Name: Dissecção e Cultura do mouse e dopaminérgico do estriado explantes em três dimensões Ensaios matriz de colágeno (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprenda a cultivar explantes dopaminérgicos e estriatais de embriões de camundongo E14,5 em matriz de colágeno tridimensional. Este método permite estudar o desenvolvimento das vias mesoestriatal e estriatonigral e quantificar respostas axonais através de imunohistoquímica.

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O ensaio de matriz de colágeno foi desenvolvido e aperfeiçoado pelo trabalho de muitos diferentes grupos de pesquisa durante os últimos dois a três décadas. As abordagens descritas aqui para explantes e dopaminérgicos estriatais se beneficiar imensamente com esses estudos. Além disso, os autores gostariam de agradecer Asheeta Prasad por sua ajuda na criação de culturas de explante estriado. O trabalho no laboratório foi financiada pela Organização Human Programa de fronteira da Ciência (Prêmio de Desenvolvimento de Carreira), a Organização Neerlandesa de Pesquisa em Saúde e Desenvolvimento (ZonMW-VIDI e ZonMW-TOP), a União Europanian (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222999) (a RJP), e da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (TopTalent; para ERES).

1. Preparação de Colágeno da cauda de rato <ol><li> Collect 6-10 caudas de ratos adultos (é possível armazenar as caudas a -20 ° C até à sua utilização). </li><li> Embeber as caudas em etanol a 95% durante a noite à temperatura ambiente (RT). </li></ol> Dissecção de caudas de rato (em capuz de cultura de tecido): (Manter as ferramentas em etanol a 70% quando não usá-los e se certificar de que todas as soluções, ferramentas e utensílios de vidro usados ​​em todo este procedimento são estéreis) <ol start="3"><li> Para a coleta de tendões da cauda, ​​corte a ponta da cauda. Mantenha extremidade grande da cauda com um par de pinças. Use um par de pinças para segurar, dobrar e quebrar o rabo perto de pinça outros. Separar e os tendões será deixado para trás (Figura 1A, B). </li><li> Colete os tendões em estéril H 2 O e depois de coletar todos os tendões movê-los para um novo com petridish estéril H 2 O. </li><li> Tome 2-3 tendões e retalhar-los usando 2 pares de paraceps em uma nova petridish com estéril H 2 O. Remover não-tecido do tendão, como veias (tecido do tendão é brilhante e reflexiva; Figura 1C). Após a remoção de todo o tecido não-tendão, cada cauda produz aproximadamente 100-150 mg de tendões. </li><li> Transfira os tendões a 300 ml de ácido acético a 3% estéril e agita-se lentamente durante a noite a 4 ° C. </li><li> Adicionar uma de 200 ml adicionais de ácido 3% estéril acético e agita-se lentamente durante a noite a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a uma solução de ácido acético contendo os tendões a ~ xg 2700 durante 120 min a 4 ° C a pelota não dissolvidas tendões e não-tecidos do tendão. </li><li> Durante a centrifugação preparar tubo de diálise: <ul><li> cortar pedaços de 40 cm </li><li> ferver em 500 mM de EDTA durante 5 min </li><li> legal em estéril H 2 O </li></ul></li><li> Amarrá um nó em uma extremidade do tubo de diálise e encher o tubo com o sobrenadante da solução tendão centrifugada em gelo no capuz de cultura de tecido usando um pipetar automáticoE e uma pipeta 25 ml. Evitar a produção de bolhas. Nó a outra extremidade do tubo eo tubo loja em folha de alumínio estéril em gelo até que todos os pedaços de tubo são preenchidos (Figura 1D). </li><li> Preparar 10 litros de estéril 0,1 X MEM, pH 4,0, no capuz de cultura de tecidos. Adicionar flutuador para peças de tubagem e adicioná-los à solução pré-arrefecida MEM 0,1 X num copo de 10 l. Dializar durante a noite a 4 ° C enquanto lentamente sob agitação. Este diálise remove o excesso de ácido, mantendo o pH baixo. </li><li> Substitua por uma nova pré-arrefecido 10 l 0,1 X MEM e agitar a noite a 4 ° C. </li><li> Repetir o passo anterior, substituindo com o novo pré-arrefecida de 10 l 0,1 X MEM e agita-se durante a noite a 4 ° C. </li><li> Solução alíquota de colagénio em tubos de 50 ml estéreis. Loja alíquotas a 4 ° C. Mantenha 6-12 meses, apenas lidar com o estoque de colágeno na capa cultura de tecidos. </li><li> É importante para testar se o colagénio purificado precisa de ser diluído (em 0,1 x MEM) para se obter resultados óptimos na MATR colagénioensaio ix. Portanto, gerar uma série de diluições de colagénio (colagénio não diluído, 1:1, 1:2 e 1:5 diluído) e realizar ensaios de matriz de colagénio, tal como descrito abaixo para determinar a diluição de colagénio óptima. </li></ol> 2. Dissecção do mesencéfalo dopaminérgico 7,8 <ol><li> Dissecar E14.5 embriões de camundongos do útero da mãe e se manter em meio L15 no gelo até ser necessário. </li></ol> Todos os passos de dissecção subsequentes são realizados em meio L15 em gelo. <ol start="2"><li> Dissecar o cérebro. </li><li> Retire o telencéfalo cortando ao longo da parte medial de cada vesícula telencefálico (use as vesículas telencefálicos para explantes estriado). </li><li> Remover a bainha das meninges. </li><li> Faça um corte dorsoventral apenas rostral da flexura mesencefálica. </li><li> Faça outro corte dorsoventral apenas caudal da flexura mesencefálica. </li><li> Fazer um corte rostrocaudal ao longo da linha média dorsal usando um microdissection faca para expor o tecido do mesencéfalo ventral subjacente. Tenha cuidado para não bater o tecido mesencéfalo ventral, já que contém os neurônios dopaminérgicos (Figura 2). </li><li> Fazer dois cortes rostrocaudal lateral e paralelamente à linha média ventral para remover o tecido do mesencéfalo dorsal. </li><li> Divida o tecido mesencéfalo ventral restante em explantes usando uma faca microdissecção. </li><li> Armazenar os explantes em L15 meio contendo FBS a 5% em gelo até à utilização. </li></ol> 3. Dissecção do estriado Todos os passos são realizados em dissecação L15 médio em gelo. <ol><li> Use vesículas telencefálicos dissecados durante o esvaziamento do mesencéfalo. </li><li> Remover o tálamo cortando entre o tálamo e corpo estriado utilizando fórceps. </li><li> Faça um corte médio-lateral rostral para o estriado para remover estruturas rostrais como o bulbo olfativo. Repetir este passo para o tecido localizado caudalmente ao corpo estriado. </li><li> Posiçãoa fatia remanescente para se obter uma vista coronal do estriado (Figura 2). </li><li> O corpo estriado pode ser reconhecida como uma parte ligeiramente menos densa (mais transparente) de tecido. Dissecar para fora do corpo estriado e corte em explantes utilizando uma faca microdissecação. Evite o tecido um pouco mais escura perto da linha média, que contém neurônios que migram da eminência lateral e medial ganglionar. </li><li> Armazenar os explantes em L15 meio contendo FBS a 5% em gelo até à utilização. </li></ol> 4. Assembléia de colágeno Ensaios Matrix Preparação do colágeno (todos os passos sobre o gelo, use a ponteira resfriada) <ol><li> Misturar 860 uL de colagénio diluída com 100 ul de MEM de 10x e 40 ul de bicarbonato de sódio 1M (NaHCO3) e manter em gelo. Se neste momento o colágeno aquece vai solidificar. </li><li> Adicionar uma gota de 20 ul (cerca de 5 mm de diâmetro) de colagénio preparada para uma lamela em um poço de um prato 4-bem Nunce deixar repousar num incubador de CO2 a 37 ° C e 5% de CO2 durante 30 min (ambiente concentração de O 2 é suficiente). Durante esta incubação o colagénio será gelatinizar. </li></ol> Instalação de co-cultura em gel de colágeno <ol start="3"><li> Após o colagénio tem gelatinizado, utilizar uma pipeta com uma ponta 200 uL de transferir um explante dopaminérgico ou estriado para o colagénio. </li><li> Mover os explantes em estreita proximidade entre si, utilizando uma agulha. Afastá-los a uma distância de aproximadamente o diâmetro de um explante (~ de 200-300 uM) (Figura 2). </li><li> Remover o excesso de médio e adicionar 20 uL de colagénio preparada em cima dos explantes. Isso muitas vezes fazer com que os explantes para se mover. Reposicionar os explantes utilizando uma agulha, tal como descrito em 4.4. </li><li> Deixe a colagénio solidificar durante 15 min a RT seguido por 30 min a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Depois que o colágeno tem definido, adicionar 400 ul de emédio xplant e crescer durante 2-3 dias num incubador de CO2 a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 5. Análise por imuno-histoquímica e Quantificação Imunohistoquímica <ol><li> Para corrigir explantes, suavemente adicionar 400 uL de paraformaldeído 8% (PFA) em PBS a 400 uL de meio (diluindo o PFA a 4%) e deixar repousar durante 1 hora à RT. </li><li> Lavar 15 min 3x em PBS à temperatura ambiente. </li><li> Incubar em tampão de bloqueio (BB; PBS + 1% de FBS + Triton 0,1% X-100) durante 2 horas. </li><li> Incubar durante uma noite com o anticorpo primário em APA a 4 ° C. Para axônios dopaminérgicos usar anti-tirosina hidroxilase anticorpos (1:1000) 7, para os axônios estriatais anti-DARPP32 anticorpos (1:500) e 9 para visualizar todos os axônios anti-βIII tubulina (1:3000) 7. </li><li> Lavar horas uma 5x em PBS à temperatura ambiente. </li><li> Incubar com anticorpo secundário conjugado com o fluoróforo adequado (1:500) em APA durante a noite a 4° C. A partir deste passo em minimizar a exposição dos explantes à luz (por exemplo, os cobrir com folha de alumínio). </li><li> Lavar durante a noite em PBS a 4 ° C, seguida por várias lavagens durante o dia seguinte. </li><li> Monte explantes em microscópio lâminas usando Prolongar reagente Antifade meio de montagem. Adicionar uma gota de ~ 10 ul numa lâmina de microscópio de vidro. Pegue a lamela e gentilmente coloque-o sobre a queda de meio de montagem com o lado explante voltado para baixo. Evite prender o ar sob a lamela de por muito suavemente baixá-lo sobre a queda de meio de montagem. </li></ol> Quantificação por meio do cálculo P / D rácio <ol start="9"><li> Aquisição de imagens digitais dos explantes utilizando um microscópio de epifluorescência (Figura 3). </li><li> Usando essas imagens, dividir cada explante em quadrantes para gerar um quadrante proximal (isto é, parte do explante mais próximo do explante adjacente) e um quadrante distai (parte do explante mais distante da explicação adjacentent) (Figura 2, 4). </li><li> Medir o comprimento de 20 mais longos neurites que emergem do explante tanto nos quadrantes proximais e distais. </li><li> Use o comprimento médio das neurites mais longas 20 para calcular a relação P / D para cada explante individual. AP / D relação&gt; 1 indica atração axônio, enquanto uma proporção &lt;1 indica repulsão axônio. </li><li> Em alguns casos, o crescimento de neurites densa impede a avaliação da duração de neurites individual. Nestas situações, a quantificação pode ser realizada através da medição da distância entre a borda do explante e da frente principal do crescimento axonal nos quadrantes proximais e distais. </li></ol> 6. Imagens representativas Após cultura de sucesso de explantes dopaminérgicos e estriatal um grande número de axónios são visíveis por microscopia de campo brilhante ou como visualizado por anti-tubulina βIII imunocitoquímica (não mostrado). Um subconjunto destes axónios será dopaminérgico ou s<html> axónios triatal como imunocitoquímica utilizando visualizada (Figura 3). Dividindo os explantes em quadrantes, tal como descrito e determinando P / D rácios, um efeito axónio putativo atraente ou repulsivo pode ser quantificada (Figura 3E). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig1.jpg" /> Figura 1. Fotos ilustram a preparação de colagénio a partir de tendões da cauda de rato. A) separando a cauda de rato expõe os tendões. B) Os tendões são visíveis como corda-como feixes. C) Os tendões são fáceis de distinguir de veias por sua aparência brilhante branco. D) Depois de se dissolver os tendões em ácido acético, a solução é transferida para tubo de diálise. Para manter a frio colagénio dissolvido, os tubos são colocados em folha de alumínio estéril em gelo. e 2 &quot;src =&quot; files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg / &quot;/&gt; Figura 2. Esquemático indicando as diferentes etapas do processo. Regiões do cérebro adequadas são dissecados e cortados para gerar explantes. Um único e mesencéfalo explante estriatal estão posicionados na proximidade de uma matriz de colagénio e deixada crescer durante 48-72 horas a 37 ° C. Axónios são visualizados por imuno-histoquímica de fluorescência e uma relação de P / D é calculado para quantificar as respostas quimiotrópicos. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig3.jpg" /> Figura 3. Os resultados representativos que mostram o crescimento axonal em uma cultura matriz de colagénio. A) explante Midbrain corados com anticorpo anti-tirosina hidroxilase revelando o crescimento axonal. A linha pontilhada indica explante adjacente. B) ampliação de um neurites mostram individuais e cones de crescimento (setas). C) explante estriatal corados com anti-DARPP32. D) Ampliação de C mostrando neurites individuais. Exemplo E) doP / D quantificação proporção. Explantes são divididos em quadrantes iguais. O quadrante proximal está voltada para o explante adjacente enquanto o quadrante distai está virada para fora dele. Barras de escala indicam 100 mm.

<ol><li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+connected+in+the+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li>
<li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li>
<li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li>
<li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li>
<li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li>
<li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li>
<li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation%2C+channeling%2C+rostral+growth%2C+and+intracortical+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li>
<li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li>
<li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li>
<li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

O ensaio de matriz de colagénio aqui descrita foi usada e melhorado por muitos laboratórios diferentes nas últimas décadas para investigar uma variedade de moléculas de direccionamento axonal e sistemas neuronais (por exemplo, ver as referências 5-8). Estes estudos demonstraram que este ensaio é uma ferramenta poderosa para estudar os efeitos de regulação e de moléculas de direccionamento axonal secretadas por diferentes tecidos (Intermediário) alvo. No entanto, deve notar-se que a matriz de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Soro fetal de vitelo </td><td> BioWhittaker </td><td> 14-801F </td><td></td></tr><tr><td> Glutamina (200mm) </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> VWR International </td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Merck </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Mínimo de mídia Essenciais (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> L-15 de Leibovitz Médio </td><td> Gibco </td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar Reagente Antifade Ouro </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo de diálise </td><td> Espectro Labs </td><td> 132660 </td><td></td></tr><tr><td> Hidroxilase anti-tirosina Coelho </td><td> Pel-Freez </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td> De coelho anti-Darpp32 (H-62) </td><td> Santa-Cruz </td><td> Sc-11365 </td><td></td></tr><tr><td> Rato tubulina anti-βIII </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor rotulado anticorpos secundários </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissecção e cultura do mouse e dopaminérgico do estriado explantes em três dimensões ensaios matriz de colágeno

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Mesencéfalo a dopamina (mdDA) projeto neurônios através do feixe medial do prosencéfalo para diversas áreas do telencéfalo, incluindo o 1 striatum. Reciprocamente, médio neurónios espinais no estriado que dão origem à via (directo) Estriatonigral inervam a substantia nigra 2. O desenvolvimento desses setores axônio é dependente das ações combinatória de uma infinidade de crescimento do axônio e pistas de orientação, incluindo as moléculas que são liberadas por neurites ou por regiões (Intermediário)-alvo 3,4. Estes factores solúveis podem ser estudada in vitro por mdDA cultura e / ou explantes do estriado em uma matriz de colagénio que proporciona um substrato tridimensional para os axónios que imitam o ambiente extracelular. Além disso, a matriz de colagénio permite a formação de gradientes relativamente estáveis ​​de proteínas libertadas por explantes outros ou células colocadas na proximidade (por exemplo, ver as referências 5 e 6). Aqui descrevemos métodos para os finsificação de colágeno da cauda de rato, microdissecção de explantes e dopaminérgicos no estriado, a sua cultura em géis de colágeno e análise imuno-histoquímica e quantitativa posterior. Primeiro, o cérebro de embriões de camundongos E14.5 são isoladas e dopaminérgicos estriatais e explantes são microdissectados. Estes explantes são, em seguida, (co) cultivados em géis de colagénio em lamelas durante 48 a 72 horas in vitro. Posteriormente, as projeções axonais são visualizados por meio de marcadores neuronais (eg tirosina hidroxilase, DARPP32, ou tubulina βIII) e crescimento do axônio e respostas axônio atrativas ou repulsivas são quantificados. Esta preparação neuronal é uma ferramenta útil para estudos in vitro dos mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio mesostriatal e estriatal e orientação durante o desenvolvimento. Utilizando este ensaio, também é possível avaliar outros (Intermediário) alvos para axônios dopaminérgicos e estriado ou para testar específicos pistas moleculares.

Explantes a partir do sistema de dopamina mesencéfalo e corpo estriado são utilizados num ensaio de matriz de colagénio para o<em&gt; In vitro</em&gt; Análise do desenvolvimento via mesostriatal e estriatal. Neste ensaio crescimento axonal e orientação podem ser manipulados e quantificado. Ele também pode ser modificado para avaliar outras regiões ou pistas moleculares.

Dissecção e Cultura do mouse e dopaminérgico do estriado explantes em três dimensões Ensaios matriz de colágeno

Os neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo (mdDA) projetam-se, através do feixe prosencefálico medial, para diversas áreas do telencéfalo, incluindo o estriado1. ...

O objetivo geral deste procedimento é cultivar dopaminérgicos e explantes de estriado para estudar o desenvolvimento das vias mesoestriatal e estriatonigral. Isso é realizado primeiramente mediante microdissecação do estriado e do mesencéfalo dopaminérgico de embriões de camundongo E 14,5. O segundo passo consiste em cortar explantes de tamanho apropriado a partir do tecido dissecado.Em seguida, os explantes são posicionados dentro de um gel de colágeno em proximidade próxima uns dos outros. O passo final é cultivar esses explantes por um período de dois a três dias para permitir o crescimento axonal. Por fim, a imunohistoquímica para marcadores neuronais específicos é utilizada para demonstrar e quantificar respostas axonais atrativas ou repulsivas.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como culturas de explantes dissociados ou de dois DX, é que a matriz de colágeno fornece um substrato tridimensional para os éxons, simulando o ambiente extracelular. Além disso, a matriz de colágeno permite a formação de gradientes relativamente estáveis de proteínas liberadas por explantes X ou células colocadas nas proximidades. O procedimento será demonstrado por Ava Smith e Francesca, duas alunas de pós-graduação do meu laboratório.Para iniciar este procedimento, dissecar os embriões de camundongo E 14,5 do útero da mãe. Mantê-los em meio L 15 sobre gelo até o momento do uso. Em seguida, transferir um embrião para o microscópio e isolar o cérebro do embrião.Em seguida, remova o cefalão cortando ao longo da parte medial de cada vesícula cefálica. Depois disso, remova a bainha meníngea. Faça um corte dorsoventral logo à frente da flexão cefálica mesencefálica.Posteriormente, faça outro corte dorsoventral logo ao lado do flexor cefálico médio. Em seguida, realize um corte longitudinal ao longo da linha média dorsal usando uma faca de microdissecção para expor o tecido subjacente do mesencéfalo ventral. Tenha cuidado para não atingir o tecido do mesencéfalo ventral, pois ele contém os neurônios dopaminérgicos.Posteriormente, faça dois cortes longitudinais laterais e paralelos à linha média ventral para remover o tecido do mesencéfalo dorsal. Em seguida, divida o tecido restante do mesencéfalo ventral em X explantes usando uma lâmina de microdissecção na extremidade da lâmina. Mantenha os X explantes em meio L 15 contendo 5% de FBS sobre gelo até o uso.Agora, transfira as vesículas telocéfalicas obtidas anteriormente durante a dissecação do mesencéfalo para o microscópio. Remova o tálamo cortando entre o tálamo e o satu usando uma pinça. Em seguida, faça um corte medial lateral rostral ao estriado para remover estruturas rostrais, como o bulbo olfatório.Em seguida, repita este passo para o tecido localizado adjacente ao estriado. Depois disso, posicione a fatia restante de modo a obter uma visão coronal do estriado. O estriado pode ser reconhecido como uma parte ligeiramente mais transparente do tecido.Em seguida, isole o estriado e corte-o em implantes utilizando uma faca de microdissecção. Evite o tecido ligeiramente mais escuro próximo à linha média, que contém neurônios migratórios da eminência ganglionar lateral e medial. Adicione uma gota de colágeno preparado a uma lamínula no poço de uma placa de quatro poços.Mantenha-o no incubador a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. O colágeno será gelatinizado durante esta incubação. Após o colágeno ter gelatinizado, use uma pipeta com ponteira de 200 microlitros para transferir os explantes dopaminérgicos ou sal para o colágeno.Em seguida, mova os explantes uns em direção aos outros, em proximidade próxima, utilizando uma agulha. Mantenha-os separados à distância aproximada do diâmetro de um x explante. A seguir, remova o excesso de meio.Adicione 20 microlitros do colágeno preparado sobre o explante. Isso frequentemente faz com que os explantes se movimentem. Reposicione os explantes usando uma agulha.Deixe o colágeno solidificar à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, transfira-o para o incubador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Após o colágeno ter endurecido, adicione 400 microlitros de meio explante e deixe crescer por dois a três dias no incubador a 37 graus Celsius.Para fixar suavemente o explante, adicione paraformaldeído 4% e mantenha-os à temperatura ambiente por uma hora. Após uma hora, lave-os em PBS à temperatura ambiente três vezes, sendo cada lavagem de 15 minutos.Em seguida, após remover o PBS, incubar em tampão bloqueador por duas horas. Depois disso, incubar durante a noite com anticorpo primário em tampão bloqueador a quatro graus Celsius no dia seguinte. Lavar com PBS cinco vezes à temperatura ambiente, cada vez por uma hora. Em seguida, incubar com anticorpo secundário conjugado à flora apropriada.Quatro em tampão de bloqueio durante a noite a quatro graus Celsius. A partir deste passo, cubra os explantes com papel alumínio para minimizar sua exposição à luz. Lave-os durante a noite em PBS a quatro graus Celsius, seguido por várias lavagens no dia seguinte.Em seguida, monte os explantes sobre a lâmina do microscópio utilizando meio de montagem com reagente antidesvanecimento prolongado, com a face do explante voltada para baixo. Coloque cuidadosamente uma lamínula sobre o meio de montagem, de forma muito suave, para evitar aprisionar bolhas de ar. Em seguida, obtenha imagens digitais dos x explantes utilizando um microscópio de fluorescência epiluminescente.Usando essas imagens, divida cada explante X em quadrantes para gerar um quadrante proximal e um quadrante distal. Em seguida, meça o comprimento dos 20 neuritos mais longos que emergem do explante X, tanto nos quadrantes proximal quanto distal. Utilize o comprimento médio dos 20 neuritos mais longos para calcular a razão proximal-distal para cada explante individual.Uma razão proximal-distal maior que um indica atração axonal. Enquanto uma razão menor que um indica repulsão axonal. É mostrado aqui um explante de mesencéfalo corado com anticorpo anti-hidroxilase de tirosina, revelando o crescimento axonal.A linha pontilhada indica os explantes adjacentes. As setas aqui indicam neuritos individuais e cones de crescimento. Este é um exemplo da quantificação da razão proximal-distal.Eles são divididos em quadrantes iguais. O quadrante proximal está voltado para os explantes X adjacentes, enquanto o quadrante distal está voltado para longe deles. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o co-cultivo de explantes dopaminérgicos e estriatais para investigar o desenvolvimento da via nigroestriatal e estudar os mecanismos moleculares envolvidos na formação dessas vias.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este ensaio avalia a capacidade de uma molécula de sinalização, aqui proteína morfogenética óssea 7 (BMP7), para reorientar axônios comissurais. Um explante da medula espinhal dorsal embrionárias cultivadas é adjacente a um agregado de células secretoras de COS os fatores de crescimento candidato. Reorientou axônios comissurais crescendo dentro do explante são visualizados através da imuno-histoquímica.

Doseamento do Capacidade de difusíveis moléculas sinalizadoras para Reorientar embrionárias Spinal Axônios comissural

Demonstramos como dissecar e cultura pinto gânglio statoacoustic E4 e E6 explantes medula espinhal. Explantes são cultivados sob condições sem soro em gel de colágeno 3D por 24 horas. Neuritos resposta é testado com o meio do fator de crescimento suplementado com proteína e revestido contas.

Dissecção e Cultura do Gânglio pintainho Statoacoustic e Explantes da Medula Espinhal em géis de colágeno para Ensaios crescimento de neuritos

Este vídeo descreve um método para cultivar neurônios dopaminérgicos a partir de tecido cerebral embrionário de camundongo. O processo inclui o tratamento do mesencéfalo com uma enzima proteolítica, destacando as células e cultivando-as em lamínulas revestidas de polímero em um meio rico em nutrientes com antibióticos para seu crescimento e viabilidade a longo prazo.

Cultura e manutenção de neurônios dopaminérgicos do tecido cerebral embrionário de camundongos

O vídeo demonstra o processo de isolamento e cultura de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo de embriões de camundongos. Os assoalhos do mesencéfalo ventral isolados são dissociados usando enzimas. Os neurônios dopaminérgicos resultantes são colhidos e transferidos para micro-ilhas dentro de placas de vários poços. As células são incubadas com um meio de neurônio dopaminérgico para manter as células em alta densidade dentro das micro-ilhas.

Isolamento e cultura de neurônios dopaminérgicos embrionários primários do mesencéfalo de camundongos

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a produção simultânea de culturas de células precursoras neurais, quer como monocamadas aderentes ou neuroesferas, a partir da zona subventricular e giro dentado de ratinhos adultos individuais.

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

Os neurônios dopaminérgicos desempenham um papel regulador vital no cérebro. Sua perda está associada à doença de Parkinson. Neste vídeo, mostramos como gerar culturas primárias de neurônios dopaminérgicos centrais a partir de mesencéfalo embrionário de camundongo. Tais culturas são úteis para estudar a extrema vulnerabilidade desses neurônios a vários estresses.

Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

A percepção das ações complexas do cérebro requer ferramentas avançadas de pesquisa. Aqui, demonstramos um novo modelo de engenharia 3D baseado em colágeno de seda de tecido neural semelhante à arquitetura do cérebro. O modelo pode ser usado para estudar a montagem da rede neuronal, orientação axonal, interações célula-célula e atividade elétrica.

Baseada em Silk-colágeno Engineered 3D Model of Tissue polarizada Neural

Na doença de Parkinson (PD), substância negra (SNC) neurónios dopaminérgicos degenerar, conduzindo a disfunção motora. Aqui nós relatamos um protocolo para a cultura de neurônios do mesencéfalo ventral de um ratinho expressando eGFP impulsionado por uma sequência de promotor de tirosina hidroxilase (TH), a colheita neurônios fluorescentes individuais das culturas, e medir o seu transcriptoma usando RNA-seq.

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

Neste relatório, destacam-se as vantagens de organotypic culturas e culturas primárias dissociadas dos gânglios das raízes de dorsais do mouse-derivado para investigar uma ampla gama de mecanismos associados a interação neurônio-glia, neuroplasticidade, neuroinflammation e resposta à infecção viral.

Rato adulto DRG explantes e dissociado de modelos de célula para investigar neuroplasticidade e respostas aos insultos ambientais incluindo infecção Viral

Aqui, apresentamos um protocolo para obter sistemas 3D-cultura na auto montagem de andaimes de peptídeo para promover a diferenciação de condrócitos articulares humanas condrossarcoma em tecido de cartilagem, como.

Cultivo de células de mamíferos em andaimes tridimensionais do Peptide

Aqui, fornecemos um método para analisar o comportamento dos axônios crescentes em matrizes 3D, imitando seu desenvolvimento natural.

Geração de hidrogéis com base em colágeno 3-D para analisar o crescimento e o comportamento axonal durante o desenvolvimento do sistema nervoso

Aprenda a cultivar explantes dopaminérgicos e estriatais de embriões de camundongo E14,5 em matriz de colágeno tridimensional. Este método permite estudar o desenvolvimento das vias mesoestriatal e estriatonigral e quantificar respostas axonais através de imunohistoquímica.

Dissecção e Cultura do mouse e dopaminérgico do estriado explantes em três dimensões Ensaios matriz de colágeno

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