Dissecção e Cultura do mouse e dopaminérgico do estriado explantes em três dimensões Ensaios matriz de colágeno

O objetivo geral deste procedimento é cultivar dopaminérgicos e explantes de estriado para estudar o desenvolvimento das vias mesoestriatal e estriatonigral. Isso é realizado primeiramente mediante microdissecação do estriado e do mesencéfalo dopaminérgico de embriões de camundongo E 14,5. O segundo passo consiste em cortar explantes de tamanho apropriado a partir do tecido dissecado.

Em seguida, os explantes são posicionados dentro de um gel de colágeno em proximidade próxima uns dos outros. O passo final é cultivar esses explantes por um período de dois a três dias para permitir o crescimento axonal. Por fim, a imunohistoquímica para marcadores neuronais específicos é utilizada para demonstrar e quantificar respostas axonais atrativas ou repulsivas.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como culturas de explantes dissociados ou de dois DX, é que a matriz de colágeno fornece um substrato tridimensional para os éxons, simulando o ambiente extracelular. Além disso, a matriz de colágeno permite a formação de gradientes relativamente estáveis de proteínas liberadas por explantes X ou células colocadas nas proximidades. O procedimento será demonstrado por Ava Smith e Francesca, duas alunas de pós-graduação do meu laboratório.

Para iniciar este procedimento, dissecar os embriões de camundongo E 14,5 do útero da mãe. Mantê-los em meio L 15 sobre gelo até o momento do uso. Em seguida, transferir um embrião para o microscópio e isolar o cérebro do embrião.

Em seguida, remova o cefalão cortando ao longo da parte medial de cada vesícula cefálica. Depois disso, remova a bainha meníngea. Faça um corte dorsoventral logo à frente da flexão cefálica mesencefálica.

Posteriormente, faça outro corte dorsoventral logo ao lado do flexor cefálico médio. Em seguida, realize um corte longitudinal ao longo da linha média dorsal usando uma faca de microdissecção para expor o tecido subjacente do mesencéfalo ventral. Tenha cuidado para não atingir o tecido do mesencéfalo ventral, pois ele contém os neurônios dopaminérgicos.

Posteriormente, faça dois cortes longitudinais laterais e paralelos à linha média ventral para remover o tecido do mesencéfalo dorsal. Em seguida, divida o tecido restante do mesencéfalo ventral em X explantes usando uma lâmina de microdissecção na extremidade da lâmina. Mantenha os X explantes em meio L 15 contendo 5% de FBS sobre gelo até o uso.

Agora, transfira as vesículas telocéfalicas obtidas anteriormente durante a dissecação do mesencéfalo para o microscópio. Remova o tálamo cortando entre o tálamo e o satu usando uma pinça. Em seguida, faça um corte medial lateral rostral ao estriado para remover estruturas rostrais, como o bulbo olfatório.

Em seguida, repita este passo para o tecido localizado adjacente ao estriado. Depois disso, posicione a fatia restante de modo a obter uma visão coronal do estriado. O estriado pode ser reconhecido como uma parte ligeiramente mais transparente do tecido.

Em seguida, isole o estriado e corte-o em implantes utilizando uma faca de microdissecção. Evite o tecido ligeiramente mais escuro próximo à linha média, que contém neurônios migratórios da eminência ganglionar lateral e medial. Adicione uma gota de colágeno preparado a uma lamínula no poço de uma placa de quatro poços.

Mantenha-o no incubador a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. O colágeno será gelatinizado durante esta incubação. Após o colágeno ter gelatinizado, use uma pipeta com ponteira de 200 microlitros para transferir os explantes dopaminérgicos ou sal para o colágeno.

Em seguida, mova os explantes uns em direção aos outros, em proximidade próxima, utilizando uma agulha. Mantenha-os separados à distância aproximada do diâmetro de um x explante. A seguir, remova o excesso de meio.

Adicione 20 microlitros do colágeno preparado sobre o explante. Isso frequentemente faz com que os explantes se movimentem. Reposicione os explantes usando uma agulha.

Deixe o colágeno solidificar à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, transfira-o para o incubador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Após o colágeno ter endurecido, adicione 400 microlitros de meio explante e deixe crescer por dois a três dias no incubador a 37 graus Celsius.

Para fixar suavemente o explante, adicione paraformaldeído 4% e mantenha-os à temperatura ambiente por uma hora. Após uma hora, lave-os em PBS à temperatura ambiente três vezes, sendo cada lavagem de 15 minutos.

Em seguida, após remover o PBS, incubar em tampão bloqueador por duas horas. Depois disso, incubar durante a noite com anticorpo primário em tampão bloqueador a quatro graus Celsius no dia seguinte. Lavar com PBS cinco vezes à temperatura ambiente, cada vez por uma hora. Em seguida, incubar com anticorpo secundário conjugado à flora apropriada.

Quatro em tampão de bloqueio durante a noite a quatro graus Celsius. A partir deste passo, cubra os explantes com papel alumínio para minimizar sua exposição à luz. Lave-os durante a noite em PBS a quatro graus Celsius, seguido por várias lavagens no dia seguinte.

Em seguida, monte os explantes sobre a lâmina do microscópio utilizando meio de montagem com reagente antidesvanecimento prolongado, com a face do explante voltada para baixo. Coloque cuidadosamente uma lamínula sobre o meio de montagem, de forma muito suave, para evitar aprisionar bolhas de ar. Em seguida, obtenha imagens digitais dos x explantes utilizando um microscópio de fluorescência epiluminescente.

Usando essas imagens, divida cada explante X em quadrantes para gerar um quadrante proximal e um quadrante distal. Em seguida, meça o comprimento dos 20 neuritos mais longos que emergem do explante X, tanto nos quadrantes proximal quanto distal. Utilize o comprimento médio dos 20 neuritos mais longos para calcular a razão proximal-distal para cada explante individual.

Uma razão proximal-distal maior que um indica atração axonal. Enquanto uma razão menor que um indica repulsão axonal. É mostrado aqui um explante de mesencéfalo corado com anticorpo anti-hidroxilase de tirosina, revelando o crescimento axonal.

A linha pontilhada indica os explantes adjacentes. As setas aqui indicam neuritos individuais e cones de crescimento. Este é um exemplo da quantificação da razão proximal-distal.

Eles são divididos em quadrantes iguais. O quadrante proximal está voltado para os explantes X adjacentes, enquanto o quadrante distal está voltado para longe deles. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o co-cultivo de explantes dopaminérgicos e estriatais para investigar o desenvolvimento da via nigroestriatal e estudar os mecanismos moleculares envolvidos na formação dessas vias.