Avaliar as alterações teratogênicos em um modelo de Zebrafish de exposição fetal ao álcool

O objetivo geral deste procedimento é estudar os efeitos da exposição ao etanol no desenvolvimento do peixe-zebra. Isso é realizado primeiramente expondo o peixe-zebra a doses de etanol em água normal para embriões durante o desenvolvimento inicial. Em seguida, o etanol é removido e os peixes são deixados desenvolverem-se até o ponto temporal desejado.

Então, são analisadas tanto as alterações físicas macroscópicas quanto as mudanças na expressão gênica em embriões tratados em comparação com embriões controle. Por fim, os embriões são manipulados com mRNA, morfolinos ou fármacos para determinar se os defeitos no desenvolvimento induzidos pelo etanol podem ser alterados. Em última instância, uma combinação de PCR quantitativa e hibridização in situ mostra que os efeitos do etanol em embriões de peixe-zebra em desenvolvimento estão associados a alterações na expressão gênica.

A manipulação subsequente dos níveis de expressão gênica pode melhorar ou prevenir defeitos no desenvolvimento induzidos pelo etanol. As técnicas que estamos demonstrando hoje ampliam nosso conhecimento sobre a natureza da síndrome alcoólica fetal, bem como sobre processos conservados no desenvolvimento de vertebrados. A demonstração de hoje será realizada por Steph Erhardt, técnica do meu laboratório, para tratar embriões com etanol.

Crie-os a partir de cruzamentos de tipo selvagem até a fase de cúpula a 28 graus Celsius em água para embriões. Divida os embriões de uma postura no número desejado de placas, com entre 10 e 50 embriões por placa. Adicione uma solução de etanol entre 0,2 a 2,5% volume por volume em água para peixes aos embriões e retorne à incubadora por até 24 horas após o tempo desejado de exposição.

Substitua o etanol contendo água por água embrionária fresca por um período específico de desenvolvimento para coletar mRNA para PCR quantitativa. Coloque embriões H em tubos einor. Remova a água dos peixes e adicione tampão de lise com TCEP.

Usando um pulverizador motorizado, dissocie fisicamente os embriões e, em seguida, coloque-os na centrífuga para uma rotação lenta. Transfira o soluto para uma coluna de pré-limpeza e, depois, centrifugue a coluna para remover os fragmentos grandes dissociados.

Utilize um kit de isolamento de RNA para extrair o RNA. Em seguida, sintetize cDNA utilizando métodos padrão para análise de QPCR ou microarranjo a fim de preparar embriões para hibridação in situ e imunomarcação. Fixe embriões de seis a 24 horas pós-fertilização em paraformaldeído 4% durante a noite a quatro graus Celsius, após três lavagens com PBS contendo 0,1% de tween.

Remova a coroa usando duas pinças afiadas sob o microscópio. Em seguida, transfira os embriões para metanol utilizando uma série de trocas de líquido com concentração crescente de metanol e concentração decrescente de PBT. Após transferir os embriões para metanol a 100%, armazene-os a menos 20 graus Celsius para coloração da cartilagem.

Criar os embriões até cinco ou seis dias após a fertilização. Fixá-los durante a noite em paraformaldeído 4% a quatro graus Celsius. Em seguida, lavá-los três vezes em PBT para determinar quais níveis de expressão gênica foram alterados pela exposição ao etanol.

Realize QPCR primeiramente projetando iniciadores para validar os iniciadores. Teste-os em três amostras biológicas. Essas amostras biológicas controle podem ser de qualquer idade, desde que o gene de interesse seja expresso naquela idade específica.

Uma vez que os iniciadores tenham sido verificados, utilize o cDNA previamente preparado para realizar a QPCR, executando as amostras em triplicata e incluindo uma amostra controle para um peixe-zebra controle; utilizamos os iniciadores para gap dh. Normalize os resultados em relação aos níveis de gap DH. Em seguida, calcule o nível relativo de expressão gênica utilizando o método poderoso.

Variação no método de dois delta delta CT mostrando a diferença no experimental em relação ao tipo selvagem. Para o construto de hibridização em dois componentes. Descarte as sondas ribossomais marcadas para o gene de interesse.

Em seguida, incube-os com embriões de idade correspondente usando condições padrão e detecte o padrão de hibridização utilizando fosfatase alcalina; visualize as amostras usando um microscópio estereoscópico para avaliar o desenvolvimento morfogenético, como, por exemplo, capturar imagens de embriões vivos para avaliar a distância interocular e o comprimento corporal. Primeiro, fixe os embriões em paraformaldeído. Em seguida, colete imagens para examinar os efeitos do tratamento com álcool nas estruturas de cartilagem em desenvolvimento na larva corada.

Fixe embriões de peixe-zebra usando LC e azul por várias horas até a noite toda para deter e clarear os embriões antes da obtenção de imagens. Analise a morte celular em embriões vivos incubando-os em cinco miligramas por mililitro de laranja de acridina em PBS por uma hora. Lave os embriões três vezes em PBS, em seguida monte os embriões em lâminas, obtenha imagens das amostras usando um microscópio confocal e utilize séries Z para criar imagens compostas.

Após identificar os genes cuja expressão diminuiu devido à exposição ao etanol, injete de 25 a 200 picogramas por nanolitro de mRNA com capuz para um gene de interesse em embriões de um a dois estágios celulares. Deixe os ovos se recuperarem em um incubador aquecido a 28 graus Celsius até atingirem o estágio de cúpula e, em seguida, trate-os com etanol como antes. Para genes cuja expressão aumentou como resultado da exposição ao etanol, reduza sua expressão injetando quantidades de picogramas a nanogramas de morpholinos antissenso em embriões de um a dois estágios celulares.

Este protocolo é semelhante ao utilizado para mRNA com capuz. Se estiver injetando um mRNA, morfolino de splicing, meça a eficiência utilizando a R-T-P-C-R para comparar as quantidades de transcritos splicados e não splicados a fim de analisar a atividade gênica dependente da dose, titule o morfolino injetado e permita que os embriões se desenvolvam até o estágio desejado antes de tratá-los com etanol. A exposição de embriões de peixe-zebra ao etanol resulta em uma série de defeitos genéticos e desenvolvimentais relacionados aos fenótipos encontrados em outros vertebrados.

O desenvolvimento anormal dos tecidos axiais, incluindo o notocorda, leva a uma notocorda encurtada e, ocasionalmente, interrompida, o que em parte resulta nas anormalidades posteriores nos somitos, como mostrado aqui. Enquanto os controles não tratados apresentam uma forma acentuada em forma de chevron, os somitos tratados com etanol assumem uma aparência em formato de U, observada com a sinalização reduzida do sonic hedgehog. Como visto aqui.

Outra consequência da exposição ao etanol, possivelmente posterior ao atraso no desenvolvimento inicial e às defeitos Noor subsequentes, é o encurtamento do comprimento do embrião. Esse achado é semelhante à persistência da estatura baixa pré-púber em crianças expostas ao etanol durante o desenvolvimento, sugerindo que o modelo de peixe-zebra é relevante para a compreensão desse defeito congênito humano. Em modelos animais, demonstrou-se que a exposição grave ao etanol leva a fenótipos acentuados da síndrome alcoólica fetal, incluindo sinfia e opia.

No peixe-zebra, a distância intraocular ou IOD diminui de maneira dependente da dose de etanol, o que é compatível com a natureza do defeito congênito humano. A opia ocorre apenas com doses muito altas, mas doses mais baixas já produzem uma redução significativa na IOD, sugerindo que este modelo animal apresenta um defeito semelhante no desenvolvimento facial mediano. Nesta figura, os níveis precoces de expressão gênica de six três B e glee um são comparados em embriões não tratados e tratados com etanol.

Ambos os genes demonstraram níveis reduzidos de expressão nas amostras tratadas com etanol. Utilizando a hibridização com NC dois, os padrões de expressão de seis três B e gooID foram analisados conforme visto. Aqui, ambos os genes mostraram uma diminuição na expressão espacial em embriões tratados com etanol em comparação com os controles não tratados.

Como ambos os genes são expressos em tecidos destinados a se tornarem estruturas mediano-cranianas, suas reduções oito horas após a fertilização são compatíveis com a redução na DIO observada posteriormente no desenvolvimento. Uma vez identificados os genes afetados pelo etanol, existem mecanismos pelos quais sua expressão pode ser aumentada ou diminuída. Neste exemplo, foi injetado mRNA para sonic hedgehog, um ligante que aumenta os níveis de glee one, o que revertiu os defeitos graves decorrentes da redução de glee one e dos embriões tratados com etanol.

A injeção de seis três B, no entanto, não foi capaz de resgatar o fenótipo exposto ao etanol. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como explorar os defeitos genéticos e desenvolvimentais provocados pelo etanol em um embrião de peixe-zebra em desenvolvimento. As técnicas utilizadas aqui também podem ser aplicadas por aqueles que desejam estudar a toxicidade de outros compostos solúveis em água no embrião vertebrado em desenvolvimento.