Name: O uso de interferão-γ Enzyme-linked Assay immunospot Caracterizar Novel epitopos de células T de papilomavírus humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: Aprenda a isolar e caracterizar clones de células T específicas para antígenos do HPV usando ensaio interferon-γ ELISpot. Este método robusto identifica epítopos de células T para desenvolvimento de imunoterapias direcionadas.

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Este estudo foi apoiado por um American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) e por subsídios do NIH (R01 CA143130 e UL1RR029884).

<ol><li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+favorable+clinical+trend+is+associated+with+CD8+T-cell+immune+responses+to+the+human+papillomavirus+type+16+e6+antigens+in+women+being+studied+for+abnormal+pap+smear+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Low.+Genit.+Tract+Dis%22%5BJournal%5D)">A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results.</a> J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).</li>
<li>Walls, E., Crawford, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalls%2C+E+%22Lymphocytes%3A+A+practical+approach%22">Lymphocytes: A practical approach</a>. Klaus, G. G. B. , IRL Press. 149-149 (1987).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+CD8+T-cell+epitopes+within+the+human+papillomavirus+type+16+%28HPV+16%29+E6+protein+among+young+women+whose+HPV+16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Patterns of CD8 T-cell epitopes within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 protein among young women whose HPV 16 infection has become undetectable.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 12, 1003-1005 (2005).</li>
<li>Wang, X., Santin, A. D., Bellone, S., Gupta, S., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+CD4+T-cell+epitope+described+from+one+of+the+cervical+cancer+patients+vaccinated+with+HPV+16+or+18+E7-pulsed+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancer patients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells.</a> Cancer Immunol. Immunother. 58, 301-308 (2009).</li>
<li>Larsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+vaccinia+virus+based+ELISPOT+assay+detects+high+frequencies+of+Pol-specific+CD8+T+cells+in+HIV-1-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">A recombinant vaccinia virus based ELISPOT assay detects high frequencies of Pol-specific CD8 T cells in HIV-1-positive individuals.</a> AIDS. 13, 767-777 (1999).</li>
<li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+responses+to+E6+and+E7+proteins+of+human+papillomavirus+type+16%3A+relationship+to+cervical+intraepithelial+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte responses to E6 and E7 proteins of human papillomavirus type 16: relationship to cervical intraepithelial neoplasia.</a> J. Infect. Dis. 175, 927-931 (1997).</li>
<li>Wang, X., Moscicki, A. B., Tsang, L., Brockman, A., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+specific+for+novel+human+papillomavirus+type+16+%28HPV16%29+E6+epitopes+in+women+whose+HPV16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells specific for novel human papillomavirus type 16 (HPV16) E6 epitopes in women whose HPV16 infection has become undetectable.</a> Clin. Vaccine Immunol. 15, 937-945 (2008).</li>
<li>Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+processing+defects+in+cervical+carcinomas+limit+the+presentation+of+a+CTL+epitope+from+human+papillomavirus+16+E6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen processing defects in cervical carcinomas limit the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6.</a> J. Immunol. 167, 5420-5428 (2001).</li>
<li>Shi, Y., Smith, K. D., Kurilla, M. G., Lutz, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+CD8%2B+T+cells+recognize+EBV+antigen+but+poorly+kill+autologous+EBV-infected+B+lymphoblasts%3A+immunodominance+is+elicited+by+a+peptide+epitope+that+is+presented+at+low+levels+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic CD8+ T cells recognize EBV antigen but poorly kill autologous EBV-infected B lymphoblasts: immunodominance is elicited by a peptide epitope that is presented at low levels in vitro.</a> J. Immunol. 159, 1844-1852 (1997).</li>
<li>Varadarajan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%2B+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+methods+of+identifying+new+antigenic+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+and+E7+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Different methods of identifying new antigenic epitopes of human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 889-896 (2004).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Gillam, T. M., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+class+I+binding+promiscuity+of+the+CD8+T-cell+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HLA class I binding promiscuity of the CD8 T-cell epitopes of human papillomavirus type 16 E6 protein.</a> J. Virol. 81, 1412-1423 (2007).</li>
<li>Brown, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+epitope+%22hotspots%22+on+the+HIV+Type+1+gp120+envelope+protein+overlap+with+tryptic+fragments+displayed+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">T cell epitope "hotspots" on the HIV Type 1 gp120 envelope protein overlap with tryptic fragments displayed by mass spectrometry.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 21, 165-170 (2005).</li>
<li>Masemola, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+promiscuous+CTL+epitopes+in+conserved+regions+of+Gag+targeted+by+individuals+with+early+subtype+C+HIV+type+1+infection+from+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel and promiscuous CTL epitopes in conserved regions of Gag targeted by individuals with early subtype C HIV type 1 infection from southern Africa.</a> J. Immunol. 173, 4607-4617 (2004).</li>
<li>Walker, B. D., Korber, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+control+of+HIV%3A+the+obstacles+of+HLA+and+viral+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity.</a> Nat. Immunol. 2, 473-475 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Tradicionalmente, os imunologistas tentavam caracterizar epítopos T celulares novos estimulando as células T de interesse in vitro e realizando um experimento de diluição limitante para isolar os clones de células T específicos pelo epítopo. Em seguida, os clones de células T eram caracterizados utilizando um ensaio de liberação de cromo 8,9. No entanto, muitas tentativas foram infrutíferas porque as frequências das células T poderiam ter sido muito baixas para serem isoladas ou porque não havia célul...

<table><tbody><tr><td>Kit de isolamento de células T CD8</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-156</td><td></td></tr><tr><td>Fito-hemaglutinina</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R-30852801</td><td>2 mg/frasco</td></tr><tr><td>Meio de Yssel&amp;rsquo;s</td><td>Gemini Bio Products</td><td>400-102</td><td>1% de soro humano pool</td></tr><tr><td>Placa de fundo redondo de 96 poços</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772-17</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 recombinante humana</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>50&amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Corning</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal primário anti-IFN-&amp;#947; (D1K)</td><td>Mabtech</td><td>3420-3-1000</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal anti-IFN-&amp;#947; conjugado com biotina (7B-6)</td><td>Mabtech</td><td>3420-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>Placa Multiscreen HA ELISPOT</td><td>EMD Millipore</td><td>MAHA S45 10</td><td></td></tr><tr><td>Dissulfóxido de dimetilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Frasco de 100 ml</td></tr><tr><td>Soro humano pool</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S40510H</td><td>Inativar pelo calor</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>MT-10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Kit Vectastain Elite ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>NC9313719</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidina estável</td><td>Open Biosystems</td><td>MBI 1241</td><td></td></tr><tr><td>Leitor AID EliSpot Reader Classic</td><td>Autoimmun Diagnostika GmbH</td><td>ELR06</td><td></td></tr></tbody></table>

o uso de interferão-γ enzyme-linked assay immunospot caracterizar novel epitopos de células t de papilomavírus humano

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Foi desenvolvido um protocolo para superar as dificuldades de isolamento e caracterização de linfócitos T raros específicos para patógenos, como o papilomavírus humano (HPV), que causam infecções localizadas. Os passos envolvidos incluem a identificação da(s) região(ões) das proteínas do HPV que contêm epítopo(s) de linfócito T a partir de um indivíduo, a seleção dos linfócitos T específicos pelo peptídeo com base na secreção de interferon-γ (IFN-γ) e o cultivo e caracterização dos clones de linfócitos T (Fig. 1). O indivíduo 1 era um paciente recém-diagnosticado com lesão intraepitelial escamosa de alto grau por biópsia e submetido ao procedimento cirúrgico de excisão com alça diatérmica no dia em que os linfócitos T foram coletados1. Uma região nas proteínas E6 e E7 do papilomavírus humano tipo 16 (HPV 16) que continha um epítopo de linfócito T foi identificada por meio de um ensaio de imunospot ligado à enzima para IFN-γ (ELISPOT) realizado com peptídeos sintéticos sobrepostos (Fig. 2). Os dados desse ensaio foram utilizados não apenas para identificar uma região que contém um epítopo de linfócito T, mas também para estimar o número de linfócitos T específicos para o epítopo e isolá-los com base na secreção de IFN-γ, utilizando microesferas magnéticas comercialmente disponíveis (kit de isolamento de linfócitos T CD8, Miltenyi Biotec, Auburn CA). Os linfócitos T selecionados secretadores de IFN-γ foram diluídos e cultivados individualmente na presença de uma mistura de células alimentadoras irradiadas, a fim de suportar o crescimento de um único linfócito T por poço. Esses clones de linfócitos T foram triados por meio de um ensaio ELISPOT para IFN-γ na presença de peptídeos que cobrem a região identificada e células B linfoblastoides autólogas transformadas pelo vírus Epstein-Barr (LCLs, obtidas conforme descrito por Walls e Crawford)2, com o objetivo de minimizar o número de células necessárias do clone de linfócito T. Em vez de utilizar 1 x 105 células por poço, quantidade tipicamente usada em ensaios ELISPOT1,3, foram utilizadas 1.000 células do clone de linfócito T na presença de 1 x 105 LCLs autólogas, reduzindo drasticamente o número de células do clone de linfócito T necessárias. As LCLs autólogas serviram não apenas para apresentar antígenos peptídicos às células do clone de linfócito T, mas também para manter uma alta densidade celular nos poços, permitindo que as células do clone de linfócito T específicas para o epítopo secretassem IFN-γ. Isso garante o bom desempenho do ensaio ELISPOT para IFN-γ. Da mesma forma, ensaios ELISPOT para IFN-γ foram utilizados para caracterizar a sequência mínima e ótima de aminoácidos do epítopo de linfócito T CD8 (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) e seu elemento de restrição da classe I do HLA (B58). O ensaio ELISPOT para IFN-γ também foi realizado utilizando LCLs autólogas infectadas com vírus vaccínia que expressavam a proteína E6 ou E7 do HPV 16. O resultado demonstrou que o epítopo de linfócito T E6 foi processado endogenamente. Foi demonstrada a reconhecimento cruzado do epítopo de linfócito T homólogo de outros tipos de HPV de alto risco. Este método também pode ser usado para descrever epítopos de linfócitos T CD44.

A caracterização de epítopos de células T de patógenos que causam infecções localizadas, como o papilomavírus humano, é um desafio devido ao número limitado de células T em circulação. É descrito um método no qual células T raras foram isoladas e caracterizadas a partir de um número muito pequeno de células.

O uso de interferão-γ Enzyme-linked Assay immunospot Caracterizar Novel epitopos de células T de papilomavírus humano

Um protocolo foi desenvolvido para superar as dificuldades de isolar e caracterizar células T raras específicas para patógenos, tais como humanos...

O objetivo geral deste procedimento é isolar, cultivar e analisar clones de células T específicas para antígenos de HPV a partir de pacientes. Primeiro, estabeleça uma linhagem de células T CD8, realize um ensaio SBOT e estime a frequência de células T específicas para o antígeno. Após isolar os clones de células T específicas para o antígeno com base na secreção de interferon-gama, realize um ensaio SBOT de triagem de alto rendimento de interferon-gama para identificar clones de células T específicas para epítopos.Continue a caracterizar os clones de linfócitos T quanto ao peptídeo mínimo ideal. As sequências de epítopos também determinam se o epítopo é processado endogenamente. Identifique o elemento de restrição HLA e avalie as reatividades cruzadas com outros tipos de HPV de alto risco.Em última análise, o objetivo é descrever epítopos de células T do VPH novedosos e clinicamente relevantes por meio da triagem e caracterização de células T específicas para antígenos provenientes de pacientes. A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como o uso do ensaio LY para identificar células T específicas para antígenos, é que a probabilidade de sucesso é muito maior. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da imunologia, como quais porções do VPH são reconhecidas pelas células T. As implicações desta técnica estendem-se para o diagnóstico ou terapia do câncer cervical, pois vacinas e imunoterapias podem ser desenvolvidas com base no conhecimento sobre as especificidades das células T.Este método pode fornecer informações sobre epítopos de células T CD oito e também pode ser aplicado a outros sistemas, como epítopos de células T CD quatro. Um ensaio SPO de interferon gama com uma linhagem de células T CD oito estabelecida a partir do sujeito um determinou que a região E 6 46 a 70 do HPV seis 16 continha um epítopo de células T. Essas células T específicas para o epítopo foram selecionadas com base na secreção de interferon gama. Prepare a mistura de células alimentadoras composta por células mononucleares do sangue periférico alogênicas irradiadas, células linfoblastos e fito-hemaglutinina em meio completo para células E.Agora, utilizando diluição seriada das células T específicas pelo epítopo isolado na mistura de células alimentadoras, prepare uma concentração de cinco células por mililitro com uma placa de pipetador multicanal. Adicione 100 microlitros por poço de células T específicas pelo epítopo diluídas em placas de fundo redondo de 96 poços. Incube por cinco dias a 37 graus Celsius e 5%CO2, e estimule as células com interleucina humana recombinante dois entre o dia 11 e o dia 14.Identifique visualmente os clones de linfócitos T em crescimento como pellets grandes no fundo das cavidades da placa. Às vezes, o meio fica amarelo. Prepare uma nova mistura de células alimentadoras e meio completo, distribuindo um mililitro por cavidade em uma placa de 24 poços.Um experimento bem-sucedido depende da capacidade de isolar e cultivar clones de linfócitos T com a micropipeta de 200 microlitros. Transfira os clones de linfócitos T individualmente para poços separados das células alimentadoras pregueadas. Repita até que todos os clones de linfócitos T sejam transferidos.Cubra os poços de placas sbot estéreis com 50 microlitros de anticorpo monoclonal primário anti-gama interferon a cinco microgramas por mililitro após uma hora de incubação a quatro graus Celsius. Lave três vezes com 200 microlitros de PBS.Em seguida, bloqueie a ligação não específica com 50 microlitros de soro humano pool a 5% em RPMI 1640. Sempre dispersar bolhas grandes perfurando-as com uma agulha estéril. Incube por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de CO2.Em seguida, adicione uma vez 10 à quinta LCLs autólogas em 50 microlitros de RPMI 1640 com 5% de soro humano. Prossiga misturando as células de cada clone de linfócito T com uma pipeta de um mililitro e transfira cem microlitros para um tubo einor estéril. Dilua com 500 microlitros de RPMI 1640 contendo 5% de soro humano pool.Em seguida, pelote as células por centrifugação, decante o sobrenadante e ressuspenda as células em 110 microlitros de RPMI 1640 contendo 5% de soro humano. Plaque agora 50 microlitros de cada suspensão celular clonal para triagem rápida em poços identicamente posicionados das duas placas de Ellis para os poços controle positivo de PHA. Combine o meio remanescente de vários tubos einor e plaque 50 microlitros de cada um nos próximos poços identicamente posicionados.Prepare também poços de controle negativo com 50 microlitros de meio. Agora, para a placa de teste, adicione 50 microlitros de peptídeos contidos na região positiva aos poços de controle positivo. Adicione 10 microlitros da solução estoque de PHA e 40 microlitros de RPMI 1640 à placa contendo apenas meio.Adicione 50 microlitros de RPMI 1640 com 5% de soro humano pool e incube as placas de Ellis durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de CO₂. Não mova as placas durante todo o período de incubação. Decante o meio e lave os poços três vezes com 200 microlitros de PBS contendo 0,05% de tween 20.Em seguida, adicione 50 microlitros do anticorpo monoclonal biotinilado anti-gama interferon e incube por duas horas. Lave três vezes com 200 microlitros de PBS contendo 0,1% de tween 20. Em seguida, adicione 50 microlitros de avidina recém-preparada e peroxidase do rábano-forte biotinilada, incubando as placas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por uma hora. Após três lavagens com PBS contendo 0,1% de tween 20, adicione 50 microlitros estáveis.Adicione gasolina Dino para permitir o desenvolvimento da cor por cinco minutos à temperatura ambiente. Agora, lave três vezes com 200 microlitros de água desionizada. Deixe a placa secar completamente.Conte as manchas usando um leitor automatizado de manchas Ellis. Selecione clones de linfócitos T para confirmação específica do epítopo. Em seguida, realize o ensaio de manchas Ellis com 10 elevado à terceira potência de células T clonais para verificar a reatividade a cada um dos três peptídeos contidos na região do epítopo.Prepare LCLs autólogos infectados com o vírus vaccinia recombinante selvagem e também LCLs autólogos infectados com o vírus vaccinia recombinante expressando a proteína E seis ou E sete do HPV 16. Novamente, utilize o ensaio Ellis bot em células T clonais selecionadas para comparar a reatividade frente a LCLs autólogos infectados com o vírus vaccinia recombinante selvagem e a reatividade frente a LCLs autólogos infectados com o vírus vaccinia recombinante, expressando a proteína E seis ou E sete do HPV 16, com clones de células T selecionados. Primeiro, realize um ensaio Ellis Spott utilizando uma série de peptídeos sobrepostos de nove MER que cobrem a região do epítopo.Em seguida, realize um ensaio de mancha LY para verificar a reatividade a uma série de peptídeos de comprimentos variados. Prossiga com um ensaio de mancha lie utilizando uma faixa de concentração de alguns poucos peptídeos, os mais prováveis de conter a sequência mínima e ótima de aminoácidos.Prepare LCLs alogênicos isolados do indivíduo humano de interesse que compartilham uma ou duas moléculas de classe I do HLA. Selecione clones de células T em bom estado de crescimento. Realize um ensaio de Ellie spot utilizando 10 elevado à quinta potência de células LCLs alogênicos e 10 elevado à terceira potência de células do clone de células T, com o peptídeo mínimo e o peptídeo ótimo na concentração de 10 micromolar.Uma vez que os clones de células T específicos pelo epítopo tenham sido caracterizados, eles podem ser testados quanto à reatividade cruzada com outros tipos de HPV de alto risco. Basta triar os clones de células T de interesse com um ensaio Ellie spot para detectar reatividade com peptídeos contendo sequências de aminoácidos homólogas dos outros tipos de HPV de alto risco. O sujeito um é uma mulher afro-americana de 22 anos com histórico recente de lesão intraepitelial escamosa de alto grau diagnosticada por biópsia.No dia do tratamento pelo procedimento de excisão elétrica de LU, os linfócitos T foram coletados da paciente. Os resultados do ensaio de Ellis spot da linhagem de linfócitos T CD8 dela indicam que a região HPV 16, E6 46 a 70 continha um epítopo de linfócito T com base em níveis de secreção de interferon gama 1,2 vezes 10 à quinta. Linfócitos T específicos para o epítopo foram selecionados após diluição limitante em um quinto das células selecionadas.262 clones de células T foram colhidos. As células selecionadas restantes não foram utilizadas, já que a primeira tentativa de clonagem de células T foi bem-sucedida. O ensaio de detecção Hiro put Ellis realizado em 94 desses clones identificou 62 clones positivos no rastreamento.Os clones restantes de linfócitos T não foram testados, já que o primeiro ensaio Ellis Spott identificou clones de linfócitos T específicos para o peptídeo. A natureza específica para epítopos de oito clones positivos na triagem com bom crescimento foi confirmada com os três peptídeos de 15 MER que cobrem a região individualmente.Todos os clones de células T indicaram positividade com os peptídeos do HPV 16, E 6 de 51 a 65. Seis dos oito clones foram positivos com o peptídeo E 6 de 46 a 60 e nenhum dos clones foi positivo com o peptídeo E 6 de 56 a 70. Aqui são apresentados ensaios de placas de Ellis com LCLs autólogas infectadas com um vírus vaccinia recombinante expressando a proteína E seis ou a proteína E sete do HPV 16.Esses resultados demonstram que os clones de células T reconhecem um epítopo E seis processado endogenamente; uma série de peptídeos sobrepostos de nove MER que cobrem a região H PV 1646 a 65 facilitou a caracterização da sequência mínima e ótima do epítopo de células T. A melhor resposta foi obtida com o peptídeo E 6 53 a 61; os epítopos peptídicos sobrepostos identificaram o peptídeo de 10 MER E 6 52 a 61 como a sequência mínima e ótima de forma mais consistente. Curiosamente, o peptídeo E 6 53 a 61 apresentou resposta igualmente forte com o clone de células T.As curvas de dose-resposta número 79 indicam que o peptídeo E 6 52 a 61 manteve a positividade muito mais eficazmente do que o peptídeo E 6 53 a 61 em concentrações mais baixas de peptídeo. Neste exemplo, o indivíduo A, no qual foi detectada a sequência mínima e ótima de E 6 75 a 83, foi analisado quanto à restrição da molécula de classe I HLA do epítopo de células T CD8. Alta positividade é observada com uma LCL expressando as moléculas B 62 e CW 3, enquanto positividade de fundo é mostrada com uma LCL expressando CW 3, sendo que algumas regiões do genoma do HPV são bem conservadas.Por exemplo, sequências homólogas às regiões E6 52 a 61 do HPV 16 identificadas no sujeito um estavam presentes em outros 13 tipos de HPV de alto risco. De acordo com isso, demonstrou-se forte reconhecimento cruzado para oito dos 13 tipos de HPV de alto risco. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em sete semanas a partir do dia da coleta sanguínea, se realizada corretamente. Lembre-se de utilizar técnica estéril durante todo o procedimento.Não se esqueça de que o trabalho com qualquer vírus pode ser perigoso e que precauções, como o uso de roupas de proteção, devem sempre ser tomadas durante a realização do procedimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como caracterizar novos Es de células T.

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Novel gerações de ensaios funcionais, tais como o interferão gama (IFN-γ) ELISpot, que detectam a produção de citoquinas ao nível de células individuais e fornecer tanto a caracterização quantitativa e qualitativa das respostas das células T pode ser utilizado para avaliar as respostas imunes mediadas por células contra a varicela zoster vírus (VZV).

Desenvolvimento de uma varicela-zoster imunidade mediada por células específicas do vírus ELISpot Ensaio para Avaliar-γ IFN Após Cordão Umbilical Transplante de Sangue

Ensaio enzyme-linked immunospot cultivadas interferão-γ longo termo é usado como uma medida das respostas de memória central e correlaciona-se com a resposta à vacina anti-micobacterianos de protecção. Com este ensaio, as células mononucleares de sangue periférico são estimuladas com antigénios micobacterianos e interleucina-2 durante 14 dias, permitindo a diferenciação e a expansão das células T de memória central.

Aplicação de longo prazo cultivadas Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Ensaio para a Avaliação e efetoras de memória T respostas de células em gado

Descrevemos aqui um método de isolamento para obtenção de linfócitos intraepiteliais endocervicais humanos para análise de células T gama delta intraepiteliais. Este protocolo pode ser estendido para a purificação de células T gama delta endocervicais por esferas magnéticas ou por classificação de células.

Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T

Aqui nós apresentamos um protocolo para descrever o desenvolvimento e validação de uma única molécula matriz digital ensaio de ELISA, que permite a detecção de ultra sensível de todos os subtipos de IFN-α em amostras humanas.

Desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz Digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana Interferon-α

O desenvolvimento do ensaio ELISpot para cobaia PBMCs interferão-gama permite a caracterização das respostas de células T neste modelo altamente relevantes para o estudo de doenças infecciosas. Temos aplicado o ensaio para medir respostas de células T associadas a intradérmica entrega de vacinas de DNA.

Ensaio de ELISpot otimizado de Interferon-gama às respostas de célula T medida no modelo de porquinho da Índia após a vacinação

Com base em uma matriz de peptídeos derivadas do vírus da hepatite B (HBV), as respostas de células T CD4 específicas do HBV poderiam ser avaliadas em paralelo com a identificação de epítopos de células T CD4 específicas do HBV.

Análise das respostas e identificação de epítopos de células T T específicas do HBV com base em uma matriz de peptídeos

Este manuscrito descreve como avaliar a imunogenicidade in vivo de vesículas extracelulares derivadas de células tumorais (EVs) usando citometria de fluxo. Os EVs derivados de tumores submetidos à morte de células imunogênicas induzidas pelo tratamento parecem particularmente relevantes na imunossuperveiência tumoral. Este protocolo exemplifica a avaliação dos EVs de tumor imunoestimulatório induzidos por oxaliplatina, mas pode ser adaptado a várias configurações.

In vivo Triagem de imunogenicidade de vesículas extracelulares derivadas do tumor por citometria de fluxo de células T esplênicas

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar epítopos de neutralização em partículas semelhantes a vírus que exibem antígenos (VLPs). A imunoprecipitação do vírus da imunodeficiência humana (HIV) derivada de VLPs é realizada usando anticorpos monoclonais específicos de glicoproteínas de envelope acoplados a contas magnéticas conjugadas por G. Os VLPs capturados são posteriormente submetidos à análise de SDS-PAGE e western blot empregando anticorpos específicos da proteína do núcleo viral.

Detecção de epítopos sensíveis à neutralização em antígenos exibidos em vacinas baseadas em partículas semelhantes a vírus (VLP) usando um ensaio de captura

Aprenda a isolar e caracterizar clones de células T específicas para antígenos do HPV usando ensaio interferon-γ ELISpot. Este método robusto identifica epítopos de células T para desenvolvimento de imunoterapias direcionadas.

O uso de interferão-γ Enzyme-linked Assay immunospot Caracterizar Novel epitopos de células T de papilomavírus humano

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