Name: Geração de Culturas Raft organotípicas de queratinócitos humanos primários (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprenda a gerar culturas raft organotípicas de queratinócitos humanos primários para estudar diferenciação epitelial e interações vírus-hospedeiro. Este método reproduz condições in vivo em 10 a 14 dias.

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Os autores gostariam de agradecer a Sally Roberts (University of Birmingham, Birmingham Reino Unido) para a dom tipo do anticorpo E1E4. Este trabalho foi financiado por uma concessão do Instituto Nacional do Câncer (4R00CA137160-03).

1. Preparação para culturas Jangada organotípicas <ol><li> As grelhas de jangada de metal muito primeiro ser tratados com ácido sulfúrico crómico para remover qualquer resíduo que poderia interferir com o processo de diferenciação. Grelhas de metal imergir em um copo de vidro contendo ácido sulfúrico durante uma hora, em seguida, lavado continuamente durante a noite com água da torneira. Após o enxaguamento durante a noite, as grades de jangada deve ser lavado durante 3-5 horas em água destilada duas vezes. </li><li> Para fornecer suporte para as jangadas, dobre três lados da jangada cerca de 0,5 cm a igual distância uns dos outros. As grelhas de metal deve então ser autoclavados. </li><li> Preparar o tampão de reconstituição 10X por adição de 2,2 g de NAHCO3 e 4,8 g de Hepes. Dissolver em 100 ml de 0,05 M de NaOH. Filtrar esterilizar e armazenar em alíquotas de 5 ml a -20 ° C. </li><li> Preparar o DMEM 10X sem bicarbonato de sódio. Filtrar esterilizar e armazenar em alíquotas de 5 ml a -20 ° C. </li><li> Preparar factor de crescimento epidérmico do rato: Dissolver 100 mg de EGF e 10 mg de BSA cada um em 10 mL de água desionizada DDQ 2 0. Combinar EGF e BSA e adicionar a 80 ml ​​de desionizada DDQ 2 0 para um volume total de 100 ml. Filtre-esterilizar alíquota, (5 ml) e guarde na -20 ° C. Para cada litro de meio E adicionar 5 ml de 1 mg / ml EGF (concentração final de 5 ng / ml). </li></ol> 2. Preparação de géis de colágeno <ol><li> Um gel de colágeno é necessário para cada balsa. O colagénio deve ser mantido em gelo para evitar que ele solidificação. Cada gel de colagénio requer 3 ml de mistura de colagénio que consiste em: 2,4 ml de colagénio do tipo frio Rat cauda-de-I (concentração final de 3-4 mg / ml), 0,3 ml de tampão de reconstituição 10X, 0,3 ml de DMEM 10X e1-2 do rato X 10 6 3T3 J2 fibroblastos como células alimentadoras. Para soluções de concentração elevada de colagénio da cauda de rato, diluir em 0,02 M de ácido acético para se atingir a concentração correcta de trabalho. </li><li> Determinar o número de géis de colágeno (balsas), você vai precisar e, em seguida, calcular um master mix para a quantidade de colágeno, reconstit 10Xtampão ution, DMEM 10X e J2 fibroblastos necessário. Incluem o suficiente em cada mistura de mestre para 3-4 géis extra devido à viscosidade do colagénio. </li><li> Para preparar o gel de colágeno, trypsinize os J2 fibroblastos e neutralizar com o meio. Misture todos os fibroblastos e coloque em um frasco de 50 ml cônico. Contar as células para determinar o número de jangadas que podem ser feitas. Mais uma vez, 1-2x10 6 fibroblastos são obrigados por gel de colágeno e, assim, por balsa. Gire para baixo as células em baixa velocidade. </li><li> Aspirar o meio a partir do fibroblasto sedimento e ressuspender na quantidade apropriada de tampão de reconstituição 10X, 10X e DMEM colagénio para o número de jangadas calculados. Adicionar o colagénio última para evitar que o gel de solidificação muito rapidamente. Uma vez que o colagénio é adicionado, misturar rapidamente, mas com cuidado para evitar a introdução de bolhas no gel. O gel deve ser de uma cor laranja avermelhada, indicativo de que o pH correcto. Se a mistura de gel é muito amarelo, adicionar um par de gotas de filtro esterilizado 1NNaOH e misturar suavemente para se obter a cor correcta. </li><li> Adicionar 3 ml de colagénio: mistura de fibroblastos para os poços de uma placa de cultura de 6 poços. A mistura de colágeno deve ser pipetado lentamente para o lado de cada poço para evitar a geração de bolhas. Colocar a placa em um 37 ° C incubador de cultura de tecidos e deixa-se solidificar durante 30 minutos. </li><li> Após 30 minutos, adicionar 3 ml de meio de E com EGF para o topo do gel de colagénio solidificado e retornar a placa para a incubadora. Os géis deve ser mantida a 37 ° C durante pelo menos um dia, mas utilizadas dentro de quatro dias. Resultados óptimos ocorrer após dois dias de incubação. </li></ol> 3. Os queratinócitos Preparando para Diferenciação <ol><li> Queratinócitos baixa passagem deve ser aumentado para cerca de 70% de confluência. Cada balsa exige 1-2x10 6 queratinócitos. Trypsinize os queratinócitos e neutralizar com meio E com EGF. Contar as células para determinar o número de jangadas que podem ser feitas. Gire para baixo as células a SPE baixoed. Ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de E com EGF para cada cultura jangada calculado. </li><li> Aspirar o meio a partir dos géis de colagénio por da inclinação da placa de 6 poços. Adicionar 2 ml de meio fresco E com EGF para cada gel. Para cada gel, cuidadosamente adicionar 1 ml de queratinócitos ressuspensos para a 2 ml de meio E já presente no poço. Gentilmente pipeta os queratinócitos mais a 2 ml de mídia e, em seguida, deixar para trás queda gota a gota, para o gel. Agitação ou agitando a placa pode resultar na distribuição desigual de células para um lado do gel de colagénio. Colocar a placa na incubadora a 37 ° C. </li><li> As células devem ser cultivadas até à confluência, substituindo o meio E por dia. As células são confluentes quando as alterações médias para um dia amarelo após uma mudança de meio. Isso normalmente leva 2-4 dias. Se o meio não mudou por quatro dias, proceda para a próxima etapa. </li></ol> 4. Fazendo as culturas Jangada <ol><li> Use uma pinça estéril, colocar uma grade jangada estéril metal, dobrados para baixo os lados, Em um prato de 10 cm. Aspirar o meio a partir de gel de colagénio. Para soltar o gel a partir dos lados do poço, a volta do perímetro do gel com uma espátula estéril usando um movimento para cima e para baixo. Para remover o gel de colagénio, incline a placa e levante colocando um debaixo espátula. Colocar o gel de colagénio na grelha de metal sem a geração de bolhas entre a grade eo gel. Dois géis podem ser colocadas em cada grade. </li><li> A fim de fazer uma interface ar-líquido, adicionar meio E sem EGF lentamente para o fundo do prato de modo a grade jangada está a tocar os meios de comunicação, mas o gel de colagénio não é. A mídia não deve vir através dos buracos na grade. Adicionar lentamente o meio para evitar a geração de bolhas sob a grade, como isso vai impedir a diferenciação uniforme. Incubar as jangadas a 37 ° C e alterar o meio de todos os outros dias mantendo a interface ar-líquido. Colha as balsas depois de 14 dias. </li></ol> 5. Os resultados representativos Quando tele protocolo é efectuada correctamente com queratinócitos primários, este procedimento irá resultar em um epitélio bem diferenciado onde as diferentes camadas da pele são evidentes. Este ser alcançada através de exame histológico pela coloração seções de culturas de jangada para hematoxilina e eosina (H &amp; E), como mostrado na Figura 1B. HE também é útil para examinar a morfologia de jangadas eo efeito de vírus ou de compostos antivirais sobre a capacidade das células para a estratificação e diferenciar. Por exemplo, jangadas feitas a partir de HPV-imortalizadas primárias de queratinócitos humanos (HFK-31) são notavelmente mais espessa em comparação com jangadas feitas a partir de queratinócitos normais de prepúcio humano (HFK), reflectindo um aumento da taxa de proliferação ea capacidade das proteínas de HPV para manter as células de diferenciação activa no ciclo celular (Figura 1B) 10. Isto resulta em retenção dos núcleos ao longo do epitélio, enquanto que os queratinócitos normais sair do ciclo celular na diferenciação, resultando em um colapso doenvelope nuclear. Para examinar mais de perto a diferenciação, imuno-histoquímica pode ser realizada para examinar marcadores de diferenciação específicos, incluindo citoqueratinas, bem como involucrina, e filagrina. Citoqueratinas diferentes são expressos em fases específicas de diferenciação 7. Como mostrado na Figura 2, citoqueratina 10 (K10) não é expresso na camada basal, e é encontrado apenas nas camadas suprabasais que consistem em células progressivamente de diferenciação. Em jangadas de HPV positivos, a expressão de K10 é atrasado em comparação com a de queratinócitos normais, novamente reflectindo a influência de proteínas de HPV na diferenciação de queratinócitos. A imuno-histoquímica também pode ser usado para examinar o perfil de expressão de genes virais. Mostrada na Figura 3 é uma coloração representante examinar a expressão da proteína de HPV E1 ^ E4, que é uma proteína tardia cuja expressão é restrita às camadas superiores do epitélio. Como esperado, sem coloração é observada em culturas de jangada de Huma normaisn queratinócitos prepúcio. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig1.jpg" /> Figura 1. Um esboço) de método para a preparação de culturas organotípicas de jangada de queratinócitos primários ou linhas celulares epiteliais. B) coloração de hematoxilina e eosina de culturas organotípicas de jangada gerados a partir de queratinócitos do prepúcio humano de forma estável mantendo HPV-31 (HFK-31) episomes, ou a partir normais queratinócitos do prepúcio humano (HFK). As camadas individuais epiteliais são identificados, bem como a ficha de colagénio. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig2.jpg" /> Figura 2. Citoqueratina 10 expressão (K10) é limitada às camadas suprabasais do epitélio. A imuno-histoquímica foi realizada em secções transversais de culturas organotípicas de jangada gerados a partir de HFK-31 células, bem como HFKs normais utilizando um anticorpo para K10. DNA celular foi contrastadas com DAPI. As imagens foram capturadas confmicroscopia de fluorescência Ocal. As setas indicam a camada basal do epitélio. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig3.jpg" /> Figura 3. A E1 HPV ^ proteína E4 é produzido no final da fase produtiva do ciclo de vida virai. A imuno-histoquímica foi realizada em secções transversais de culturas organotípicas de jangada gerados a partir de HFK-31 células, bem como HFKs normais utilizando anticorpos para E1E4. DNA celular foi contrastadas com DAPI. As imagens foram capturadas usando microscopia de fluorescência confocal. As setas indicam a camada basal do epitélio.

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</ol>

Não temos nada a divulgar.

Descrevemos aqui um método que pode ser usado para estudar a diferenciação epitelial em geral, mas também pode ser facilmente adaptado para estudar patogénese virai, bem como a eficácia da terapêutica potencial. Muitos vírus alvo células epiteliais, quer como o principal local de infecção, como no caso de HPV, ou em algum ponto do ciclo de vida do vírus, tal como com herpesvírus. Embora crescente culturas jangada organotípicas é demorado, a habilidade de recapitular fielmente na diferenciação epitelial vivo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Rato O colágeno tipo cauda 1 (4-5mg/ml) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> DMEM sem niveis de NaHC0 3 </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-061 </td></tr><tr><td> 3 niveis de NaHC0 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Calbiochem </td><td> 391338 </td></tr><tr><td> Grades metálicas de aço inoxidável </td><td> Williams e Mettle Co. </td><td> CR-03063-040-100-S </td></tr><tr><td> E média 11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fator de Crescimento Epidérmico </td><td> BD Biosciences </td><td> 354010 </td></tr></tbody></table>

geração de culturas raft organotípicas de queratinócitos humanos primários

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

O desenvolvimento de culturas organotípicas de jangada epiteliais forneceu investigadores com um eficiente sistema in vitro que fielmente diferenciação recapitula epitelial. Há muitos usos para esse sistema. Por exemplo, a capacidade de crescer tridimensionais culturas organotípicas de jangada de queratinócitos foi um passo importante no estudo do papilomavírus humano (HPV) 1. O ciclo de vida de HPV é rigidamente ligada à diferenciação de epitélio escamoso 2. Organotípicas culturas jangada epiteliais como demonstrado aqui reproduzir o ciclo de vida papilomavírus, incluindo a produção de vírus 3,4,5. Além disso, estas culturas jangada exibem lesões displásicas semelhantes aos observados após infecção in vivo com HPV. Assim, o presente sistema pode também ser usado para estudar cancros de células epiteliais, bem como o efeito de drogas na diferenciação de células epiteliais em geral. Originalmente desenvolvido pela Asselineau e Prunieras <sup&gt; 6 e modificado por Kopan et al. 7, o sistema de cultura organotípico epitelial jangada amadureceu em geral um modelo de cultura, relativamente fácil, o qual envolve o crescimento de células em colagénio liga mantida a uma interface ar-líquido (Figura 1A). Ao longo de 10-14 dias, as células estratificar e diferenciar, formando um epitélio espessura total que produz-diferenciação específicos citoqueratinas. Jangadas colhidas pode ser examinado histologicamente, bem como por técnicas padrão de moleculares e bioquímicos. Neste artigo, é descrito um método para a geração de culturas primárias de jangada de queratinócitos humanos. A mesma técnica pode ser usada com estabelecidas linhas de células epiteliais, e pode facilmente ser adaptado para uso com o tecido epitelial a partir de biópsias normais ou doentes 8. Muitos vírus alvo tanto o epitélio cutâneo ou da mucosa, como parte de seu ciclo de vida replicativo. Ao longo dos últimos anos, a viabilidade do uso culto jangada organotípicoUres como um método de estudo das interacções vírus-hospedeiro de células tem sido demonstrado para herpesvírus vários, bem como adenovírus, parvovírus, e poxvírus 9. Culturas organotípicas de jangada pode assim ser adaptado para examinar patogénese virai, e são os únicos meios para testar novos agentes antivirais para aqueles vírus que não são cultiváveis ​​em linhas de células permanentes.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Método para simular<em&gt; In vivo</em&gt; Diferenciação epitelial é descrito. Muitos vírus alvo células epiteliais, como parte do seu ciclo de vida do vírus, e este método proporciona um meio de análise de vírus: interacções hospedeiras que mais se assemelha a que ocorre<em&gt; In vivo</em&gt;. Esta técnica pode ser usada com queratinócitos primários, linhas celulares estabelecidas, bem como normais ou doentes de tecidos de biópsia.

Geração de Culturas Raft organotípicas de queratinócitos humanos primários

O desenvolvimento de culturas de balsas epiteliais organotípicas proporcionou aos pesquisadores um sistema in vitro eficiente que recapitula fielmente...

O objetivo geral deste procedimento é gerar culturas em lâmina organotípicas a partir de queratinócitos primários ou linhagens celulares epiteliais estabelecidas. Isso é realizado primeiramente pela confecção de tampões de colágeno com fibroblastos. Em seguida, as células epiteliais são sobrepostas aos tampões.Os êmbolos são então transferidos para as grades de balsa e mantidos em uma interface ar-líquido por 10 a 14 dias. Na etapa final, as balsas são colhidas. Por fim, as alterações na diferenciação epitelial podem ser avaliadas por meio de análise histológica ou imunohistoquímica. Este método pode fornecer informações sobre a diferenciação epitelial.Também pode ser aplicado a outros sistemas, como vírus que infectam o epitélio cutâneo ou mucoso como parte de seu ciclo de vida. O procedimento será demonstrado por Dan Anneker, um aluno de pós-graduação no meu laboratório. Primeiro, despeje ácido sulfúrico crômico em um béquer de vidro e imerja as grades de flutuador metálicas no ácido por uma hora.Em seguida, lave continuamente as grades durante a noite com água da torneira. Após a lavagem noturna, enxágue as grades por mais três a cinco horas em água bidestilada e deixe as grades da balsa secarem. Depois, dobre três lados da balsa, cerca de 0,5 centímetros, mantendo a mesma distância entre eles, e autocalefe as grades da balsa.Após preparar o gel de colágeno, adicione tripsina aos dois fibroblastos e, em seguida, neutralize a tripsina com o meio. Transfira os fibroblastos para um tubo cônico de 50 mililitros e conte as células para determinar o número de flutuadores que podem ser produzidos. Em seguida, após centrifugar as células por quatro minutos a 244 ×g em temperatura ambiente, aspire o meio do pellet de fibroblastos e re-suspenda as células em uma quantidade apropriada de tampão de reconstituição contendo DMEM e colágeno, de acordo com o número de flutuadores calculado.Adicione o colágeno por último para evitar que o gel se solidifique muito rapidamente. Após a adição do colágeno, misture a solução rapidamente, mas com cuidado, para evitar a introdução de bolhas no gel. Se a mistura do gel estiver muito amarelada, adicione algumas gotas de solução esterilizada por filtração.Um normal de hidróxido de sódio. Misture suavemente até o gel adquirir uma coloração alaranjada avermelhada, indicativa do pH correto. Em seguida, pipete três mililitros da mistura de colágeno com fibroblastos lentamente ao longo da parede de cada poço de uma placa de cultura de seis poços, evitando a formação de bolhas, e incube a placa por 30 minutos a 37 graus Celsius para permitir a solidificação do gel.Quando o gel estiver sólido, adicione três mililitros de meio E com EGF sobre o gel de colágeno solidificado e retorne a placa ao incubador. Após cultivar queratinócitos de baixo número de passagens até cerca de 70% de confluência, trypsinize os queratinócitos e, em seguida, neutralize a tripsina com eed. Com EGF, conte as células para determinar o número de enxertos que podem ser produzidos.Após centrifugar as células, ressuspenda o pellet em um mililitro de eed com EGF para cada cultura de "raft" calculada. Agora, remova o meio dos géis de colágeno inclinando a placa de seis poços sobre o lado, e então adicione dois mililitros de eed fresco com EGF a cada gel. Em seguida, adicione cuidadosamente um mililitro de queratinócitos ressuspendidos aos dois mililitros de eed já presentes em cada um dos poços.Pipete suavemente os queratinócitos juntamente com os dois mililitros de meio e deixe cair gota a gota sobre o tampão de colágeno. Coloque a placa no incubador a 37 graus Celsius por dois a quatro dias para permitir que as células cresçam até atingirem confluência. As células estão prontas quando o meio mudar para amarelo um dia após a troca do meio ou, no quarto dia, utilize pinças estéreis para posicionar uma grade estéril de metal, com os lados curvados voltados para baixo, em um recipiente de 10 centímetros de diâmetro.Aspire o meio de um gel de colágeno e, em seguida, deslize uma espátula estéril ao redor do perímetro do gel com movimentos para cima e para baixo para soltar o gel das laterais do poço. Mover o tampão de colágeno da placa de seis poços para a grade é a parte mais difícil deste procedimento. Tenha cuidado para deslizar suavemente a espátula sob o tampão sem dividi-lo e coloque-o plano sobre a grade sem criar bolhas de ar entre o tampão e a grade.Posteriormente, você pode usar uma espátula para alisar as partes que se dobraram para baixo durante este procedimento. Para remover o gel, incline ligeiramente a placa e coloque a espátula sob o gel, levantando-o. Coloque o gel de colágeno sobre a grade metálica sem formar bolhas entre a grade e o gel.Para criar uma interface ar-líquido, adicione cuidadosamente o EED sem EGF lentamente na parte inferior da placa, de modo que a grade de enxertos entre em contato com o meio, mas o gel de colágeno não. Finalmente, incube os enxertos a 37 graus Celsius. Mantendo a interface ar-líquido, colete os enxertos após 14 dias. Como visto nesta figura, enxertos feitos a partir de queratinócitos humanos primários imortalizados pelo HPV 31 ou Hfk, 30, são notavelmente mais espessos em comparação com enxertos feitos a partir de queratinócitos humanos normais da pele ou hks.Assim, as proteínas do HPV têm a capacidade de manter as células diferenciadas ativas no ciclo celular. Aqui, foi realizada uma análise imunohistoquímica em cortes transversais de culturas em lâmina tridimensionais geradas a partir de HK 30, bem como de HKS normais, utilizando um anticorpo contra citoceratina 10 ou K 10 em verde. A K 10 não foi expressa na camada basal indicada aqui pelas setas, sendo encontrada apenas nas camadas suprabasais, que consistem em células em progressiva diferenciação.Nesta figura, a expressão da proteína do HPV, E um, E quatro, uma proteína tardia que é restrita às camadas mais superficiais do epitélio e representada aqui em verde, é mostrada conforme esperado. Nenhuma marcação é observada em culturas em lâmina provenientes de hks normais, como na figura anterior.As setas indicam novamente a camada basal do epitélio após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia do câncer estudarem a patogênese dos papilomavírus humanos utilizando um sistema que imita a diferenciação epitelial in vivo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar culturas em lâmina tridimensionais a partir de queratinócitos primários ou linhagens celulares epiteliais estabelecidas.

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Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele de esferoide melanoma de organotypic 3D que recapitula os dois a arquitetura e complexidade multicelular de um órgão/tumor na vivo , mas ao mesmo tempo acomoda sistemática experimental intervenção.

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar eficientemente queratinócitos humanos primários de tecidos de pele de adultos. Este método simplifica o procedimento convencional usando o Y-27632 de inibidor ROCK no meio de inoculação espontaneamente separar células epidérmicas de células dérmicas.

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

Propomos um protocolo que mostra como diferenciar pluripotentes induzidas células-tronco derivadas de queratinócitos e fibroblastos e gerar uma pele 3D organoides, usando estes queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo contém uma etapa adicional de gerar um modelo de ratos humanizados. A técnica aqui apresentada vai melhorar pesquisa dermatológica.

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

Aqui descrevemos um protocolo para o cultivo sistemático de esferoides epidérmicos na cultura de suspensão 3D. Este protocolo possui amplas aplicações para uso em uma variedade de tipos de tecido epitelial e para a modelagem de várias doenças e condições humanas.

Estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito

Este protocolo descreve a cultura de queratinócitos recém-obtidos (passagem 0) para uso em imagens de células vivas.

Geração de culturas primárias para imagens de células vivas de queratinócitos

Aprenda a gerar culturas raft organotípicas de queratinócitos humanos primários para estudar diferenciação epitelial e interações vírus-hospedeiro. Este método reproduz condições in vivo em 10 a 14 dias.

Geração de Culturas Raft organotípicas de queratinócitos humanos primários

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