Geração de Culturas Raft organotípicas de queratinócitos humanos primários

O objetivo geral deste procedimento é gerar culturas em lâmina organotípicas a partir de queratinócitos primários ou linhagens celulares epiteliais estabelecidas. Isso é realizado primeiramente pela confecção de tampões de colágeno com fibroblastos. Em seguida, as células epiteliais são sobrepostas aos tampões.

Os êmbolos são então transferidos para as grades de balsa e mantidos em uma interface ar-líquido por 10 a 14 dias. Na etapa final, as balsas são colhidas. Por fim, as alterações na diferenciação epitelial podem ser avaliadas por meio de análise histológica ou imunohistoquímica. Este método pode fornecer informações sobre a diferenciação epitelial.

Também pode ser aplicado a outros sistemas, como vírus que infectam o epitélio cutâneo ou mucoso como parte de seu ciclo de vida. O procedimento será demonstrado por Dan Anneker, um aluno de pós-graduação no meu laboratório. Primeiro, despeje ácido sulfúrico crômico em um béquer de vidro e imerja as grades de flutuador metálicas no ácido por uma hora.

Em seguida, lave continuamente as grades durante a noite com água da torneira. Após a lavagem noturna, enxágue as grades por mais três a cinco horas em água bidestilada e deixe as grades da balsa secarem. Depois, dobre três lados da balsa, cerca de 0,5 centímetros, mantendo a mesma distância entre eles, e autocalefe as grades da balsa.

Após preparar o gel de colágeno, adicione tripsina aos dois fibroblastos e, em seguida, neutralize a tripsina com o meio. Transfira os fibroblastos para um tubo cônico de 50 mililitros e conte as células para determinar o número de flutuadores que podem ser produzidos. Em seguida, após centrifugar as células por quatro minutos a 244 ×g em temperatura ambiente, aspire o meio do pellet de fibroblastos e re-suspenda as células em uma quantidade apropriada de tampão de reconstituição contendo DMEM e colágeno, de acordo com o número de flutuadores calculado.

Adicione o colágeno por último para evitar que o gel se solidifique muito rapidamente. Após a adição do colágeno, misture a solução rapidamente, mas com cuidado, para evitar a introdução de bolhas no gel. Se a mistura do gel estiver muito amarelada, adicione algumas gotas de solução esterilizada por filtração.

Um normal de hidróxido de sódio. Misture suavemente até o gel adquirir uma coloração alaranjada avermelhada, indicativa do pH correto. Em seguida, pipete três mililitros da mistura de colágeno com fibroblastos lentamente ao longo da parede de cada poço de uma placa de cultura de seis poços, evitando a formação de bolhas, e incube a placa por 30 minutos a 37 graus Celsius para permitir a solidificação do gel.

Quando o gel estiver sólido, adicione três mililitros de meio E com EGF sobre o gel de colágeno solidificado e retorne a placa ao incubador. Após cultivar queratinócitos de baixo número de passagens até cerca de 70% de confluência, trypsinize os queratinócitos e, em seguida, neutralize a tripsina com eed. Com EGF, conte as células para determinar o número de enxertos que podem ser produzidos.

Após centrifugar as células, ressuspenda o pellet em um mililitro de eed com EGF para cada cultura de "raft" calculada. Agora, remova o meio dos géis de colágeno inclinando a placa de seis poços sobre o lado, e então adicione dois mililitros de eed fresco com EGF a cada gel. Em seguida, adicione cuidadosamente um mililitro de queratinócitos ressuspendidos aos dois mililitros de eed já presentes em cada um dos poços.

Pipete suavemente os queratinócitos juntamente com os dois mililitros de meio e deixe cair gota a gota sobre o tampão de colágeno. Coloque a placa no incubador a 37 graus Celsius por dois a quatro dias para permitir que as células cresçam até atingirem confluência. As células estão prontas quando o meio mudar para amarelo um dia após a troca do meio ou, no quarto dia, utilize pinças estéreis para posicionar uma grade estéril de metal, com os lados curvados voltados para baixo, em um recipiente de 10 centímetros de diâmetro.

Aspire o meio de um gel de colágeno e, em seguida, deslize uma espátula estéril ao redor do perímetro do gel com movimentos para cima e para baixo para soltar o gel das laterais do poço. Mover o tampão de colágeno da placa de seis poços para a grade é a parte mais difícil deste procedimento. Tenha cuidado para deslizar suavemente a espátula sob o tampão sem dividi-lo e coloque-o plano sobre a grade sem criar bolhas de ar entre o tampão e a grade.

Posteriormente, você pode usar uma espátula para alisar as partes que se dobraram para baixo durante este procedimento. Para remover o gel, incline ligeiramente a placa e coloque a espátula sob o gel, levantando-o. Coloque o gel de colágeno sobre a grade metálica sem formar bolhas entre a grade e o gel.

Para criar uma interface ar-líquido, adicione cuidadosamente o EED sem EGF lentamente na parte inferior da placa, de modo que a grade de enxertos entre em contato com o meio, mas o gel de colágeno não. Finalmente, incube os enxertos a 37 graus Celsius. Mantendo a interface ar-líquido, colete os enxertos após 14 dias. Como visto nesta figura, enxertos feitos a partir de queratinócitos humanos primários imortalizados pelo HPV 31 ou Hfk, 30, são notavelmente mais espessos em comparação com enxertos feitos a partir de queratinócitos humanos normais da pele ou hks.

Assim, as proteínas do HPV têm a capacidade de manter as células diferenciadas ativas no ciclo celular. Aqui, foi realizada uma análise imunohistoquímica em cortes transversais de culturas em lâmina tridimensionais geradas a partir de HK 30, bem como de HKS normais, utilizando um anticorpo contra citoceratina 10 ou K 10 em verde. A K 10 não foi expressa na camada basal indicada aqui pelas setas, sendo encontrada apenas nas camadas suprabasais, que consistem em células em progressiva diferenciação.

Nesta figura, a expressão da proteína do HPV, E um, E quatro, uma proteína tardia que é restrita às camadas mais superficiais do epitélio e representada aqui em verde, é mostrada conforme esperado. Nenhuma marcação é observada em culturas em lâmina provenientes de hks normais, como na figura anterior.

As setas indicam novamente a camada basal do epitélio após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia do câncer estudarem a patogênese dos papilomavírus humanos utilizando um sistema que imita a diferenciação epitelial in vivo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar culturas em lâmina tridimensionais a partir de queratinócitos primários ou linhagens celulares epiteliais estabelecidas.