente com ensaios químicos, como viabilidade celular, proliferação celular e taxa metabólica, podem ser avaliados para entender melhor a resposta celular nesses vários serviços de design personalizado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como fazer uma solução de seda, criar padrões personalizados, filmes de seda e cultura. Qualquer tipo de célula nesses substratos.