Criopreservação do mouse Sperm and Recovery utilizando o I · Cryo Kit
12 de dezembro de 2011
Aqui demonstramos a recém-desenvolvida I • kit Cryo para mouse criopreservação de esperma. Duas células desenvolvimento embrionário palco com descongelado esperma foi melhorado consistentemente em cinco linhagens de camundongos com a utilização deste kit. Durante um período de 1,5 anos, 49 linhas de camundongos geneticamente modificados foram arquivados por criopreservação de espermatozóides com a Cryo kit • I e mais tarde recuperados com sucesso por fertilização in vitro.
O objetivo geral deste procedimento é criopreservar espermatozoides de camundongo. Isso é realizado primeiramente coletando espermatozoides de EPIs de camundongo utilizando palhetas para criopreservação. As palhetas são então congeladas em nitrogênio líquido, onde são armazenadas até serem recuperadas pelo descongelamento em água morna.
Os espermatozoides de camundongo recuperados são, em última instância, utilizados para fertilização in vitro. A principal vantagem deste kit em relação aos métodos existentes é que ele contém todos os materiais necessários para criopreservar e recuperar espermatozoides de camundongo. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades com o manuseio e o carregamento das palhetas. Comece montando 15 palhetas de criopreservação de espermatozoides por linhagem de camundongos a ser criopreservada.
Primeiro, conecte cada palheta de 0,25 mililitro a uma seringa de um mililitro, com o tampão de algodão voltado para o lado mais próximo da seringa. Em seguida, carregue oito centímetros de meio de FIV em cada palheta, seguidos por um centímetro de ar. Por fim, identifique cada uma das 15 palhetas com o nome da linhagem a ser preservada para cada linhagem a ser criopreservada.
Encha um poço de uma placa de quatro poços com 240 microlitros de agente crioprotetor. Fixe uma pipeta de um mililitro ao cabo do recipiente de congelamento para prolongar o cabo. Por fim, encha a caixa isolada com espuma fornecida no kit com 15 centímetros de nitrogênio líquido e feche a tampa para eutanasiar.
Dois camundongos machos adultos férteis. Para cada linhagem a ser criopreservada, remover cirurgicamente seus EPIs caudais. Colocar o camundongo em decúbito dorsal e abrir a parede corporal ventral.
Puxe suavemente o ducto deferente e remova qualquer excesso de gordura. Em seguida, localize o epidídimo e remova-o intacto com um pequeno pedaço do ducto deferente. Coloque os EPIs em um poço de uma placa de quatro poços preparada, contendo CPA, sob um microscópio estereoscópico.
Realize cinco a sete cortes longitudinais em cada epidídimo. Em seguida, usando uma pinça, comprima suavemente cada fragmento. Para expelir os espermatozoides, incube a mistura de CPA e epidídimo à temperatura ambiente por três a cinco minutos.
Agite suavemente o recipiente manualmente duas a três vezes durante a incubação. Isso permitirá que os espermatozoides saiam por aspiração. Carregue cada palheta preparada com cinco milímetros da suspensão de espermatozoides, seguido por um centímetro de ar.
É importante para o processo de congelamento que todos os palhetes sejam carregados igualmente. Após carregar os 15 palhetes, selar cuidadosamente ambas as extremidades de cada palhete com calor. Para garantir a sobrevivência dos espermatozoides, completar o processo para os 15 palhetes dentro de 10 minutos.
Uma vez que todos os palitos estejam preparados, carregue-os na coluna de sêmen do recipiente de congelamento. Primeiro, coloque o recipiente na caixa de isopor e permita que ele flutue verticalmente no nitrogênio líquido. Durante 10 minutos, o recipiente deve permanecer flutuando verticalmente, caso contrário a taxa de congelamento do sêmen será afetada.
Em seguida, imergir o recipiente no nitrogênio líquido. Assim, o esperma é criopreservado e fica pronto para armazenamento de longo prazo em nitrogênio líquido. Aproximadamente 60 horas antes de uma recuperação planejada de esperma.
Siga o protocolo escrito para superovular fêmeas antes da FIV. Para cada palheta a ser descongelada, prepare e equilibre todos os meios por pelo menos uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Esses materiais incluem uma placa de Petri de 35 milímetros com uma gota de 90 microlitros de meio de tratamento de espermatozoides coberta com óleo.
Um prato de Petri de 35 milímetros com três mililitros de meio IVF para servir como prato de corte e, para cada cinco fêmeas superovuladas, prepare um prato IVF, que consiste em um poço de uma placa de quatro poços contendo 500 microlitros de meio IVF. Para cada prato IVF, prepare um prato de lavagem, que é um prato de Petri de 35 milímetros com três mililitros de KSOM, e um prato de cultura de embriões, que é um prato de Petri de 35 milímetros com gotas de 50 microlitros de meio KSOM cobertas com óleo. Com todos os materiais necessários preparados, remova rapidamente uma palheta do armazenamento e coloque-a em um banho-maria a 37 graus Celsius por dois a três minutos.
Seque a palheta. Em seguida, faça um corte oblíquo na coluna de ar abaixo do tampão de algodão. Na outra extremidade da palheta, faça outro corte oblíquo sobre uma segunda coluna de ar.
Evite cortar a coluna de espermatozoides. Agora aspire a suspensão de espermatozoides da extremidade do canudo, utilizando uma pipeta de 200 microlitros, e deposite-a no centro do meio de tratamento de espermatozoides. Em seguida, incube a placa por 45 a 60 minutos.
Durante a incubação dos espermatozoides, isole os UCs das fêmeas superovuladas e transfira-os para a placa de dissecção. Use uma agulha de 30 ou pinça para rasgar cada oviduto, liberando os complexos cumulus-células. Transfira os CCs de cinco fêmeas para cada FIV.
Bem, com uma quantidade mínima de meio. Evite transferir gordura e sangue, pois meios contaminados inibem a eficiência da fertilização. Após a incubação, colete de 10 a 15 microlitros da suspensão de espermatozoides da periferia da gota de STM e deposite a suspensão em um único procedimento de FIV.
Agora, realize a cocultura das células por quatro a seis horas para fecundação. Após a fecundação, passe os embriões por pelo menos duas lavagens com SOM 2K no recipiente de lavagem. Em seguida, cultive.
Os embriões em KSOM até que o estágio de desenvolvimento desejado seja atingido. O esperma de cinco linhagens endogâmicas de camundongos Charles River foi congelado. As taxas de proteção da motilidade espermática e da motilidade progressiva rápida variaram de 81% a 47% entre as cinco linhagens provenientes desses espermatozoides.
As taxas de FIV com espermatozoides congelados e descongelados variaram entre 26 e 88% em diferentes linhagens ao longo de um ano e meio. Um total de 49 linhagens de camundongos GM foi arquivado por criopreservação de espermatozoides e posteriormente recuperado por FIV em quatro linhagens femininas diferentes. C57 black six, BC, DBA1 e 129SV. Uma vez dominada, a técnica de criopreservação de espermatozoides pode ser realizada em 30 minutos, se executada corretamente.
Para este procedimento, é importante fluir para o cilindro verticalmente e com nitrogênio líquido.
Visão Geral
Este estudo apresenta o kit I•Cryo para criopreservação eficaz de espermatozoides de camundongo, demonstrando o aprimoramento do desenvolvimento embrionário em múltiplas linhagens de camundongos. O kit facilita a arquivagem de linhagens de camundongos geneticamente modificados por meio da criopreservação de espermatozoides e recuperação subsequente por fertilização in vitro (FIV).
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Reprodutiva
- Técnicas de Criopreservação
- Fertilização In Vitro (FIV)
Antecedentes
- A criopreservação de espermatozoides de camundongo é essencial para a pesquisa genética.
- Os métodos existentes podem apresentar falta de eficiência e facilidade de uso.
- O kit I•Cryo tem como objetivo simplificar o processo de criopreservação.
- A recuperação bem-sucedida de espermatozoides é essencial para os resultados de fertilização in vitro.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a eficácia do kit I•Cryo na criopreservação de espermatozoides de camundongo.
- Avaliar o impacto do espermatozoide criopreservado no desenvolvimento embrionário.
- Arquivar linhagens de camundongos geneticamente modificados para pesquisas futuras.
Métodos Utilizados
- Coleta de espermatozoides do epidídimo de camundongo utilizando palhetas para criopreservação.
- Congelamento de espermatozoides em nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.
- Descongelamento de espermatozoides para uso em procedimentos de FIV.
- Avaliação da motilidade espermática e das taxas de sucesso de FIV em diferentes linhagens.
Resultados Principais
- Desenvolvimento embrionário aprimorado observado em 5 linhagens de camundongos utilizando o kit I•Cryo.
- 49 linhagens de camundongos geneticamente modificados arquivadas e recuperadas com sucesso.
- As taxas de motilidade espermática variaram de 81% a 47% entre as linhagens.
- As taxas de FIV variaram de 26% a 88% com espermatozoides congelados e descongelados.
Conclusões
- O kit I•Cryo melhora significativamente a eficiência da criopreservação de espermatozoides.
- A recuperação bem-sucedida de linhagens geneticamente modificadas apoia sua utilidade na pesquisa.
- Uma maior otimização do método pode reduzir o tempo de processamento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A criopreservação de espermatozoides de camundongo oferece uma solução econômica e escalável para arquivar linhagens geneticamente modificadas, reduzindo a dependência de colônias vivas de animais e mitigando os riscos de perda de linhagens. O kit I•Cryo aumenta a confiança preditiva na preservação de linhagens ao melhorar a motilidade espermática pós-descongelamento e o desenvolvimento embrionário derivado de FIV em múltiplos backgrounds isogênicos. Isso apóia a gestão estratégica de portfólios em pesquisas pré-clínicas, permitindo o armazenamento de longo prazo confiável e a recuperação sob demanda de modelos valiosos de doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a validação funcional de modelos genéticos ao garantir a recuperabilidade de espermatozoides para triagem fenotípica baseada em FIV.
- Valor Operacional: Reduz a carga de manejo animal e os custos associados à manutenção de colônias vivas de modelos de baixo rendimento ou indutíveis.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece uma fonte padronizada de espermatozoides para ensaios de FIV consistentes, apoiando a avaliação reprodutível dos efeitos de compostos na fertilização e no desenvolvimento embrionário inicial.
- Valor Operacional: Facilita a prontidão do ensaio por meio de espermatozoides criopreservados, eliminando a variabilidade decorrente das diferenças entre machos ou entre lotes na coleta de amostras frescas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a integridade genética de modelos de doenças ao longo do tempo, permitindo estudos longitudinais e continuidade experimental entre gerações.
- Valor Operacional: Apoia a colaboração entre múltiplos locais ao permitir a distribuição de espermatozoides criopreservados em vez de animais vivos, reduzindo a complexidade do transporte e as preocupações com biossegurança.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao fluxo de trabalho de descoberta desde a geração inicial do modelo até a validação pré-clínica, servindo como uma ponte entre engenharia genética e fenotipagem funcional por meio da FIV.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a recuperação de espermatozoides criopreservados para FIV, possibilitando a avaliação dos efeitos de modificações genéticas na fertilidade e na embriogênese inicial.
- Triagem: Permite ensaios padronizados baseados em FIV utilizando espermatozoides descongelados, melhorando a reprodutibilidade na avaliação da função espermática, capacitação e competência fertilizante.
- Análises: Gera dados quantitativos, como motilidade espermática (% progressiva), motilidade progressiva rápida e taxas de desenvolvimento embrionário, que orientam decisões de continuidade ou descontinuidade quanto à estabilidade do modelo.
- Pesquisa Translacional: Conecta modificações genéticas a desfechos no desenvolvimento ao viabilizar a FIV com espermatozoides criopreservados, apoiando triagem fenotípica associada a biomarcadores em embriões pré-implantacionais.
- Reutilização Institucional: Estabelece uma plataforma reutilizável de criobancos para arquivamento e recuperação contínuos de linhagens modificadas geneticamente, reduzindo esforços redundantes de rederivação em diferentes projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na preservação do modelo ao demonstrar maior motilidade e desenvolvimento embrionário em comparação com métodos básicos de CPA.
- Valor Operacional: Padroniza o fluxo de trabalho de criopreservação por meio de componentes baseados em kits, reduzindo a variabilidade entre usuários e o tempo de treinamento.
- Valor Estratégico: Reduz os custos de longo prazo com a manutenção de linhagens e diminui o risco de perda irreversível de linhas devido a falhas reprodutivas, deriva genética ou surtos de patógenos.
- Impacto sobre o Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de linhagens GM para arquivamento com base em seu valor estratégico, com confiança na recuperação futura.
Considerações sobre a Implementação
- Exige proficiência técnica na coleta de espermatozoides, manipulação de palhetas e selagem térmica para garantir a integridade da amostra.
- Depende do acesso a armazenamento em nitrogênio líquido e equipamentos de descongelamento controlado (banho-maria a 37 °C) para desempenho pós-descongelamento consistente.
- Necessita de meios de FIV padronizados e protocolos de superovulação para resultados confiáveis de fertilização e cultivo de embriões.
- O desempenho pode variar entre diferentes origens genéticas, exigindo otimização específica da linhagem nos passos de incubação e lavagem.
- Limitado pela necessidade de fêmeas férteis e expertise em FIV para recuperação de espermatozoides, restringindo a aplicação direta a ensaios baseados em acasalamento natural.
