Name: Ex vivo Mimetismo de normal e anormal Hematopoese Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Aprenda a criar um modelo ex vivo de hematopoiese normal e anormal utilizando células de sangue de cordão umbilical humano e scaffolds de poliuretano. Este método permite estudar interações celulares em ambiente semelhante à medula óssea.

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Este trabalho foi financiado pelo Fundo Thomas Richard leucemia, a Senhora Tata Memorial Trust, do Northwick Park Hospital Fundo Fiduciário Leucemia Research e do Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde (NIHR), Reino Unido.

1. Andaime Fabricação e Bio-funcionalização de Andaimes <ol><li> Para fabricar PU andaimes (tamanho de poro 100-250 mm, porosidade de 90-95%) sob a forma de discos de Petri, utilizar a separação de fases induzida termicamente 13 processo através da preparação de uma solução de polímero (5wt% em dioxano), seguido de congelamento e subsequente sublimação do solvente (Figura 1A). </li><li> Cortar o disco de andaime em cubos de 0,5 x 0,5 x 0,5 mm antes do revestimento com ECM proteínas (Figura 1B). </li><li> Pré-molhadas os suportes por imersão em etanol (70%) durante 1 min e depois transferir em salina tamponada com fosfato (PBS) durante 20 min. Em seguida, centrifugar durante 10 min a 3630 xg e adicionar a solução de proteína. </li><li> Centrifugar os suportes na solução de proteína a 1420 xg durante 20 min. </li><li> A fim de desbloquear os poros da superfície, e permitir que as células semeadas a penetrar mais profundamente na andaime, centrifugar o scaffolds mais uma vez em 910 xg durante 10 minem PBS. </li><li> Esterilizar os andaimes usando uma combinação de 8 min de exposição a 230 V, 50 Hz, 0,14 Uma lâmpada de UV, com a imersão durante 2 h em etanol (70%). Depois disso, lavar os suportes duas vezes em PBS antes da adição Modificado por Dulbecco Médio de Iscove (IMDM), suplementado com 30% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina e estreptomicina (P / S). Colocar os suportes em um incubador humidificado durante 3 dias a 37 ° C e 5% de CO 2 antes de usar. Andaimes estéreis são colocados num placas de 24 poços de tecido-cultura (um andaime por poço). </li></ol> 2. Isolamento de células mononucleares e Plantio de andaime <ol><li> Extrair humano MNC do sangue do cordão ou amostras de medula óssea leucémicas, usando Ficoll-Paque centrifugação em gradiente de densidade (35 min a 1500 rpm) (Figura 1C). </li><li> Ressuspender o MNC em IMDM contendo 30% de FBS e 1% P / S. </li><li> 100 ul de semente de suspensão MNC (2 × 10 6 células / andaime) para a andaimes usando uma pipeta de micro-. </li><li> Incubar a andaimes semeadas a 37 ° C sob 5% de CO 2 durante 10 minutos para as células para se adaptar à andaimes. </li><li> Encher cada poço com 1,5 ml de IMDM contendo 30% de FBS e 1% P / S e as placas assim lugar na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 durante a duração da experiência. </li><li> Os arcabouços semeados sofrem diariamente mudam de todos os meios de comunicação. </li></ol> 3 na proliferação celular in situ e Morfologia:. MTS, SEM e cytospins <ol><li> Ensaio MTS: Retire uma cultura não-sementes e dois andaimes sem sementes e coloque em um 24 novo e limpo bem-chapa. Adicionar 1 ml de meio e 200 uL da solução de MTS e incubar durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. <ol><li> Exame de 8 x 100 uL de amostras a partir do sobrenadante; lugar em uma placa de 96 poços e absorvância medida a 490 nm usando um leitor de microplacas. </li></ol></li><li> Microscopia eletrônica de varredura (MEV): em diferentes momentos do diacultura e, remover os andaimes semeadas com MNC a partir dos meios de comunicação, e fixar com 2,5% de PBS-tamponada solução de glutaraldeído por 40 min a 4 ° C, em seguida, lavar duas vezes com PBS. <ol><li> Desidratado os suportes em uma série graduada de etanol (25, 50, 70, 80, 90, 95 e 100%), cada um durante 10 min e seco num ambiente asséptico durante 4 horas. </li><li> Espécimes de secção e, em seguida, por pulverização catódica-revestimento com ouro numa atmosfera de árgon durante 2 min antes da avaliação SEM, utilizar uma voltagem de aceleração de 20 kV. </li></ol></li><li> Cytospins: Recolha 2,0 x 10 4 células / lâmina por aspiração das células do andaime em pontos de tempo diferentes na cultura. <ol><li> Centrifugar as células numa lâmina de vidro durante 3 min a 1500 rpm. </li><li> Coloração das lâminas com Wright-Giemsa modificado e observar por meio de um microscópio óptico. F-visualizar Imaging System Soft pode ser usado para tirar fotos. </li><li> Lave as lâminas antes da observação ao microscópio. </li></ol></li><li> M<html> análise ultiphoton: andaimes fixos em pontos de tempo diferentes, com vapor de etanol (70%) durante a noite e, em seguida, seco e armazenar a -20 ° C até análise posterior. Antes de visualização com a seção de microscópio multifotônica o andaime em 30 mm de espessura, slides e molhado com PBS. <ol><li> Bloquear a andaimes seeded em PBS com 10% de soro fetal de bovino durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as andaimes durante a noite a 4 ° C na escuridão com uma diluição de 1:50 de anticorpo monoclonal primário: ratinho anti CD71 humano. </li><li> Lavar as amostras três vezes em PBS e coradas com o anticorpo secundário: anti-ratinho Alexa Fluor 488 durante 1 h à temperatura ambiente na escuridão. </li><li> Lavar as amostras três vezes com PBS e observar com um microscópio confocal usando uma água de emissão lente objectiva x60. </li><li> Fluoróforo Alexa Fluor 488 é excitado a 488 nm pelos lasers pulsáteis. O software Volocity 5.3.2 pode ser utilizado para análise de imagem subsequente. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. citometria de fluxo e da população celular <ol><li> Antes da análise celular no citómetro de fluxo (FC), rótulo as células de interesse com os anticorpos correspondentes de imunofluorescência para a detecção. Um certo número de amostras são preparadas de acordo com os anticorpos seleccionados, para detecção. Para a detecção MNC a seguinte combinação de anticorpos são utilizados: CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5. </li><li> Aspirar as células do andaime em pontos de tempo diferentes e centrifugar. Dissolve-se uma pelete de células de cerca de 1x10 6 células em 100 uL de tampão FC (PBS azida de sódio + 0,1%) e adicionar 10 uL de cada corante de fluorescência de anticorpos. Incubar as células durante 30 min a 4 ° C, lavar duas vezes com PBS e finalmente re-suspender em tampão de FC. </li><li> Carregar a amostra para o manchado citómetro de fluxo com o controlo de isotipo para definir o &quot;negatividade&quot; da expressão do anticorpo e calibrar os canais de detecção com o controle citómetro de fluxo. </li><li> Leia a amostra manchado w<html> om os três anticorpos diferentes e, finalmente, representam os dados no uso do software WinList. </li></ol> 5. Os resultados representativos Um exemplo de hematopoiéticas cinética de crescimento celular, sem a adição de factores de crescimento exógenos é mostrado na Figura 2. Devido à natureza heterogénea de hematopoiese, duas células diferentes: normais e anormais células hematopoiéticas são ilustrados. Na Figura 2A, a proliferação celular de CBMNC humana é evidente após 28 dias em cultura. Figura 2B mostra a cinética de crescimento no mimetismo usando células humanas leucémicas primárias. Proliferação celular é avaliada utilizando o ensaio de MTS que mede a actividade metabólica celular em relação à absorvância. Em ambos os casos, as células proliferaram e estabeleceu no modelo. As diferenças na cinética de crescimento são observados; células hematopoiéticas normais estabelecer a cultura mais rápido do que as células leucémicas. _content &quot;&gt; A morfologia das células colhidas, mesmo após 28 dias de cultura na ausência de factores de crescimento exógenos era típica de células hematopoiéticas normais (Figura 3A) e células leucémicas (Figura 3B). secções centrais dos suportes foram analisados ​​por SEM após os andaimes foram retirados da cultura e mostrou a propagação das células semeadas em todo o andaime, estabelecendo-se em agrupamentos e em &quot;nicho-estruturas semelhantes (Figura 3A &#39;&amp; B&#39;). Figura C mostra o tamanho dos poros e distribuição em um unseeded andaime usado como um controlo. microscopia multifotônica após 28 dias foi utilizado para destacar a distribuição das células no interior da andaime 3D in situ e que mostrou a presença de eritróide ilhas nas secções centrais do andaime (Figura 4) pela expressão do marcador CD71, que é positiva em eritroblastos. Isso prova a importância da du madura e células vencimentoeritropoiese anel. Finalmente, os gráficos de citometria de fluxo da semeadura células antes mostra a diferença no fenótipo de células hematopoiéticas, em que A Figura 5A representa células hematopoiéticas normais: CBMNCs humanos e Figura 5B ilustra anormais células hematopoiéticas: células leucémicas primárias. Níveis de CD235a + e CD45 + correspondente a eritrócitos e leucócitos, respectivamente são superiores na amostra normal do que no leucémicas destacando a natureza hemoblastic das leucemias. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig1.jpg" /> Figura 1. Ilustração dos processos envolvidos na fabricação e PU andaime bio-funcionalização. A) PU é dissolvido em dioxano (5wt%) e pelo processo termicamente induzida fase de separação e sublimação solvente subsequente do andaime é produzido, como descrito por Safinia et al 13. B) O disco de andaime é então cortada intO cubos de 0,5 x 0,5 x 0,5 mm e, então, revestido por centrifugação com matriz extra-celular (ECM) proteínas. C) MNC são extraídos umbilical humano CB ou a partir de aspiração BM utilizando centrifugação em gradiente de densidade e semeado (2x10 6 células / andaime) na andaimes PU com uma micropipeta. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig2.jpg" /> . Figura 2 proliferação celular medido utilizando o ensaio de MTS: A) usando sangue do cordão umbilical humano EMNs; B), utilizando células humanas leucémicas primárias. As colunas mostram o crescimento de células ao longo do tempo, quando semeadas no andaimes PU, sem a adição de citocinas exógenas. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig3.jpg" /> Figura 3: A morfologia e distribuição em torno dos andaimes utilizando cytospins, scannimicrografias ng elétrons. (AB) Representante Wright-Giemsa cytospins manchadas de A) células mononucleares do sangue do cordão coletadas em PU andaimes após 28 dias de cultura, e B) osso aspirados células leucêmicas coletadas de PU andaimes após 14 dias de cultura. Ambos os experimentos foram realizados em condições de citocinas livre. (A&#39;-B &#39;) Representante seções centrais das micrografias de MEV de PU andaime A&#39;) cabo semeado sangue multinacionais e B &#39;) células leucêmicas após serem cultivadas durante 28 dias, e C) controle andaime sem células. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig4.jpg" /> Figura 4. Multifotônica micrografia de um andaime PU semeado com sangue do cordão umbilical multinacionais após 28 d na cultura e corados com o marcador CD71 eritróide. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig5.jpg" /> Figura 5. Citometria de Fluxo 3D Dot-plots coradas para CD45, CD71 e marcadores de expressão CD235a superfície. O controlo de isotipo obtido é também apresentados para comparação da intensidade relativa da fluorescência. O painel A mostra células do cordão humanos de sangue mononucleares positivos para os marcadores acima; B Painel mostra células leucémicas humanas primárias.

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<li>Safinia, L., Datan, N., Hohse, M., Mantalaris, A., Bismarck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+methodology+for+the+effective+surface+modification+of+porous+polymer+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Towards a methodology for the effective surface modification of porous polymer scaffolds.</a> Biomaterials. 26, 7537-7547 (2005).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

O ex vivo sistema de cultura 3D apresentado aqui permite-nos estabelecer uma biomimicry 3D da hematopoiese que recapitula a arquitetura original BM e fenótipo celular independente de citocinas exógenas. O modelo 3D fornece a estrutura e do microambiente que permite normais e anormais células hematopoiéticas para proliferar em condições similares àquelas encontradas in vivo. A seleção do material polimérico andaime representou um passo crítico no projeto biomimicry. Vantagen...

<table><tbody><tr><td>Dioxano</td><td>Invitrogen</td><td>D20,186-3</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Invitrogen</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>MTS</td><td>Promega Corp.</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Fluka</td><td>49624</td><td></td></tr><tr><td>Wright-Giemsa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WG32</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>10108-165</td><td></td></tr><tr><td>CD71</td><td>Santa Cruz Biotecnologia, Inc.</td><td>sc-32272</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>74895</td><td></td></tr><tr><td>CD71-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555537</td><td></td></tr><tr><td>CD235a-PE-Cy5</td><td>BD Biosciences</td><td>555570</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8032</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo mimetismo de normal e anormal hematopoese humanos

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Células-tronco hematopoéticas requer um microambiente único, a fim de sustentar a formação do sangue célula 1, a medula óssea (BM) é um complexo tridimensional (3D) tecido hematopoiese em que é regulada por espacialmente organizadas microambientes celulares denominados nichos 2-4. A organização dos nichos BM é crítico para a função ou disfunção de BM normal ou maligno 5. Por conseguinte, uma melhor compreensão do microambiente em in vivo utilizando um mimetismo ex vivo nos ajudaria elucidar os determinantes moleculares, celulares e microambiental de leucemogênese 6. Actualmente, as células hematopoiéticas são cultivadas in vitro em frascos de tecidos bidimensionais (2D) de cultura / poço de placas 7 que requerem ou de co-cultura com alogénico ou xenogénica células estromais ou adição de citocinas exógenas 8. Estas condições são artificiais e diferem do in vivo </em&gt; microambiente na medida em que faltam os nichos 3D celulares e expor as células a concentrações anormalmente elevados de citocinas que podem resultar em diferenciação e perda de 9,10 pluripotência. Aqui, apresentamos um romance 3D osso sistema de cultura de medula que simula o ambiente de crescimento in vivo em 3D e suporta hematopoiese multilinhagens na ausência de fatores de crescimento exógenos. O andaime altamente poroso utilizado neste sistema de poliuretano (PU), facilita a alta densidade crescimento celular através de uma maior área superficial específica do que a cultura em monocamada em 2D convencional 11. O nosso trabalho indicou que este modelo de suporte o crescimento de sangue do cordão umbilical humano (CB), as células mononucleares (MNC) 12 e primárias de células leucémicas, na ausência de citocinas exógenas. Este mimetismo 3D romance proporciona uma plataforma viável para o desenvolvimento de um modelo humano experimental para estudar a hematopoiese e para explorar novos tratamentos para a leucemia.

Um sistema de cultura de 3D para a hematopoiese é descrito usando sangue do cordão umbilical humano e células de medula óssea leucémicas. O método baseia-se na utilização de um poliuretano poroso sintético andaime revestido com proteínas da matriz extracelular. Este andaime é adaptável para acomodar uma grande variedade de células.

Ex vivo Mimetismo de normal e anormal Hematopoese Humanos

As células-tronco hematopoiéticas requerem um microambiente único para sustentar a formação de células sanguíneas1; a medula óssea (MO) é um complexo sistema tridimensional...

O objetivo geral do experimento a seguir é criar um modelo ex vivo que replique a hematopoese normal e anormal. Isso é alcançado pela fabricação de um suporte feito de poliuretano utilizando a técnica de separação de fase induzida termicamente, ou TIPS, que produz um suporte altamente poroso e não biodegradável na forma de uma placa de Petri. Em seguida, o suporte é cortado em cubos e revestido com proteínas da matriz extracelular para auxiliar a aderência celular. Ao semear as células, os suportes são esterilizados usando UV e etanol, e são incubados em meio até o momento da semeadura.O próximo passo é isolar células mononucleares de amostras de sangue do cordão umbilical, que são utilizadas para semear as estruturas tridimensionais. Os resultados demonstraram que este modelo suporta o crescimento de células mononucleares de sangue do cordão humano e células leucêmicas primárias na ausência de citocinas exógenas, com base em dados de ensaios M-T-S-S-E-M e citometria de fluxo. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de dermatologia, como a criação de um modelo experimental da medula óssea para estudar interações celulares, além de possibilitar a exploração

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Bioengenharia

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Nos métodos padrão de cultura de células são retiradas do seu ambiente fisiológico e cultivadas na superfície de plástico de um prato. Para estudar o comportamento de células de medula óssea humana primária foi criado um sistema de cultura de 3-D, onde as células são cultivadas sob condições sintetizando o microambiente nativa do tecido.

A Cultura de Tecidos modelo tridimensional para estudar primária da medula óssea humana e suas Malignancies

O protocolo descrito aqui detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição. Essa tecnologia pode ser traduzida para o sistema humano para fornecer plataformas para estudos futuros de hematopoiese, doenças hematológicas e transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

Aqui, apresentamos pluripotentes humanas de protocolos de cultura de células-tronco (hPSC), usados para diferenciar hPSCs em CD34+ progenitores hematopoiéticos. Este método usa a manipulação de estágio específico de WNT canônico sinalização para especificar células exclusivamente para ambos o programa hematopoiética definitivo ou primitivo.

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

É apresentado um método para criar e imagem viva diferentes meninos de medula óssea humanizados em camundongos. Com base no nicho de suporte criado por células mesenquimais humanas, a adição de células endoteliais humanas induz a formação de vasos humanos, enquanto que a adição de rhBMP-2 induz a formação de tecido ósseo maduro quimérico humano-rato.

Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

Este protocolo descreve o uso culto Aorta-gônada-Mesonephros para análises de expressão, unidades formadoras de colônia, na cultura e baço e reconstituição de longo prazo para determinar o efeito de fatores regulatórios e vias de sinalização no tronco hematopoiético desenvolvimento da célula. Isto foi demonstrado como um sistema eficaz para estudar a função e biologia de células-tronco hematopoiéticas.

Aplicação do sistema de cultura Aorta-gônada-mesonephros explante na hematopoiese do desenvolvimento

Este protocolo demonstra a indução de um programa hemogenic em fibroblastos dérmicos humanos pela expressão forçada dos fatores de transcrição GATA2, GFI1B e FOS para gerar células-tronco e progenitoras hematopoiéticas.

Reprogramação hemogénica de fibroblastos humanos pela expressão forçada de fatores de transcrição

Aqui, descrevemos um sistema microfisiológico padronizado e fácil de implementar que reflete a complexidade da estrutura in vivo da medula óssea humana, fornecendo um modelo pertinente para estudar finamente uma ampla gama de eventos normais e patológicos.

Um modelo 3D de medula óssea humana para investigar a dinâmica e as interações entre células residentes em contextos fisiológicos ou tumorais

Apresentamos aqui um protocolo para iniciar, manter e analisar culturas de células-tronco hematopoéticas de camundongos usando expansão ex vivo à base de álcool polivinílico, bem como métodos para manipulá-las geneticamente por transdução lentiviral e eletroporação.

Ex Vivo Expansão e Manipulação Genética de Células-Tronco Hematopoéticas de Camundongos em Culturas à Base de Álcool Polivinílico

Aqui, estabelecemos osteo-organoides in vivo desencadeados por andaimes de gelatina carregados com proteína 2 morfogenética óssea para colher células-tronco / progenitoras hematopoiéticas terapêuticas para a reconstrução de um sistema hematopoiético e imunológico danificado. No geral, essa abordagem pode fornecer uma fonte celular promissora para terapias celulares.

Abordagem osteoorganoide in vivo para coleta de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas terapêuticas

A modelagem da eritropoiese oferece uma chance valiosa de compreender o significado biológico dos atores nesse processo e avaliar novas abordagens terapêuticas que podem aliviar os defeitos de diferenciação. Aqui, descrevemos um método simples e confiável para diferenciar eficientemente células-tronco hematopoiéticas CD34+ e células progenitoras ex vivo.

Um pipeline abrangente para avaliar a eficiência da eritropoiese humana in vitro e ex vivo

Aprenda a criar um modelo ex vivo de hematopoiese normal e anormal utilizando células de sangue de cordão umbilical humano e scaffolds de poliuretano. Este método permite estudar interações celulares em ambiente semelhante à medula óssea.

Ex vivo Mimetismo de normal e anormal Hematopoese Humanos

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