Técnicas Analíticas para ensaiar Bioatividade Óxido Nítrico

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar como detectar com precisão e especificamente metabólitos de óxido nítrico em amostras biológicas. Isso é conseguido processando primeiro as amostras de sangue imediatamente após a coleta para evitar a perda de metabólitos ou a formação de artefatos. Ao mesmo tempo, uma colheita rápida e eficiente de tecido é realizada para minimizar os efeitos de um ambiente hipóxico sobre os metabólitos do óxido nítrico.

Os anéis aórticos são coletados e pendurados em um banho de órgãos para avaliar sua função endotelial. Além disso, ensaios bioquímicos são usados para quantificar os níveis de nitrato, níveis de nitrito e os níveis relativos de nitrotióis e outros produtos nitrosados no tecido. Usando esses ensaios, uma comparação adequada de animais experimentais e de controle pode gerar informações valiosas sobre a produção e o metabolismo do óxido nítrico.

A principal vantagem de usar essa abordagem multissistêmica em relação a métodos ou ensaios únicos é que isso permitiria uma imagem mais ampla da bioquímica do óxido nítrico em vários sistemas de órgãos. Então, podemos começar a entender quais desses metabólitos podem ter utilidade prognóstica ou diagnóstica e como o repertório de metabólitos do óxido nítrico reflete a formação e disponibilidade de óxido nítrico endotelial. A demonstração visual desse método é crítica, pois cada etapa do processo é fundamental para manter a integridade da amostra.

Algumas dessas etapas não são aparentes na seção de métodos de leitura em periódicos típicos devido aos detalhes da coleta de amostras e extração de tecidos. Demonstrando este procedimento estará o Dr. Hong Jing. Um cientista pesquisador sênior em meu laboratório Para este protocolo tem disponível uma pessoa ou animal experimental para uma coleta de sangue para animais experimentais cujos tecidos também serão examinados.

Primeiro, colete sangue total inserindo uma agulha de calibre 25 na veia cava inferior. Uma vez que 500 a 1000 microlitros tenham sido coletados, perfunda o animal livre do sangue remanescente infundindo tampão fisiológico através do ápice do ventrículo esquerdo e permita a reposição total do sangue à medida que o sangue e o tampão saem pela VE AVC inferior. O sangue venoso deve ser coletado em tubos centrífugos de 1,5 mililitros contendo NEM e EDTA imediatamente após a coleta.

Gire o sangue a 14.300 RCF por sete minutos após a centrifugação. Aspirar o plasma do grânulo eritrocitário com uma pipeta e transferi-lo para um tubo separado. Prepare as amostras de plasma isoladas para HPLC adicionando primeiro um volume de metanol frio a 50 microlitros da coleção de plasma.

Vórtice, a mistura vigorosamente por três a cinco segundos até que fique turva. Em seguida, centrifugue a mistura a 14.300 RCF durante sete minutos. Para precipitar as proteínas plasmáticas, colete o supernat em um tubo separado de 1,5 mililitro e armazene-o a quatro graus Celsius até que possa ser analisado.

Para preparar o plasma para análise de quimioluminescência, pegue o volume de plasma restante, que deve estar em torno de 200 a 400 microlitros e divida-o em dois volumes. Prepare metade do plasma adicionando um volume de 10% de sulfeto acidificado a 5% e aguarde 10 minutos. Esta amostra agora está pronta para análise CLD.

Prepare a outra metade do plasma adicionando 10% do volume de cloreto de mercúrio a 2% após cinco minutos. À temperatura ambiente, adicione um volume de 10% de sulfonamida acidificada. Aguarde mais 10 minutos e injete esta amostra no CLD como o plasma.

O pellet de hemácias pode ser preparado para HPLC e CLD para qualquer análise. Comece misturando uma parte de pellet celular com quatro partes de solução de lise hipotônica. Vortex a mistura completamente para análise CLD.

A preparação para as células é a mesma que a realizada para o plasma. Comece adicionando um volume igual de metanol. Em seguida, agite a mistura vigorosamente por três a cinco segundos, seguido de girá-la por sete minutos a 14.300 RCF.

Agora pipete o sobrenadante e armazene-o a quatro graus Celsius até que possa ser analisado por HPLC para determinar os níveis teciduais de metabólitos de óxido nítrico. Nos tecidos de interesse de animais experimentais, o sangue deve primeiro ser colhido e preparado conforme descrito na secção anterior, a colheita dos tecidos deve ser feita como habitualmente, com especial atenção à rapidez e eficiência para que os tecidos não se tornem hipóxicos. Uma vez coletadas, homogeneizaram as amostras de tecido em uma proporção de um para cinco de N-E-M-E-D-T-A contendo PBS.

Em seguida, prepare os tecidos homogeneizados para análise por HPLC e CLD, conforme descrito nas seções anteriores para hemácias. Depois de anestesiar um camundongo adulto com éter datil e confirmar que ele não responde a uma pitada no dedo do pé, faça uma toracotomia. Uma incisão na linha média é feita do esterno até a região do púbis para expor as cavidades torácica e abdominal.

Em seguida, perfunda o animal com tampão de Krebs Alite oxigenado. Use uma seringa de calibre 25 para injetar o tampão no ápice do ventrículo esquerdo. Com o átrio direito é aberto para fornecer uma saída para o sangue.

Após a perfusão, isole a aorta abdominal cortando e removendo o fígado, pulmões e outros tecidos que possam cobrir a aorta. Em seguida, segure o coração com um par de pinças e corte a aorta da parede posterior do animal de maneira suave. Coloque o coração e a aorta em uma placa de Petri cheia de gelo.

Tampão Krebs frio no prato. Corte e limpe cuidadosamente a gordura e a adventícia da aorta. Evite danificar o endotélio dentro do vaso durante a limpeza.

Mantenha o metabolismo das aortas lento para evitar a hipóxia, transferindo-o para um tampão oxigenado fresco e gelado a cada cinco minutos. Agora use um bisturi para cortar a aorta em segmentos em forma de anel de três milímetros de comprimento. Transfira os segmentos para um banho de órgão tecidual de 10 mililitros de quatro canais carregado com tampão Krebs oxigenado.

Usando o botão do transdutor, aplique 1,5 gramas de pré-tensão em cada anel aórtico. De acordo com a descoberta empírica. 1,5 gramas é a tensão inicial apropriada para uma função vasomotora ideal.

No mouse monitore e registre a medição de força usando uma ponte octal de oito canais e um software de aquisição de dados, deixe os anéis se equilibrarem por 80 minutos, trocando o buffer a cada 20 minutos e, em seguida, prossiga com a experimentação. Depois que a tensão do tecido estiver equilibrada, adicione 100 nanomolares de erva-doce a cada anel para contração submáxima. Uma vez que a tensão do anel tenha se estabilizado e haja um nível constante de tônus, realize uma análise de resposta à dose em um agonista endotelial, como a acetilcolina.

Isso determinará a produção de óxido nítrico e o grau de relaxamento do vaso. Após a resposta à dose de acetilcolina, enxágue os banhos com tampão de Krebs e adicione 100 nanomolares de erva-doce a cada banho de órgão para contrair os vasos. Novamente, determine a capacidade de resposta dos anéis de músculo liso a uma fonte exógena de óxido nítrico, como o lado nitropress de sódio com e sem ODQ, um inibidor da quinase solúvel em astúcia.

Este tipo de abordagem determinará um valor de relaxamento de 100% para os vasos e também demonstra a natureza essencial da guile ciclase solúvel na mediação da resposta do óxido nítrico ao relaxamento vascular. Uma vez que o ODQ impedirá o relaxamento ao nitro IDE de sódio em resposta à acetilcolina, os anéis aórticos de controle saudável, os camundongos relaxaram enquanto os anéis aórticos de camundongos com disfunção endotelial mostraram relaxamento reduzido devido a uma redução na produção de óxido nítrico. Ensaios de nitrosação específicos do grupo também foram realizados nos animais controle quimioluminescência de nitrito.

RSNO e RNNO foram detectados usando um ensaio redutor de nitros. Subtraindo-se as áreas dos picos, foram medidos os níveis de nitrito e r sno. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do óxido nítrico e da biologia vascular, como como os níveis circulantes desses metabólitos do óxido nítrico refletem os níveis dos tecidos e como os metabólitos da doença mudam em diferentes condições de doença?

A determinação das concentrações no estado estacionário e da meia-vida desses metabólitos relevantes do óxido nítrico em vários sistemas de órgãos e ao longo da circulação de um único animal permitirá a identificação de assinaturas moleculares específicas de processos patológicos e nos ajudará a definir novas modalidades de tratamento baseadas em óxido nítrico, o que permitirá que o clínico esteja armado com melhores biomarcadores para a gravidade ou progressão da doença. Geralmente, os indivíduos novos no campo do ácido nítrico terão dificuldades porque muitos minimizam a sensibilidade o suficiente para detectar e quantificar esses baixos níveis de metabolização de ácido tricílico encontrados em amostras biológicas. Em primeiro lugar, uma não habilidade em arte provavelmente criará artefatos durante o processamento da amostra que precisam de dados errôneos e má interpretação dos dados.