Criopreservação do mouse Sperm and Recovery utilizando o I · Cryo Kit

O objetivo geral deste procedimento é criopreservar espermatozoides de camundongos. Isso é feito coletando primeiro esperma de EPIs de camundongos usando canudos de preservação criogênica. Os canudos são então congelados em nitrogênio líquido, onde são armazenados até que sejam recuperados, descongelando-os em água morna.

O esperma de camundongo recuperado é usado para fertilização in vitro. A principal vantagem deste kit sobre os métodos existentes é que o kit contém todos os materiais necessários para criopreservar e recuperar esperma de camundongo Geralmente, os indivíduos novos neste método podem estrangular com o manuseio e carregamento de canudos. Comece montando 15 canudos de criopreservação de esperma por linha de camundongos a serem criopreservados.

Primeiro, conecte cada canudo de 0,25 mililitro a uma seringa de um mililitro com o tampão de algodão mais próximo da seringa. Em segundo lugar, carregue oito centímetros de meio de fertilização in vitro em cada canudo, seguido por um centímetro de ar. Terceiro, rotule cada um dos 15 canudos com o nome da linha a ser preservada para cada linha a ser criopreservada.

Encha um poço de um prato de quatro poços com 240 microlitros de agente crioprotetor. Conecte uma pipeta de um mililitro à alça do recipiente de congelamento para estender a alça. Por fim, encha a caixa isolada de espuma fornecida com o kit com 15 centímetros de nitrogênio líquido e feche a tampa eutanasiada.

Dois camundongos machos adultos férteis. Para cada linha a ser criopreservada e cirurgicamente, remova seus EPIs codais. Coloque o camundongo em recu dorsal e abra a parede ventral do corpo.

Puxe suavemente a vasta deferência e remova o excesso de gordura. Em seguida, localize o epidídimo e remova-o intacto com um pequeno pedaço de deferência rápida. Coloque os EPIs em um poço do prato de quatro poços preparado carregado com CPA Sob um escopo de dissecação.

Faça de cinco a sete cortes longitudinais em cada epidídimo. Em seguida, usando uma pinça, aperte suavemente cada diferença rápida. Para empurrar o esperma, incube a mistura de CPA e epidídimo em temperatura ambiente por três a cinco minutos.

Agite suavemente o prato com a mão duas a três vezes durante a incubação. Isso permitirá que o esperma nade por aspiração. Carregue cada canudo preparado com cinco milímetros da suspensão de esperma, seguidos de um centímetro de ar.

É importante para o processo de congelamento que todos os canudos sejam carregados igualmente. Depois de carregar todos os 15 canudos, sele cuidadosamente as duas extremidades de cada canudo. Para garantir a sobrevivência dos espermatozoides, conclua o processo para todos os 15 canudos em 10 minutos.

Depois que todos os canudos estiverem preparados, coloque-os na coluna de esperma do recipiente de congelamento. Primeiro, coloque o recipiente na caixa de espuma e deixe-o flutuar verticalmente no nitrogênio líquido. Por 10 minutos, o recipiente deve flutuar verticalmente ou a taxa de congelamento do esperma será afetada.

Em seguida, mergulhe o recipiente no nitrogênio líquido. O esperma é, portanto, criopreservado e está pronto para armazenamento de nitrogênio líquido a longo prazo. Aproximadamente 60 horas antes de uma recuperação planejada do esperma.

Siga o protocolo escrito para superovular as fêmeas antes da fertilização in vitro. Para cada canudo a ser descongelado, prepare e equilibre todos os meios por pelo menos uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Esses materiais incluem uma placa de Petri de 35 milímetros com uma gota de 90 microlitros de meio de tratamento de esperma coberto com óleo.

Uma placa de Petri de 35 milímetros com três mililitros de meio de fertilização in vitro para servir como prato de corte e para cada cinco mulheres superovuladas prepara um prato de fertilização in vitro, que é um poço de um prato de quatro poços carregado com 500 microlitros de meio de fertilização in vitro. Para cada prato de fertilização in vitro, prepare um prato de lavagem, que é um prato de Petri de 35 milímetros com três mililitros de KSOM e um prato de cultura de embriões, que é um prato de Petri de 35 milímetros com gotas de 50 microlitros de meio KSOM coberto com óleo. Com todos os materiais necessários preparados, remova rapidamente um canudo do armazenamento e coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius por dois a três minutos.

Seque o canudo. Em seguida, faça um corte angular na coluna de ar abaixo do tampão de algodão. Na outra extremidade do canudo, faça outro corte angular sobre outra coluna de ar.

Evite cortar a coluna de esperma. Agora aspire a suspensão de esperma da extremidade do canudo, usando uma pipeta de 200 microlitros e deposite-a no centro do meio de tratamento de esperma. Deixar cair. Em seguida, incube o prato por 45 a 60 minutos.

Durante a incubação do esperma, isole os UCS das fêmeas superovuladas e transfira-os para a placa de corte. Use uma agulha ou fórceps de calibre 30 para rasgar cada oviduto, liberando os complexos de citos cumulus. Transfira os C Cs de cinco fêmeas para cada fertilização in vitro.

Bem, com uma quantidade mínima de mídia. Evite transferir gordura e sangue, pois o meio sujo inibe a eficiência da fertilização. Após a incubação, colete de 10 a 15 microlitros da suspensão de espermatozóides da periferia da gota STM e deposite a suspensão em uma fertilização in vitro.

Bem, agora co-cultive as células por quatro a seis horas para fertilização. Após a fertilização, passe os embriões por pelo menos 2K lavagens SOM na assadeira. Então cultura.

Os embriões em KSOM até que o estágio de desenvolvimento desejado seja alcançado. O esperma de cinco linhagens de camundongos endogâmicos do rio Charles foi congelado. As taxas de proteção da motilidade espermática e da motilidade progressiva rápida variaram de 81% a 47% em cinco cepas desses espermatozoides.

As taxas de fertilização in vitro com espermatozoides congelados descongelados variaram em diferentes cepas de 26 a 88% ao longo de um ano e meio. Um total de 49 linhagens de camundongos GM foram arquivadas por criopreservação de espermatozóides e posteriormente recuperadas por fertilização in vitro em quatro cepas femininas diferentes. C 57 preto seis BC DBA um e 1 29 SV Uma vez dominada, a técnica de criopreservação de espermatozóides pode ser feita em 30 minutos se for realizada corretamente.

Para este procedimento, é importante fluir para o recipiente verticalmente e nitrogênio líquido.