Name: Técnicas Analíticas para ensaiar Bioatividade Óxido Nítrico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprenda a detectar metabolitos de óxido nítrico em amostras biológicas usando ensaios bioquímicos e anéis aórticos. Este método permite avaliar a função endotelial e comparar níveis de NO entre grupos experimentais.

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Os autores gostariam de agradecer Hong Jiang, Ph.D. e Deepa Parathasarthy, MPH, BDS para a assistência técnica.

1. Coleta de Sangue Total <ol><li> Coletar sangue venoso de humanos ou de animais experimentais em ELm / tubos contendo EDTA. </li><li> Imediatamente girar sangue em uma centrífuga de bancada a 14.300 rcf (força centrífuga relativa) por 7 minutos para o preparo do plasma e dos glóbulos vermelhos pelota. </li><li> Preparar amostras de plasma para cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e detecção por quimioluminescência (CLD) análise. HPLC: Adicionar 01:01 volume de metanol frio para o plasma, vortex e centrifugar a 13.200 rpm durante 10 minutos para precipitar as proteínas plasmáticas. Recolher o sobrenadante para análise por HPLC. Cale: alíquota de uma amostra e pré-incubar com sulfanilamida e cloreto mercúrico a nitrosotióis especificamente ensaio. </li><li> Prepare células vermelhas do pellet para HPLC e análise CLD. HPLC: 01:04 Adicionar vermelho pellet celular a uma solução de lise hipotónico contendo 10 mM de NEM, 2,5 mM de EDTA e 10 mM de ferricianeto. Vortex completamente e em seguida, adicione 1:1 metanol, vórtice e centrifEGD em 13.200 rpm durante 10 minutos para a proteína precipitado. Recolher o sobrenadante para análise por HPLC. CLD. Adicionar 01:04 vermelho pellet celular a uma solução de lise hipotónico contendo 10 mM de EDTA, 2,5 mM de EDTA e 10 mM de ferricianeto. Partes alíquotas para tubos contendo cloreto de sulfanilamida e mercúrico para a detecção específica de nitrosotióis. </li></ol> 2. Extração de Tecidos e Preparação <ol><li> Para determinar os níveis de tecido de metabólitos, é primeiro necessário para colher tecido sanguíneo livre para a preparação da amostra, como descrito acima. Uma troca de sangue completo terá lugar através da infusão de tampão fisiológico através do vértice do ventrículo esquerdo. Uma vez que todo o sangue é removido, os tecidos de interesse pode então ser colhido. </li><li> Homogeneizar amostras de tecido e preparar amostras como descrito acima para HPLC e análise CLD. </li></ol> 3. Isolamento anéis de aorta para a função endotelial Banho de órgãos de tecido <ol><li> Ratos será Anesthetized com éter dietílico até já não respondem ao toe pitada, e passam por deslocamento cervical antes da cirurgia. Um toracotomia é realizada para expor aorta torácica e abdominal. Uma seringa de calibre 25 é inserido no ápice do ventrículo esquerdo e perfundidos livre de sangue oxigenado com tampão de Krebs Henseleit. </li><li> O átrio direito é cortado para proporcionar uma saída para o sangue. Aorta abdominal será removido e limpo de adventícia. </li><li> Anéis irá ser cortado em segmentos longos 2 mm e montado sobre um banho de órgãos de quatro canais de tecido (DMT 720MO, instrumentos ad) banhadas em solução de tampão fisiológico. </li><li> Anéis de vasos são mantidos em banhos de órgãos de 10 ml com tampão de Krebs oxigenada (95% de O2 e 5% de CO 2), a 37 ° C. Um grama pretensão é colocado em cada anel aórtico (tensão de partida apropriado para a função vasomotora óptima, tal como determinado em experiências anteriores). Um oito canais octal ponte (Powerlab) e de aquisição de dados de software (Gráfico versão 5.2.2) umaestá acostumado a gravar todas as medidas de força. </li><li> Os anéis são deixadas equilibrar durante 80 minutos com o tampão em cada banho de órgãos mudado cada 20 min. Após o equilíbrio por 80 min, 1 mM de fenilefrina é adicionado a cada anel para a contração submáxima. </li><li> Após estabilização, agonista endotelial como a acetilcolina será adicionado para determinar a produção de NO e grau de relaxamento do vaso. Após a resposta à dose para a acetilcolina, banhos serão lavadas e recontracted e depois tratada com uma fonte exógena de óxido nítrico, nitroprussiato de sódio para determinar a resposta do músculo liso e para obter um valor para o relaxamento de 100%. </li><li> NO scavengers pode ser adicionado ao banho para ilustrar claramente libertação de NO e de inibição de relaxamento do vaso. </li></ol> 4. Os resultados representativos A utilização do ENO-20 dedicado HPLC fornece um método mais fácil de usar com rendimento elevado para a detecção específica e sensível de nitrito e nitrato namatrizes biológicas. O princípio de detecção e um cromatograma original é mostrada na Figura 1. Este método pode ser usado para qualquer amostra biológica para a determinação de nitrito e nitrato. Detecção baseada em CLD de metabólitos do requer um passo de derivatização química para determinar a fonte molecular do NO. A configuração experimental para desnitrosação oxidativo simultânea e desnitrosação redutiva para o detector de quimioluminescência é mostrado na Figura 2. O vaso de reacção do lado direito é preenchido com ferricianeto de 800mm em PBS pH 7,4 e do vaso de reacção do lado esquerdo é preenchido com a mistura de iodeto / iodeto de potássio em ácido acético para desnitrosação redução (Figura 2A). Toda a configuração é mostrada na Figura 2B. A Figura 3 ilustra ensaios de grupos específicos desnitrosação que podem detectar e quantificar nitrito, nitrosotióis, nitrosaminas, bem como produtos de heme nitrosilo. Este método tem sido previamente descricama e validado 4,5. Estas análises bioquímicas importantes pode facilmente ser correlacionada com os estudos funcionais em anéis de aorta isolados para determinar a produção de NO endotelial em animais experimentais. Este experimento clássico farmacológico pode facilmente e com precisão avaliar a função endotelial de NO e de produção. Medindo reactividade vaso aos agonistas endoteliais, tais como a acetilcolina pode determinar directamente a produção de NO endotelial que pode então ser correlacionada com os biomarcadores bioquímicos detectados no sangue e nos tecidos dos animais experimentais. Uma representação típica de uma resposta à dose para a acetilcolina é mostrado na Figura 4. Camundongos de controle saudáveis ​​com função endotelial normal responder a acetilcolina, relaxando. Os ratos com disfunção endotelial (ratos hipercolesterolêmicos) mostram relaxamento reduzida devido à redução da produção ao mesmo estímulo. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig1.jpg" /> FigoA Figura 1. Princípio da detecção de nitrito e nitrato por ENO-20 e cromatograma da amostra. (Top) Esquema de ENO-20 método de detecção de nitrito e nitrato. (Inferior) chromotogram padrão de 10 pmol de nitrito e nitrato injectado ENO-20 (100 uL de solução 100 nM de nitrito e nitrato). Sensibilidade de 1 nM para cada anião com 100 ul volume de injecção. Não há interferência com a proteína ou espécies coloridas. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig2.jpg" /> Figura 2. Configuração CLD experimental usando tanto desnitrosação oxidativo por desnitrosação ferricianeto e redutora usando iodeto / iodo ensaio com detecção de fase gasosa de gás de óxido nítrico purgado. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig3.jpg" /> Figura 3. (Painel A) de detecção de quimioluminescência de nitrito, RSNO, RNNO no ensaio desnitrosação redutora por pré-incubação da amostra com o grupo de chemic específicoai reagentes. Subtração das áreas dos picos permitir a detecção de nitrito e RSNOs. (Painel B) de detecção quimioluminescente de espécies heme nitrosilo usando solução de ferricianeto de desnitrosação oxidativo. Este método é específico para o NO heme-produtos sem reactividade cruzada com RSNOs (GSNO ou SNO-albumina), ou RNNO (NO-pirrolidina e N-nitroso-albumina). <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig4.jpg" /> Figura 4. Ex banho de órgãos in vivo em anéis de aorta isolados fornece uma medida directa da produção de NO endotelial que pode então ser correlacionada com os biomarcadores bioquímicos detectados por HPLC e CLD. Esta figura ilustra o relaxamento reduzido nos ratinhos com disfunção endotelial devido à diminuição da produção de NO.

<ol><li>Kelm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+metabolism+and+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide metabolism and breakdown.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os métodos descritos aqui para a quantificação de metabólitos do NO relevantes em vários compartimentos biológicos permitirá para o fingerprinting de NO biologia na saúde e na doença que podem ser correlacionados com as medições funcionais de NO pelo endotélio. Estes métodos requerem preparação de amostras simples, com potencial de adaptação para a produção elevada. A quantidade relativa destas moléculas pode ajudar a compreender a produção de NO e sua transformação metabólica num certo número de modelos experimentais d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> N-etilmaleimida </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23030 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7889 </td></tr><tr><td> Ferricianeto de potássio </td><td> Fluka </td><td> 60299 </td></tr><tr><td> HPLC </td><td> Eicom Corp </td><td> ENO-20 </td></tr><tr><td> Autosampler </td><td> Alcott </td><td></td></tr><tr><td> DMT Myograph </td><td> Instrumentos AD </td><td></td></tr><tr><td> PowerLab </td><td> Instrumentos AD </td><td></td></tr><tr><td> Quimioluminescente </td><td> EcoPhysics </td><td> CLD 88Y </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td></tr><tr><td> A acetilcolina </td><td> Sigma-Aldrich</td><td> A6625 </td></tr><tr><td> R-(-) Fenilefrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6126 </td></tr></tbody></table>

técnicas analíticas para ensaiar bioatividade Óxido nítrico

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

O óxido nítrico (NO) é um radical livre diatômico que é extremamente curta duração em sistemas biológicos (menos de 1 segundo no sangue circulante) 1. NO pode ser considerada uma das moléculas de sinalização mais importantes produzidos no nosso corpo, regulando as funções essenciais, incluindo mas não limitado a regulação da pressão arterial, a resposta imune e comunicação neural. Portanto, sua detecção precisa e quantificação, em matrizes biológicas é crucial para entender o papel do NO na saúde e na doença. Com tal meia vida um curto fisiológica de NO, estratégias alternativas para a detecção dos produtos de reacção de NO bioquímica têm sido desenvolvidos. A quantificação dos metabólitos do NO relevantes em vários compartimentos biológicos fornece informação valiosa no que diz respeito ao método in vivo a produção de NO a biodisponibilidade, e metabolismo. Basta provar um único compartimento, tais como sangue ou plasma nem sempre pode fornecer uma avaliação precisa do bo todody NO estado, particularmente em tecidos. A possibilidade de comparar o sangue com tecidos selecionados em animais de experimentação ajudará a ponte entre a ciência básica ea medicina clínica, na medida do utilitário de diagnóstico e prognóstico de NO biomarcadores na saúde e na doença. Portanto, a extrapolação do plasma ou do sangue para os tecidos estado NO específicos de interesse não é mais uma abordagem válida. Como resultado, os métodos de continuar a ser desenvolvido e validado que permitem a detecção e quantificação de NO e NO-produtos afins / metabolitos em múltiplos compartimentos de animais experimentais in vivo. O paradigma estabelecido de NO bioquímica da produção de NO sintases a ativação de guanilato ciclase solúvel (GCs) à oxidação eventual a nitrito (NO 2 -) e nitrato (NO 3 -) pode representar apenas parte de NO de efeitos in vivo. A interacção de metabolitos de NO e NO-derivada com tióis proteicos, aminas secundárias, e metais para formar S-nitrosothióis (RSNOs), N-nitrosaminas (RNNOs), e nitrosilo-heme representam respectivamente cGMP-independentes efeitos de NO e são susceptíveis tão importante como fisiologicamente activação de sGC pelo NO. Uma compreensão verdadeira de NO na fisiologia é derivado a partir de experiências in vivo de amostragem compartimentos múltiplos simultaneamente. O óxido nítrico metodologia (NO) é uma ciência complexa e muitas vezes confuso e o foco de muitos debates e discussão sobre NO bioquímica. A elucidação de novos mecanismos e vias de sinalização envolvendo NÃO depende de nossa capacidade de, especificamente, de forma seletiva e sensível detectar e quantificar todas as informações relevantes e NÃO NO produtos e metabólitos em matrizes biológicas complexas. Aqui, nós apresentamos um método para a análise rápida e sensível de nitrito e nitrato por HPLC, bem como a detecção de NO livre em amostras biológicas utilizando in vitro de quimioluminescência ozono com base com derivitazation química para determinar a fonte molecular de NO, bem como ex vivo comMiografia banho de órgãos.

A produção endógena de óxido nítrico (NO) regula uma grande variedade de funções biológicas. Está se tornando cada vez mais claro que a ruptura ou desregulagem de sinalização NO base está envolvida em muitas doenças humanas. Os métodos para quantificar relevante metabólitos podem fornecer novos biomarcadores de diagnóstico ou de prognóstico para a doença humana.

Técnicas Analíticas para ensaiar Bioatividade Óxido Nítrico

O óxido nítrico (NO) é um radical livre diatômico com vida extremamente curta em sistemas biológicos (menos de 1 segundo no sangue circulante)1. O NO pode ser...

O objetivo geral do seguinte experimento é demonstrar como detectar com precisão e especificidade os metabólitos do óxido nítrico em amostras biológicas. Isso é alcançado processando primeiro as amostras de sangue imediatamente após a coleta, para evitar a perda de metabólitos ou a formação de artefatos. Concomitantemente, realiza-se uma coleta rápida e eficiente de tecidos para minimizar os efeitos de um ambiente hipóxico sobre os metabólitos do óxido nítrico.Anéis aórticos são coletados e suspensos em um banho de órgãos para avaliar sua função endotelial. Além disso, ensaios bioquímicos são utilizados para quantificar os níveis de nitrato, níveis de nitrito e os níveis relativos de nitro tióis e outros produtos nitrosados no tecido. Com o uso desses ensaios, uma comparação adequada entre animais experimentais e controles pode gerar informações valiosas sobre a produção e o metabolismo do óxido nítrico.A principal vantagem do uso dessa abordagem multissistêmica em comparação com métodos ou ensaios únicos é que ela permite uma visão mais ampla da bioquímica do óxido nítrico em múltiplos sistemas orgânicos. Assim, podemos começar a entender quais desses metabólitos podem ter utilida

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Os níveis da molécula inflamatória de sinalização celular óxido nítrico (NO) são comumente testados usando o reagente de Griess. Neste protocolo, criamos um ensaio de Griess modificado utilizando tecido cerebral vivo de Drosophila para detectar a secreção de NO em um método simples, quantificável e altamente repetível.

Novo ensaio quantitativo de tecido total dos níveis de óxido nítrico na resposta neuroinflamatória de Drosophila

Neste artigo descrevemos um método relativamente fácil adaptados usando o corante de fluorescência diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) para en face detecção simultânea e visualização de óxido nítrico intracelular (NO) e ânion superóxido (O 2 .- ), respectivamente, em aortas isoladas de fresco intactas de um modelo de rato de obesidade.

Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

O óxido nítrico (NO) é uma importante molécula de sinalização na homeostase vascular. A produção de NO in vivo é muito baixa para medição direta. A quimioluminescência fornece informações úteis sobre o ciclo de NO por meio da medição de seus precursores e produtos de oxidação, nitrito e nitrato. A determinação de nitrito / nitrato nos tecidos e fluidos do corpo é explicada.

Medindo nitrito e nitrato, metabolitos na Óxido Nítrico Pathway, em materiais biológicos utilizando o método de quimioluminescência

Trabalhos anteriores sugerem que a composição isotópica de nitrogênio dos óxidos de nitrogênio atmosféricos pode distinguir a influência de diferentes fontes no ambiente. Relatamos um método automatizado, móvel e baseado em campo para a alta eficiência de coleta de NOx atmosférico para análise isotópica de N em uma resolução de tempo horário.

Automatizado, de alta resolução Sistema de Coleta Móvel para a análise de azoto isotópica de NO<sub&gt; x</sub

Este paper descreve os protocolos de fumigação de óxido nítrico (NO) para controle de pragas pós-colheita. Câmaras de fumigação são liberadas com nitrogênio (N2) para estabelecer as condições de oxigênio ultralow antes não é injetado. No final, câmaras são liberadas com N2 para diluir n antes de expor produtos para ar ambiente, para evitar a exposição ao n. º2.

Procedimentos de laboratório de fumigação para controle de pragas com gás de óxido nítrico

Aqui, apresentamos um protocolo para abordar o potencial uso de plaquetas como um sensor altamente sensível de óxido nítrico no sangue. Ele descreve a preparação inicial de plaquetas e o uso de nitrito e células vermelhas do sangue pobre em oxigênio como geradores de óxido nítrico.

Detecção baseada em plaquetas de óxido nítrico no sangue, medindo-se a fosforilação VASP

Apresentamos protocolos para três métodos diferentes para a homogeneização de quatro diferentes grupos musculares de tecido muscular esquelético de ratos para medir e comparar os níveis de nitrato e nitrito. Além disso, comparamos diferentes pesos amostrais para investigar se o tamanho da amostra tecidual afeta os resultados da homogeneização.

Preparação de Homogeneizados do Músculo Esquelético de Rato para Medições de Nitrato e Nitrito

Aqui, apresentamos protocolos para detectar óxido nítrico e seus derivados biologicamente relevantes usando ensaios baseados em chemiluminescência com alta sensibilidade.

Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated

Este protocolo descreve um método para quantificar a produção de óxido nítrico (NO) em culturas epiteliais das vias aéreas diferenciadas na interface ar-líquido (ALI), medindo nitrito em secreções apicais usando um ensaio de quimioluminescência baseado em triiodeto.

Medição da produção de óxido nítrico em culturas celulares epiteliais traqueais de camundongos diferenciadas na interface ar-líquido

Um método de duas fases para estabelecer a doença renal crónica (IRC) em ratos Lewis por remoção cirúrgica da massa renal 5/6th é descrito. Combinação do procedimento cirúrgico, NOS-inibição e uma dieta rica em sal leva a um modelo semelhante CKD humano, permitindo estudo dos mecanismos causais e desenvolvimento de intervenções terapêuticas.

5/6th Nephrectomy em combinação com uma dieta alta de sal e Óxido Nítrico Sintase inibição para induzir o Doença Renal Crônica no Rato Lewis

Aprenda a detectar metabolitos de óxido nítrico em amostras biológicas usando ensaios bioquímicos e anéis aórticos. Este método permite avaliar a função endotelial e comparar níveis de NO entre grupos experimentais.

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