Name: DII-rotulagem de neurônios DRG para estudar em uma ramificação axonal Preparação Monte Whole of Mouse Embryonic Spinal Cord (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda a rotular neurônios DRG com DiI para visualizar padrões de ramificação axonal em preparações de montagem inteira da medula espinhal embrionária de camundongo. Este método permite analisar bifurcações em T ou Y no desenvolvimento neural.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Alistair Garratt (Max Delbrück Center, Berlin) para comentários úteis. Este trabalho foi financiado pelo centro de pesquisa colaborativa (SFB665) do Conselho de Pesquisa Alemã (DFG).

1. Procedimento de dissecção Nota: O uso experimental de camundongos devem seguir as orientações aprovadas oficialmente para o cuidado e uso de animais de laboratório. <ol><li> Antes da preparação, configure seu microscópio de dissecação e lay out dos instrumentos cirúrgicos necessários para a dissecção incluindo tesouras grandes e pequenas, grandes pinças dentadas, pinças curvas e quatro conjuntos de Dumont No.5 dissecar fórceps (dois dos quais no interior polido sugestões) ( para mais detalhes veja a tabela de reagentes e equipamentos específicos). Coloque uma folha de papel de filtro em uma de 100 mm placa de Petri Sylgard revestido. Despeje frio PBS nos poços de uma placa de 12 poços, um de 100 mm placa de Petri e um tubo de 12 ml e deixar no gelo. Pipetar 2 ml de tampão de fixação (paraformaldeído 4% em PBS, pH 7,4) em cada poço de uma placa de 12 segundo poço e colocar no gelo. </li><li> Depois de anestesiados, o sacrifício da barragem cronometrado grávida no E12.5 (detecção de plug vaginal foi designado como E0.5), coloque o mousecom o seu lado ventral para cima em três folhas de papel toalha e deixe a área abdominal com etanol 70%. </li><li> Abra a cavidade abdominopélvica, isolar os chifres bilateral uterina e transferi-los para um dos pratos de 100 mm com gelado PBS. </li><li> Sob controle microscópico, faça uma incisão longitudinal da parede uterina com pequenos, tesoura reta e cortar cada saco amniótico da placenta. </li><li> Descascar o saco amniótico de cada embrião e cortar o cordão umbilical. </li><li> Com uma tesoura pequena, decapitar os embriões e colocar a cabeça ou uma parte deles de lado para o isolamento de DNA genômico se genotipagem deve ser exigido. Posteriormente, transferir o torsi aos poços respectivos da placa de 12 bem com o frio PBS. </li><li> Molhar o papel de filtro no prato Sylgard com algumas gotas de PBS e posição de um tronco embrionárias com o lado dorsal até no papel. Para melhor estabilidade, acertar a sua cauda e extremidades do corpo. </li><li> Trabalharsob um microscópio de dissecação com uma ampliação de cerca de 16x, com cuidado prenda a pele do embrião acima da medula espinhal com dois pares de pinças com ponta fina e delicadamente desagregá-la. Começando no meio, vá primeiro para a cauda e, em seguida, retomar a partir do meio para o lado anterior. </li><li> Molhado o embrião de vez em quando com duas ou três gotas de PBS para impedir que a secagem. </li><li> Para evitar que DRG são teared fora da medula espinhal quando ela é removida do embrião destacar o DRG e da medula espinhal em torno da coluna vertebral cartilaginosa por movimentos deslizantes horizontal com a lâmina de uma pinça bem com interior polido dicas. A partir de meados do lado direito do embrião, trabalhar o seu caminho em direção à cauda e, em seguida, até o final anterior. Depois, repita o procedimento no outro lado. Tenha cuidado para não arrancar a DRG associados. </li><li> Para retirar completamente o cabo soltou da coluna vertebral do embrião, pegar seu cérvicoal peça com uma pinça fina e puxe-o em uma única peça para o seu fim caudal. </li><li> Submergir o cabo isolado da coluna vertebral com DRG anexado em um poço da placa de 12 bem preenchido com tampão de fixação e prosseguir com a preparação de medulas espinhais dos embriões restantes. </li><li> Fix medula espinhal pelo menos duas horas no gelo. </li></ol> 2. DII-rotulagem de neurônios DRG <ol><li> Para cada medula espinhal para ser rotulado, prepare duas agulhas de vidro com um puxador de micropipeta. Nós usamos um modelo de Sutter extrator P-97 eletrodo (configuração do programa: 1 HEAT = 625, VEL = 35 TEMPO = 175; 2 HEAT = 600, VEL = 25 TEMPO = 175; HEAT 3 = 630, = VEL... 30 TIME, = 150). </li><li> Sob controle microscópico molhe a ponta de cada agulha de vidro 3-5 vezes em uma solução de 5% (w / v) de DII em etanol. Evaporação do etanol cria uma fina camada de cristais de DII na agulha. </li><li> Trabalhando sob um microscópio de dissecação com uma ampliação de aproximadamente 40x, coloque uma medula espinhal com seus vlado entral up em um slide. Usando uma tesoura primavera, abrir a cabo no lado ventral em todo o seu comprimento cortando o floorplate para permitir a posterior montagem da preparação em um modo de livro aberto invertido (ver secção C). </li><li> Posição da medula espinhal com o lado dorsal até em um slide. Em seguida, manualmente abordagem o cabo com a ponta coberta de DII da agulha de vidro sob visualização microscópica e cuidadosamente furar DRG cada segundo de um lado da medula espinhal. Quase nenhum vestígio de DII deve ser visível no DRG perfurado para garantir a rotulagem de apenas um pequeno número de neurônios. Dê uma segunda agulha para o outro lado do cabo. Visando apenas a cada segundo DRG evita uma sobreposição de rotulados projeções axonal da DRG vizinhas que podem complicar a diferenciação de axônios individuais. </li><li> Retorno da medula espinhal para o buffer de fixação e incubar no escuro por pelo menos seis horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C para dar tempo para o corante para diffuse ao longo do axônio dentro da membrana plasmática. Permitir, por um período de incubação mais longo (até dois dias a 4 ° C) se a análise de crescimento garantia para a medula espinhal é desejada. </li></ol> 3. Análise microscópica de montagem e <ol><li> Seguintes corante difusão posição, um único cabo spinal com o lado dorsal para baixo em uma lamela em uma gota de PBS. Tome cuidado para que o DRG anexados são corretamente orientados lateralmente e não se misturam. Aspirar o excesso de fluido e achatar o cabo em um modo de livro aberto invertido com a pinça. </li><li> Monte a preparação sobre uma lâmina de microscópio usando PBS. </li><li> Para evitar o aumento indesejado de análise de fluorescência de fundo coloração microscópica de rotulados projeções axonal deve ser realizada no dia da montagem. Até então, manter os slides no escuro a 4 ° C. </li></ol> 4. Resultados representativos: A medula espinhal do rato recebe pr aferentesojections de 8 pares de colo do útero, 13 pares de torácicos, 5 pares de pares lombar e sacral DRG 4 de um total de 60 gânglios espinhais. Depois de algum treino uma medula espinhal com a maioria dos DRG ainda ligado pode ser isolado de um embrião em menos de cinco minutos. Este procedimento é adequado para o isolamento de medulas espinhais com DRG em anexo a partir de embriões E13.5 E11.5 para mouse. No entanto, melhores resultados são obtidos a partir E12.5. Resultados exemplar do processo de rotulagem descritos aqui são mostrados na Figura 3. A rotulagem dos DRG em toda a extensão da medula espinhal podem então ser usados ​​para quantificar o comportamento de ramificação axonal em diferentes níveis vertebrais (Fig. 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema representando os dois principais modos de ramificação axonal. (A) Desvios pelas atividades do cone de crescimento que poderia levar a uma bifurcação - como indicado aqui - assim como arbors terminal complexos ou(B) formação de colaterais no eixo axônio (intersticial ramificação). O último modo é o tipo dominante de ramificação de projetar axônios corticais e tálamo-cortical 6,7. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" /> Figura 2 projeções aferentes dos neurônios DRG para a medula espinhal embrionárias mostrar os dois tipos de ramificação axonal:. Axônios primeira filial na DREZ pela bifurcação (1) e da forma filha ramos colaterais resultantes após um período de espera por intersticial ramificação (2). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" /> Figura 3. Visualização de trajetórias individuais axonal de neurônios DRG embrionárias mouse. (A) da medula espinhal com DRG anexado preparados a partir de um embrião de rato E12.5. (Barra Escala, 1 mm.) (BD) vistas dorsal da DII marcado DRG de camundongos selvagens com ampliação crescente são mostrados. Em B a cada DRG segundo é labeled por DII. Imagens de fluorescência são invertidos, caudal está à esquerda e em C e D, lateral está no fundo. Em C um pequeno número de axônios é rotulado e em maior ampliação da presença de T-like ramos podem ser identificados no DREZ da medula espinhal. (Escala de barras, 250 mM (B), 100 mm (C) e 50 mm (D).) <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" /> Figura 4. Quantificação dos ramos em forma de T, única gira rostral ou caudal no tipo selvagem e C-peptídeo natriurético do tipo (CNP) camundongos deficientes em E13.5. O número de axônios única contados são dadas entre parênteses para os níveis de tronco diferentes para cada genótipo. C-ou-R voltas - o crescimento somente na direção caudal ou rostral, respectivamente. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" /> Figura 5. A GMPc desencadeia sinalização bifurcação axônio sensorial na DREZ da medula espinhal. (A) Esquema dea via de sinalização composta cGMP do ligante CNP, o receptor de guanilato ciclase Npr2 ea serina / treonina quinase cGKIα em neurônios DRG embrionárias. Npr2 gera cGMP de GTP com a estimulação pelo CNP. (B) Dii rastreamento de axônios única de neurônios DRG em camundongos wild-type e CNP-deficiente. (Barra Escala, 25 mm.)

<ol><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+diO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li>
<li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li>
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<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li>
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<li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li>
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<li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Padrões estereotipados de projeção composto por dois tipos de formação ramo axonal juntamente com facilidade de preparação em combinação com o uso de tecido fixo para DII rotulagem faz o cabo embrionárias espinhal com DRG anexado um modelo favorável ao estudo axonal ramificação. A aplicação de pequenas quantidades de DII usando agulhas de vidro revestido permite - em contraste com a rotulagem grosso do DRG - a visualização de pequenos grupos de neurônios DRG e, assim, a análise de axônios individuais e seus padrões de r...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> Estereomicroscópio Stemi RDC </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solução tampão fosfato (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Merck </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura cirúrgica padrão </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dentada forceps padrão </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> Extra fino tesoura de íris </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps curvos </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 multa forceps dicas </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 acabamento espelhado forceps </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas-Tübingen Primavera tesoura </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> Papel-filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Precisão Instrumentos mundo </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100-mm placas de Petri </td><td> Greiner </td><td> 663102 </td><td></td></tr><tr><td> 12 ml de tubos de polipropileno </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> ECO3.1 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> 12 placa de cultura bem </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Merck </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown micropipeta extrator P-97 </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vidro borosilicato capilares </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> DII (1,1 &#39;-Dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetrametil - indocarbocyanine perclorato) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 468495 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio slides SuperFrost Plus </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> Tampa de vidro desliza </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> 1870,2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

dii-rotulagem de neurônios drg para estudar em uma ramificação axonal preparação monte whole of mouse embryonic spinal cord

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Apresentamos aqui uma técnica para identificar as trajetórias de pequenos grupos de neurônios DRG para a medula espinhal de embriões através da coloração difusivo usando o traçador lipofílico 1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DII) 1 . A comparação das vias axonal de tipo selvagem com os de linhas de rato em que os genes são mutados permite testes para um papel funcional de proteínas candidato no controle de ramificação axonal que é um mecanismo essencial na fiação do sistema nervoso. Ramificação axonal permite que um neurônio individual para se conectar com múltiplos alvos, fornecendo assim a base física para o processamento paralelo de informações. Ramificações em regiões objectivo intermédio de crescimento axonal pode ser diferenciado de arborização terminal. Além disso, diferentes modos de formação ramo axonal pode ser classificada dependendo de resultados de ramificação das atividades do cone de crescimento (divisão ou bra adiadanching) ou a partir do brotamento de colaterais a partir do eixo do axônio em um processo chamado de ramificação intersticial 2 (Fig. 1). As projeções centrais de neurônios da DRG oferecer um sistema útil experimental para estudar os dois tipos de ramificação axonal: quando seus axônios aferentes alcançar a zona de entrada da raiz dorsal (DREZ) da medula espinhal entre os dias embrionários 10-13 (E10 - E13) que exibir um padrão estereotipado de T ou em forma de Y bifurcação. Os dois axônios filha resultando então prosseguir em direções rostral ou caudal, respectivamente, na margem dorsolateral da medula e só após um período de espera colaterais brotam esses axônios-tronco para penetrar na massa cinzenta (intersticial ramificação) e do projeto para os neurônios de revezamento em específico lâminas da medula espinhal, onde eles ainda arborize (terminal de ramificação) 3. Traçados DII revelaram cones de crescimento na zona da raiz dorsal entrada da medula espinhal que pareciam estar no processo de dividir o que sugere que bifurcação é causada pela divisão do cone de crescimento em si 4 (Fig. 2), no entanto, outras opções foram discutidas e 5. Este vídeo demonstra como primeiro dissecar a medula espinhal de ratos E12.5 deixando o DRG em anexo. Fixação dos montantes seguintes diminuto exemplar da DII são aplicadas a DRG usando agulhas de vidro retirado tubos capilares. Após uma etapa de incubação, o cordão espinhal é rotulada montado como uma preparação de livro aberto invertido para analisar axônios individuais usando microscopia de fluorescência.

As projeções estereotipadas de aferentes sensoriais para a medula espinhal de roedores oferecem um sistema de fácil acesso experimental para o estudo de ramificação axonal através do rastreamento de axônios individuais.

DII-rotulagem de neurônios DRG para estudar em uma ramificação axonal Preparação Monte Whole of Mouse Embryonic Spinal Cord

Apresentamos aqui uma técnica para marcar as trajetórias de pequenos grupos de neurônios do gânglio da raiz dorsal (GRD) para dentro da medula espinhal embrionária por meio de coloração difusiva utilizando o...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar os padrões de ramificação de axônios individuais de neurônios de gânglios da raiz dorsal em uma preparação em montagem inteira da medula espinhal de embrião de camundongo. Para identificar moléculas envolvidas na ramificação axonal, os trajetos dos neurônios de gânglios da raiz dorsal para dentro da medula espinhal de camundongo oferecem um sistema experimental simples, fácil e acessível para estudar a ramificação axonal. Quando os axônios ENT dos neurônios de gânglios da raiz dorsal alcançam a zona de entrada da raiz dorsal da medula, eles exibem um padrão estereotipado de bifurcação em forma de T ou Y.Os dois axônios filhos resultantes seguem então em direções rostral ou caudal, respectivamente, na margem lateral dorsal do cordão. Somente após um período de espera, brotos colaterais surgem desses axônios tronco para penetrar na substância cinzenta e projetar neurônios de retransmissão em lâminas específicas da medula espinhal, onde ocorre a arborização terminal. Este vídeo demonstra primeiro como dissecar a medula espinhal.Com seu gânglio da raiz dorsal (GRD) anexado de um camundongo no dia embrionário 12,5, após a fixação do espécime, pequenas quantidades de dii são aplicadas ao GRD utilizando agulhas de vidro puxadas a partir de tubos capilares. Após uma etapa de incubação, a medula espinhal marcada é montada como uma preparação do tipo "livro aberto invertido" para analisar axônios individuais por microscopia de fluorescência. O ramificamento axonal é um aspecto importante no desenvolvimento da conectividade neural. O método aqui apresentado permite a comparação dos padrões de ramificação de camundongos do tipo Y com os de camundongos mutantes, possibilitando assim a identificação de moléculas que regulam o ramificamento axonal.Primeiro, prepare o microscópio estereoscópico e organize os instrumentos cirúrgicos necessários para a dissecação. Coloque uma folha de papel de filtro em uma placa de Petri de 100 milímetros revestida com seda. Em seguida, despeje PBS frio nas cavidades de uma placa de 12 poços, em uma placa de Petri de 100 milímetros e em um tubo de 12 mililitros, e deixe sobre gelo.Pipete dois mililitros de tampão de fixação com paraformaldeído 4% em cada poço de uma segunda placa de 12 poços e coloque na gelo. Após isolar os cornos uterinos bilaterais de um camundongo, transfira-os para a placa de 100 milímetros com PBS gelado. Após decapitar os embriões, transfira os tecidos dos embriões para a placa de 12 poços.Placa de poços umedeça o papel filtro no recipiente S guard com algumas gotas de PBS e posicione um tronco embrionário com seu lado dorsal voltado para cima sobre o papel para maior estabilidade. Alinhe a cauda e as extremidades afastando-as do corpo, trabalhando sob microscópio estereoscópico com ampliação de aproximadamente 16 vezes. Pince cuidadosamente a pele do embrião acima da medula espinhal com dois pares de pinças de ponta fina, começando pelo centro.Rasgue suavemente a pele primeiro em direção à cauda e, em seguida, retomando do meio em direção ao lado anterior. Umedeça o embrião de tempos em tempos com duas ou três gotas de PBS para evitar que seque, garantindo que os gânglios da raiz dorsal ou DRG não sejam rompidos da medula espinhal. Quando for removido, solte os DRG e a medula espinhal da coluna vertebral cartilaginosa circundante começando pelo meio do lado direito do embrião e avançando em direção à cauda, e depois até a extremidade anterior para soltar completamente a medula espinhal desprendida do embrião.Segure a parte cervical com pin&ccedil;as finas e puxe-a inteira em dire&ccedil;&atilde;o ao seu cord&atilde;o. Mergulhe a medula espinhal isolada com os g&acirc;nglios da raiz dorsal (DRG) anexos em um po&ccedil;o de uma placa de 12 po&ccedil;os preenchida com solu&ccedil;&atilde;o de fixa&ccedil;&atilde;o, e prossiga com o preparo das medulas espinhais dos embri&otilde;es restantes.Fixe as medulas espinhais por pelo menos duas horas sob gelo para cada medula a ser marcada; prepare duas agulhas de vidro utilizando um puxador de micropipetas, sob controle microscópico. Mergulhe a ponta de cada agulha de vidro de três a cinco vezes em uma solução a 5% de corante em etanol para criar uma camada fina de cristais de corante na agulha, trabalhando sob um microscópio estereoscópico com ampliação de aproximadamente 40 vezes. Coloque uma medula espinhal com seu lado ventral voltado para cima sobre uma lâmina usando pinças de mola.Abra o cordão na face ventral ao longo de todo o seu comprimento, cortando a placa do assoalho para permitir o montagem em livro aberto invertido. Posicione o cordão espinhal com a face dorsal voltada para cima sobre a lâmina. Em seguida, aproxime manualmente o cordão com a ponta do bastão de vidro coberta pelo dai e perfure cuidadosamente cada segundo gânglio da raiz dorsal (DRG) em um dos lados do cordão espinhal.Quase nenhum traço de dai deve ser visível no DRG perfurado para garantir a marcação de apenas um pequeno número de neurônios utilizando a segunda agulha. Repita para o outro lado da medula, mirando apenas a cada segundo DRG para evitar sobreposição de projeções axônicas marcadas de segmentos vizinhos, o que poderia complicar a diferenciação de axônios individuais.Retorne a medula espinhal ao tamp&atilde;o de fixa&ccedil;&atilde;o e incube no escuro por pelo menos seis horas &agrave; temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius, para permitir tempo suficiente para que a dieta difunda ao longo do ax&ocirc;nio dentro da membrana plasm&aacute;tica. Ap&oacute;s a difus&atilde;o da dieta, posicione uma &uacute;nica medula espinhal com seu lado dorsal voltado para baixo sobre uma lam&iacute;nula, em uma gota de PBS; aspire o l&iacute;quido em excesso e aplane a medula espinhal em modo de livro aberto invertido. Utilizando pin&ccedil;as.Tenha cuidado para que os gânglios da raiz dorsal (DRG) fixados estejam corretamente orientados lateralmente e não se misturem; monte o preparo em uma lâmina de microscópio utilizando PBS para evitar o aumento da coloração de fundo indesejada. A análise por microscopia de fluorescência das projeções axonais marcadas deve ser realizada no dia do montagem. Até então, mantenha as lâminas no escuro a quatro graus Celsius.Aqui, são mostradas vistas dorsais de gânglios da raiz dorsal (GRD) marcados com Dai de camundongos selvagens com aumento progressivo, conforme descrito a cada dois segundos. O GRD foi marcado com Dai. Aqui, um pequeno número de axônios está marcado e, com maior aumento, pode-se identificar a presença de ramificações em formato de T na zona de entrada da raiz dorsal da medula espinhal.Ramos em formato de T. Voltas únicas rostral R ou caudal C são quantificadas aqui em diferentes níveis vertebrais em camundongos do tipo selvagem e deficientes em peptídeo natriurético de tipo C, em E 13,5.O número total de neurônios contados é indicado entre parênteses e a porcentagem do tipo de trajetória é mostrada abaixo. Em contraste com o tipo selvagem, os axônios de neurônios de gânglios da raiz dorsal em mutantes da sinalização CMP giram apenas em uma direção, em vez de bifurcar na zona de entrada da raiz dorsal da medula espinhal. Este método nos ajudou a identificar uma cascata de sinalização CGP essencial para a bifurcação dos axônios sensoriais na zona de entrada da raiz dorsal.Em contraste com os acentos do tipo selvagem de cgm, o sinal P só se desloca em uma direção, em vez de bifurcar na zona de entrada da raiz dorsal. Esses estudos também revelaram que a formação co não é afetada nos mutantes do sinal P em CG, indicando que o segundo tipo de ramificação axonal observado em neurônios DGen é regulado de maneira diferente.

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JoVE Journal

Neuroscience

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