Avaliar as alterações teratogênicos em um modelo de Zebrafish de exposição fetal ao álcool

O objetivo geral deste procedimento é estudar os efeitos da exposição ao etanol no peixe-zebra em desenvolvimento. Isso é feito expondo primeiro o peixe-zebra a doses de etanol na água normal do embrião durante o desenvolvimento inicial. Em seguida, o etanol é removido e os peixes podem se desenvolver até o ponto de tempo desejado.

Em seguida, tanto as alterações físicas grosseiras quanto as alterações na expressão gênica são analisadas em embriões tratados em comparação com os controles. Finalmente, os embriões são manipulados com mRNA, morfoses ou drogas para determinar se os defeitos de desenvolvimento induzidos pelo etanol podem ser alterados. Em última análise, uma combinação de PCR quantitativo e hibridização em C dois mostra que os efeitos do etanol no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra estão ligados à mudança na expressão gênica.

A manipulação subsequente dos níveis de expressão gênica pode melhorar ou prevenir defeitos de desenvolvimento induzidos pelo etanol. As técnicas que estamos demonstrando hoje ampliam nosso conhecimento da natureza da síndrome alcoólica fetal, bem como conservam os processos de desenvolvimento em vertebrados. Demonstrando hoje estará Steph Erhardt, um técnico do meu laboratório Para tratar embriões com etanol.

Crie-os de acasalamentos do tipo selvagem para o estágio de cúpula a 28 graus Celsius em água embrionária. Divida os embriões de uma ninhada no número desejado de pratos com entre 10 e 50 embriões por prato. Adicione uma solução de etanol entre 0,2 a 2,5% volume a volume em água de peixe aos embriões e retorne à incubadora por até 24 horas após o tempo de exposição desejado.

Substitua o etanol contendo água por água fresca do embrião por um período específico de desenvolvimento para coletar mRNA para PCR quantitativo. Coloque os embriões correspondentes H em tubos einor. Remova a água dos peixes e adicione tampão de lise com TCEP.

Usando um pulverizador motorizado, dissocie fisicamente os embriões e coloque-os na centrífuga para uma centrifugação lenta. Transferir o soluto para uma coluna pré-limpa e, em seguida, centrifugar a coluna. Para remover peças grandes desassociadas.

Use um kit de isolamento de RNA para extrair o RNA. Em seguida, sintetize o CDNA usando métodos padrão para análise de QPCR ou microarray para preparar embriões para hibridização em C dois e teste de anticorpos. Fixe seis a 24 horas após a fertilização embriões em 4% de formaldeído durante a noite a quatro graus Celsius, após três lavagens e PBS mais 0,1% tween.

Remova o choon usando duas pinças afiadas sob o microscópio. Em seguida, mova os embriões para o metanol usando uma série de mudanças líquidas de aumento da concentração de metanol e diminuição da concentração de PBT. Depois de transferir os embriões para 100% de metanol, armazene-os a 20 graus Celsius negativos para manchar a cartilagem.

Crie embriões para cinco ou seis dias após a fertilização. Fixe-os durante a noite em aldeído paraforme a 4% a quatro graus Celsius. Em seguida, lave-os três vezes em PBT Para determinar quais níveis de expressão gênica mudaram com a exposição ao etanol.

Execute o QPCR primeiro projetando primers para validar os primers. Teste-os em três amostras biológicas. Essas amostras biológicas de controle podem ser de qualquer idade, desde que o gene de interesse seja expresso nessa idade específica.

Uma vez verificados os primers, use o CDNA previamente preparado para realizar amostras de QPCR em triplicado e incluindo uma amostra de controle para um controle de peixe-zebra, usamos os primers para lacuna dh. Normalize os resultados para níveis de DH de lacuna. Em seguida, calcule o nível relativo de expressão gênica usando o método poderoso.

Variação em dois delta delta CT exibindo diferença no experimental em relação ao tipo selvagem. Para em C duas construções de hibridização. Vala rotulada ribo sondas para o gene de interesse.

Em seguida, incube-os com embriões pareados por idade usando condições padrão e detecte o padrão de hibridização usando fosfatase alcalina, visualize as amostras usando um microscópio de dissecação para avaliar o desenvolvimento morfogênico, como a forma de embriões vivos de imagem para avaliar a distância interocular e o comprimento do corpo. Primeiro, fixe os embriões em paraformaldeído. Em seguida, colete imagens para examinar os efeitos do tratamento com álcool nas estruturas de cartilagem em desenvolvimento na coloração da larva.

Corrigido o peixe-zebra usando lc e azul por várias horas para deter e limpar os embriões durante a noite antes da imagem. Analise a morte celular em embriões vivos incubando-os em cinco miligramas por mililitro de laranja aine em PBS por uma hora. Lave os embriões três vezes em PBS, depois monte os embriões em lâminas, faça a imagem das amostras usando um microscópio confocal e use a série Z para criar compósitos.

Depois de identificar genes cuja expressão diminuiu devido à exposição ao etanol, injete 25 a 200 picogramas por nanolitros de mRNA tampado para um gene de interesse em um a dois estágios celulares. Deixe os ovos se recuperarem em uma incubadora aquecida a 28 graus Celsius até atingirem o estágio de cúpula e, em seguida, trate-os com etanol como antes. Para genes cuja expressão aumentou como resultado da exposição ao etanol, derrube-os injetando quantidades de picograma a nanograma de morfos anti-sentido em um a dois embriões em estágio celular.

Este protocolo é semelhante ao do mRNA limitado. Se injetar um mRNA, emendando morpho, meça a eficiência usando R-T-P-C-R para comparar as quantidades de transcritos emendados e não fatiados para analisar a atividade do gene dependente da dose, titular o morino injetado e permitir que os embriões se desenvolvam até um estágio desejado antes de tratá-los com etanol. A exposição de embriões de peixe-zebra ao etanol resulta em uma série de defeitos genéticos e de desenvolvimento relacionados aos fenótipos encontrados em outros vertebrados.

O desenvolvimento anormal dos tecidos axiais, incluindo Noor, leva a um noord encurtado e ocasionalmente interrompido, o que em parte leva às anormalidades posteriores nos somitos, como mostrado aqui. Enquanto os controles não tratados têm uma forte forma de chevron, os somitos tratados com etanol assumem a aparência em forma de U vista com sinalização sônica de ouriço reduzida. Como visto aqui.

Outra consequência da exposição ao etanol, possivelmente a jusante do atraso inicial do desenvolvimento e subsequentes defeitos de Noor, é o encurtamento do comprimento do embrião. Esse achado é semelhante à persistência da pré-puberdade, baixa estatura encontrada em crianças expostas ao etanol durante o desenvolvimento, sugerindo que o modelo do peixe-zebra é relevante para a compreensão desse defeito congênito humano. Foi demonstrado em modelos animais que a exposição grave ao etanol leva a fenótipos fetais pronunciados da síndrome alcoólica, incluindo synthia e opia.

No peixe-zebra, a distância intraocular ou IOD diminui de forma dependente da dose de etanol, consistente com a natureza do defeito congênito humano. A opia só é encontrada com doses muito altas, mas doses mais baixas produzem uma redução significativa no IOD, sugerindo que esse modelo animal tem um defeito semelhante no desenvolvimento facial da linha média. Nesta figura, os níveis iniciais de expressão gênica de seis três B e glee um são comparados em embriões não tratados e tratados com etanol.

Ambos os genes demonstraram níveis reduzidos de expressão nas amostras tratadas com etanol. Usando a hibridização NC dois, os padrões de expressão para seis três B e gooID foram analisados como visto. Aqui, ambos os genes mostraram uma diminuição na expressão espacial em embriões tratados com etanol em comparação com controles não tratados.

Como ambos os genes são expressos em tecidos destinados a se tornarem tecidos da linha média craniofacial C, suas reduções oito horas após a fertilização são consistentes com a redução do IOD mais tarde no desenvolvimento. Uma vez identificados os genes afetados pelo etanol, existem mecanismos pelos quais sua expressão pode ser aumentada ou diminuída. Neste exemplo, o mRNA foi injetado para sonic hedgehog, um ligante que aumenta os níveis de glee one, e resgatou os defeitos grosseiros devido a reduções em embriões tratados com glee one e etanol.

A injeção de seis três B, no entanto, não foi capaz de resgatar o fenótipo exposto ao etanol. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como explorar os defeitos genéticos e de desenvolvimento produzidos pelo etanol, um embrião de peixe-zebra em desenvolvimento. As técnicas usadas aqui também podem ser aplicadas àqueles que desejam estudar a toxicidade de outros compostos solúveis em água do embrião vertebrado em desenvolvimento.