Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e Em Vivo Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

O objetivo deste procedimento é estudar os padrões de tráfego e acúmulo de células T durante a doença do enxerto contra o hospedeiro. Isso é feito isolando primeiro a medula óssea e os citos de camundongos doadores. O segundo passo é purificar as populações de células de interesse e prepará-las para o transplante.

Em seguida, as populações de células purificadas são combinadas e transplantadas para camundongos receptores irradiados. A etapa final é visualizar os padrões de tráfego e acúmulo de células T em camundongos receptores. Em última análise, a imagem bioluminescente é usada para mostrar os padrões de tráfego e acúmulo de células T durante a DECH.

A principal vantagem da imagem bioluminescente sobre as tecnologias existentes é que ela permite um meio de detectar linfócitos em todo o camundongo, em oposição a um local específico, como acontece com as tecnologias existentes. Os camundongos devem ser tratados com irradiação letal antes do transplante de medula óssea e cita. Colocar até 10 ratinhos recetores numa gaiola micro-isoladora compatível com o irradiador a utilizar.

Em seguida, irradie os camundongos com uma fonte de césio 1 37 ou um RS 2000, um radiador com uma dose inicial de 4,5 graus centígrados. Três horas depois, irradie os camundongos novamente com 4,5 graus centígrados para um total de nove graus centígrados de radiação. Após a segunda dose, conservar os ratinhos recetores numa gaiola micro-isoladora com água acidificada com um pH de três até ao momento do transplante.

A água acidificada ajudará a controlar as afecções oportunistas nos receptores para obter citos de EPL. Corte a pele de um camundongo doador sacrificado fazendo uma incisão vertical de dois centímetros cerca de dois centímetros à direita da linha média diretamente sob a caixa torácica para localizar o baço. Em seguida, remova o baço e coloque-o em uma malha de 40 microlitros verde em uma placa de Petri contendo 1640 RPMI com 5% de FBS.

Para preparar suspensões unicelulares, use um êmbolo de seringa para quebrar o baço até que todo o baço tenha passado pela tela de malha. Repita esse processo para cada tipo selvagem e camundongo doador positivo de luxo. Colete todas as suspensões de célula única do tipo selvagem em um tubo cônico de 50 mililitros e colete todas as suspensões de célula única positivas de luxo em um tubo cônico separado de 50 mililitros.

Uma vez que as suspensões tenham sido coletadas em seus respectivos tubos, centrifugue as células e resp. Suspenda os pellets em 1640 RPMI com 5%FBS. Em seguida, conte as células.

Remova a pele de um membro posterior de um camundongo doador e corte cuidadosamente o máximo de tecido muscular possível do fêmur e da fíbula da tíbia usando uma tesoura resistente. Corte o fêmur na articulação do quadril para remover o membro posterior. Em seguida, corte o poro traseiro logo abaixo da inserção da fíbula da tíbia.

Remova cuidadosamente qualquer tecido muscular restante e corte a fíbula. Há pouca medula na fíbula para que possa ser descartada. Em seguida, coloque o membro posterior em 1640 RPMI frio com solução de 5% de FBS e repita o processo para o segundo membro posterior.

Armazene os membros posteriores em meios até que todos os membros posteriores sejam removidos. Cada camundongo deve render entre 20 vezes 10 para seis a 40 vezes 10 para as seis células da medula óssea. Para se preparar para a remoção da medula óssea, pegue um membro posterior do meio frio R-P-M-I-F-B-S e coloque-o em uma grande placa de Petri contendo um mililitro de meio frio.

Corte as articulações do joelho de cada membro posterior. Em seguida, conecte uma agulha subcutânea de calibre 27 a 29 a uma seringa de 10 mililitros e coloque a agulha na tíbia. Pressione a seringa até que todo o material vermelho seja removido do interior da tíbia.

Repita este processo com o fêmur. Descarte todos os ossos restantes que são desprovidos de medula óssea. Repita este processo com o segundo membro posterior.

Pipetar o meio contendo medula óssea para uma placa de Petri grande. Para preparar as suspensões unicelulares usando uma seringa, êmbolo e tela de malha de 40 microlitros, separe a medula até que ela passe completamente pela tela. Em seguida, pipetar a suspensão de célula única para um tubo cônico de 50 mililitros e colocar este tubo em gelo esgotar três células positivas da medula óssea seguindo o protocolo do fabricante.

Uma vez que a medula é esgotada de CD, três células positivas lavam as células restantes centrifugando os citos SP e as células da medula óssea não combinam citos e células da medula óssea. Conte as células usando um hemocitômetro. Em seguida, remova todo o Reese supinado.

Suspenda as células da medula óssea em 100 microlitros de tampão máximo por 10 milhões de células da medula óssea. Continue com o esgotamento do CD três usando o protocolo do fabricante. Em seguida, lave o CD três células da medula óssea esgotadas três vezes em PBS estéril.

Contar as células e ressuspendê-las como um volume adequado para injetar 10 nas sete células. Resus suspende o pellet do tipo selvagem em 90 microlitros de tampão máximo por 10 para as sete células. Continue com a depleção de células T CD oito.

De acordo com o protocolo do fabricante, ressuspenda o pellet positivo de luxo em 40 microlitros de tampão máximo por 10 para as sete células. Continue com a purificação de células T CD oito. De acordo com o protocolo do fabricante, conte cada população de células e lave cada população três vezes com um mililitro de PBS estéril, ressuspenda cada população em um volume apropriado para injetar 18 vezes 10 para os seis cd, oito cistos PLE de tipo selvagem empobrecidos e duas vezes 10 para os seis L dois G 85 B seis células T CD purificadas oito para preparar para a injeção.

Primeiro, combine 10 dos sete CD três células da medula óssea empobrecidas 18 vezes 10 para os seis, enquanto o tipo CD oito esgotou os citos e duas vezes 10 para os seis L dois G 85 B seis lux positivo CD purificado oito células T em um tubo de micro centrífuga. Em seguida, lave as células combinadas com PBS estéril e Resus. Suspenda-os em 300 microlitros de PBS estéril.

Em seguida, usando uma agulha de calibre 28, injete a preparação celular na veia da cauda de um camundongo receptor. Armazenar os ratinhos recetores injetados numa gaiola micro-isoladora com água acidificada. Pontue os ratos diariamente usando o sistema de pontuação GVHD mostrado na tabela um.

Depois de injetar luciferiano nos camundongos e obter imagens dos camundongos anestesiados por cinco minutos em baixa inclinação, analise os dados usando um software de imagem viva. As regiões de interesse podem ser criadas usando software de imagem viva e a emitância da luz pode ser quantificada calculando o fluxo emitido de cada região de interesse. Aqui está o sistema de pontuação GVHD desenvolvido por Cook Etol em 1996.

Os ratos devem ser pontuados diariamente em cada critério à esquerda. Cada camundongo recebe uma pontuação de zero a dois para cada critério e a pontuação total é a soma de todas as pontuações individuais mostradas. Aqui estão os escores clínicos e os dados de sobrevivência para os camundongos receptores que foram transplantados com 10 a sete células da medula óssea sozinhas ou com 18 vezes 10 para os seis citos do tipo selvagem depletados de oito células T CD e duas vezes 10 para as seis células T CD oito positivas purificadas.

Aqui, os dados de pontuação clínica para os receptores de medula óssea isoladamente ou com CD oito, citos de tipo selvagem depletados de T e células T CD oito positivas puras são mostrados, os dados de sobrevida dos receptores de medula óssea isolada ou receptores com CD oito, células T, citos BLE de tipo selvagem depletados e células T CD oito positivas soltas são mostrados aqui. Estas são imagens bioluminescentes de camundongos receptores após injeção com quatro miligramas de D Lúcifer e fotografadas com Enogen IVIS por cinco minutos em pequena rotação. As imagens pseudocoloridas são mostradas onde o roxo representa baixa intensidade e o vermelho representa alta intensidade.

As regiões de interesse foram desenhadas ao redor de todo o camundongo e o fluxo total ou quantificado. Aqui é mostrada uma imagem de bioluminescência de camundongos receptores após a injeção com quatro miligramas de Lúcifer, e fotografada com o Enogen IVIS por cinco minutos em pequena rotação. Como na imagem anterior, as imagens pseudocoloridas são mostradas onde o roxo representa a baixa intensidade e o vermelho representa os painéis de alta intensidade.

A, B e C representam imagens nos dias quatro, seis e oito após a transferência, respectivamente. Após este procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo, podem ser usados para caracterizar ainda mais as células T que se infiltram no intestino.