Name: Quantificação da colonização fúngica, esporogênese, e produção de micotoxinas Utilizando Bioensaios Kernel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprenda a quantificar micotoxinas e biomassa fúngica em sementes usando bioensaios de grãos. Este método padronizado permite analisar interações planta-patógeno e proteger safras de cereais.

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Gostaríamos de agradecer Brandon Hassett e Carlos Ortiz por sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado pela NSF subsídios IOB-0544428, 0951272-IOS e IOS-0925561 com o Dr. Michael Kolomiets, e pelo USDA Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura (Nifa), Melhoramento de Plantas DRFA e Grant Educação # 2010-85117 -20539 para os drs. Seth Murray, Thomas Isakeit e Kolomiets Michael.

1. Bioensaio Kernel milho <ol><li> Duas semanas antes da cultura, os fungos patogénicos em Agar de Batata Dextrose (PDA) a 28 ° C. </li><li> Seleccione grãos com tamanho e forma semelhantes, de preferência achatada assim que colocam em nível com a parte inferior de frascos de bioensaio, e colocar em tubos de 50 ml Falcon. Kernels seleccionados devem ter sido produzidos simultaneamente em mesmo ambiente para garantir a idade de sementes semelhante e composição metabolito. </li><li> Tona esterilizar miolo por agitação tubos à temperatura ambiente durante 5 minutos com etanol a 70%, 1 minuto com água estéril, e 10 minutos com hipoclorito de sódio a 6%. Lavar, três vezes, durante 5 minutos de cada vez, com água estéril, agitando contínua. Kernels Secar em toalhas autoclavados. </li><li> Para facilitar a infecção de Aspergillus flavus, criar uma pequena ferida no embrião lado com uma agulha 18 G até à profundidade de 0,5 cm. No entanto, em nossa experiência maior ferida é necessário para a infecção Fusarium verticillioides. Therefore, utilizar uma lâmina de barbear para cortar no embrião lado-a uma profundidade de 0,5 mm. </li><li> Preparar suspensão do inóculo por raspagem placas de cultura em cerca de 5 ml de solução autoclavada 0,01% de Tween-20 para libertar os esporos e remover o micélio por filtração através de gravidade, pelo menos, 4 camadas de gaze esterilizada. Calcular a concentração de esporos com hemocitômetro e ajuste para 10 6 esporos / mL para A. flavus ou F. verticillioides. Se usando outras espécies de patógeno ou hospedeiro, é importante avaliar as concentrações de inoculo para a infecção apropriado. </li><li> Criar uma câmara de humidade num recipiente de plástico (29,2 cm X 18,7 cm X 8,3 cm) revestidas com cinco folhas de toalhas de papel e 100 ml de água estéril. Câmara não é a água ou ar apertado e água deve ser adicionado ao longo experimento para manter toalhas de papel úmido. </li><li> Coloque quatro núcleos em um frasco de 20 ml autoclavado cintilação de vidro e registrar sua massa. Inocular com 200 uL suspensão de esporos,boné e vortex para kernels uniformente com suspensão. Solte as tampas para permitir livremente a troca de ar e colocar em câmara de umidade. </li></ol> Nota: Para sementes ou outros fungos que os descritos nestes métodos, a quantidade de inoculo necessária pode ser diferente e pode ser derivada experimentalmente. <ol start="8"><li> Incubar grãos sob um fotoperíodo 12-h-light/12-h-dark a 28 ° C durante 7 dias ou até desejado. </li></ol> 2. Enumeração conídios <ol><li> Após o período de infecção, adicionar 5 ml de autoclavado 0,01% de Tween-20 para frascos de cintilação contendo grãos infectados e Vortex cuidadosamente durante 1 minuto. </li><li> Usando uma pipeta de ponta larga furo, imediatamente diluir pela transferência de duas separadas alíquotas de 200 ul de suspensão de esporos em tubos Eppendorf contendo 2,0 ml 1,8 ml de 0,01% de Tween-20 (ou diluir conforme necessário, dependendo da infecção). </li><li> Enumerar cada alíquota de 200 uL por duas vezes com um hemocitómetro 4e comparar os níveis de conídios entre os tratamentos. </li></ol> 3. Quantificação de aflatoxina <ol><li> Adicionar núcleos a partir de uma amostra de 50 ml misturador copo com 20 ml de metanol a 80% e 0,05 g de NaCl, a tampa e da mistura a alta velocidade durante 1 min. </li><li> Coloque um papel de filtro de pregas ao longo de um recipiente de coleta limpo e despeje o extrato em filtro. </li><li> Transferem-se 10 ml do filtrado para um recipiente limpo, adicionar 20 ml de H2O destilada, e misturar bem. </li><li> Amostra de filtro através de um filtro de microfibra 1,5 mM de vidro em um copo limpo. </li><li> Aplicar 1 ml de extracto filtrado para Afla coluna de teste e, utilizando ar comprimido, forçar o extracto filtrado através da coluna a uma taxa de 1-2 gotas por segundo até esvaziadas. </li><li> Lavar a coluna duas vezes com 1 ml de H2O destilada e passar através da coluna a 1-2 gota / segundo até que o ar passa. </li><li> Coluna eluir com 1 ml de metanol a 100% HPLC numa 1-2 gota / segundo taxa recolhido numa cuvete de vidro. </li><li> Adicionar1 ml de Afla Desenvolvedor de teste para eluato e misture bem. Cuvete lugar em fluorómetro calibrado e lida a 60 seg. </li></ol> Nota: Quando se utiliza o protocolo Aflatest FGIS, a medição a partir do fluorómetro é calculada com base um período inicial de 50 gramas de amostra extraída em 100 ml. Se se considera a diluição da amostra com a água, o 1 ml aplicado a uma coluna representa 0,166 gramas de amostra. Assim, ao modificar o protocolo, você precisa levar em conta as diferenças de tamanho da amostra e da solução de extração inicial. Por exemplo, 2 gramas de grãos são extraídos em 20 ml de metanol 80%. Este é de 0,1 gramas / ml. Quando 1 ml desta amostra é misturada com 2 ml de água, a proporção de amostra no líquido é agora 0,033 gramas / ml. Se esta amostra dá uma leitura fluorómetro de 100 ppb, a concentração real baseia-se na proporção de amostra para 0,166, isto é, ppb = (0,166 grama X 100 ppb) / 0,1 grama), ou 166 ppb. Para quantificação de aflatoxina alternativamétodos de cátions, ver referência 7. 4. Fumonisina B1 (FB1) Análise <ol><li> Quando fungo é cultivado em grãos de milho, extrair amostras durante a noite com 10 ml de acetonitrilo / água (50/50, v / v) à temperatura ambiente sem agitação. Subsequentemente, misturar o extracto (2 ml) com água desionizada (6 ml), e aplicar esta mistura (8 ml) directamente para a extracção de fase sólida C-18. </li><li> Antes de carregar amostra pré-condição, a coluna de extracção C-18 de fase sólida, por lavagem com 2 ml de acetonitrilo seguido por 2 ml de água. </li><li> Após o carregamento da amostra, a coluna é lavada com 2 ml de água seguido por 2 ml de acetonitrilo / água (15/85, v / v). Amostra para análise por HPLC (contendo FB1) é eluída com 2 ml de acetonitrilo / água (70/30, v / v). </li><li> Derivatizar FB1 com o-phthaldehyde (OPA) por transferência de 0,1 ml do eluato da coluna para um frasco contendo 0,1 ml de tampão de borato (0,05 M bórico acid/0.05 de sódio M de borato [50/50, v / v] pH, 8,5) e 0,1 OPA ml (0,1 mg / ml em acetonaitrile com 0,5% - mercaptoetanol). </li><li> Parar a reacção após 10 min por adição de 0,5 ml de acetonitrile/0.01 M de ácido bórico (40/60, v / v). </li><li> Analise FB1 numa HPLC Shimadzu LC-20AT sistema equipado com uma coluna analítica ODS Zorbax (4,6 mm 150) e um comprimento de onda variável Shimatzu detector RF-10Axl de fluorescência (excitação 335 nm / emissão 440 nm). </li><li> Um gradiente linear é usada (solvente A: acetonitrile/0.1 M fosfato de sódio (40/60), pH 3,3, solvente B: acetonitrilo / fosfato de sódio 0,1 M (60/40), pH 3,3) eo programa de gradiente é como se segue: 100% de A. a 100% de B em 10 min B, 100% durante 5 min </li><li> Analise FB1 padrões por HPLC, e medição da área de pico são utilizados para gerar a curva padrão. Subsequentemente, quantificar FB1 nível de uma amostra por comparação com as áreas dos picos FB1 curva padrão. </li></ol> 5. Ergosterol Análise <ol><li> Cultura do fungo em grãos de milho por 7-14 dias. </li><li> Após o período de incubação, adicionam-se 10 ml de clorofórmio: metanol (2:1, v / v) em cada frasco. Uma vez adicionado, agitar amostras bem e depois incubar frascos no escuro à temperatura ambiente durante 24 horas. </li><li> Após 24 hrs, centrifugar as amostras, e recolher o sobrenadante e filtrar através de membrana de nylon 0,45 um. </li><li> Injectar a amostra directamente para um sistema de HPLC Shimadzu LC-20AT equipado com um 4,6 U coluna ODS-C18 (200 A, 250 ± 4,6 mm) e um Shimadzu UV SPD-20A / detector VIS definido para monitorar a 282 nm. </li><li> Use metanol (100%) a um caudal de 1,5 mL / min como a fase móvel. Determinar a quantificação de ergosterol em amostras por comparação das áreas de pico de amostras com uma curva padrão gerada a partir de HPLC ergosterol. </li></ol> 6. Os resultados representativos Após a inoculação e incubação numa câmara de humidade durante dois a três dias, o crescimento de fungos deve começar a aparecer sobre os núcleos. Sete dias após o tratamento, o crescimento vegetativo das plantas tratadas devem ser claramente visíveis, whilcontrolos electrónicos simulados deve ser não infectados (Figura 1B, no topo). Os períodos de incubação mais longo são favoráveis ​​a mais abundante crescimento vegetativo (Figura 1B, inferior). Sob as condições aqui descritas (Figura 2G), A. flavus de tipo selvagem NRRL 3357 indicadas valores máximos de colonização, a acumulação de aflatoxina, e produção de conídios de 8, 6, e 8 dias, respectivamente (Figura 2, CA). No entanto, quando a contaminação com micotoxinas e conidiação foram comparados por unidade de ergosterol, os maiores níveis foram observados 4 e 6 dias, respectivamente (Figura 2, DE). Figura 2F resume estes fungos biomassa-dependentes valor máximo-observações. Curiosamente, entre 4-6 dias após a inoculação, os grãos sofrem degradação de ácido nucleico, como visto pelo RNA total a partir de amostras sobre o tempo de curso-(Figura 2H, parte inferior). Vários estudos, incluindo a nossa, têm exaed F. verticilliodies infecção em grãos de milho 2,8,9,10,11,12 e utilizado com sucesso 7-13 dias como tempo-pontos para as observações. Utilizando os métodos aqui descritos, fumonisina níveis variam de 3,500-8,000 ng / g gama núcleo 4,13 e os níveis de ergosterol de 5.000-10.000 ng / g núcleo 14,13. Figura 3 mostra picos representativos para fumonisina (superior) e ergosterol (inferior ) de HPLC cromatogramas. Medição do ergosterol também pode ser realizada através de espectros de absorvância 15. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma para a quantificação da biomassa fúngica, esporogênese, e produção de micotoxinas e os resultados representativos para o crescimento vegetativo de bioensaios de núcleo. A) Fluxograma delineando o método descrito para a quantificação de parâmetros biológicos fundamentais utilizados para avaliar patogénese do fungo sobre grãos de milho. B) Representanteresultados para bioensaios de kernel. Top, A. flavus (NRRL3357) crescimento vegetativo em grãos de milho no fundo B73 genética. As sementes foram inoculadas com 200 ul de 10 6 esporos / mL e fotografias foram tiradas 7 dias após a inoculação. Inferior, F. verticillioides inoculados em grãos B73 fundo de 13 dias após a infecção. Grãos foram inoculados com 200 ul de 10 6 esporos / mL. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig2.jpg" /> Figura 2. Aspergillus flavus bioensaio kernel do tempo do curso. B73 núcleos foram inoculados com 200 ul de 10 6 esporos / ml de suspensão de Aspergillus flavus conídios e incubadas durante 2-8 dias (G). Todos os valores foram determinados a partir da média de peso seco de 4 grãos (n = 3-4; média ± SE). A) A colonização (com base no ergosterol), (B) aflatoxina, e (C) conidiação foram quantificados utilizando métodos descritos acima. E) A aflatoxina e (F) conidiação são exibidascomo uma função da biomassa fúngica como medido através h ergosterol. F) os valores máximos de ergosterol, a acumulação de aflatoxina, e conidiação como uma função da biomassa fúngica - valores máximos para cada quantidade observada foi definido como 100%. (H) 1 ug por pista de RNA total de tempo-curso. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig3.jpg" /> Figura 3. Representativos Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) cromatogramas de fumonisina B1 (topo) e ergosterol (inferior) isolado a partir de grãos infectados com Fusarium verticillioides (M3125).

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</ol>

<p class="jove_content"&gt; Não tenho nada para revelar.</p

<p class="jove_content"&gt; Os métodos descritos aqui foram testados extensivamente e provou ser robusto na geração de resultados quantificáveis ​​para a colonização de fungos, esporogênese, e produção de micotoxinas. Além disso, estes métodos devem ser aplicável a sementes de outras espécies de plantas que são susceptíveis de contaminação com fungos micotoxigênico (amendoim, por exemplo, trigo, algodão, pistácios, etc.) Para competentes análises planta-patógeno de interação, é imperativo que as sementes se manter vivo. Um local da ferida peque...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Catalogo </td></tr><tr><td> Agar Batata Dextrose </td><td> Fisher Cientificos </td><td> S71659A </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Cientificos </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Recipiente plástico de incubação </td><td> Sterilite </td><td> 1713LAB06 </td></tr><tr><td> Liqüidificador </td><td> Vicam </td><td> 20200 </td></tr><tr><td> 24 centímetros filtro de pregas Papers </td><td> Vicam </td><td> 31240 </td></tr><tr><td> 1,5 mM microfibra de vidro </td><td> Vicam </td><td> 31955 </td></tr><tr><td> Afla coluna Teste </td><td> Vicam </td><td> G1024 </td></tr><tr><td> Afrla Desenvolvedor Teste </td><td> Vicam </td><td> 32010 </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Vicam </td><td> 35016 </td></tr><tr><td> Acetonitrila </td><td> Fisher Cientificos </td><td> AC14952-0025 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientifc </td><td> AC39769-0025 </td></tr><tr><td> Coluna C-18 de extracção em fase sólida (SPE Prep setembro Coluna C18) </td><td> Fisher Cientificos </td><td> 60108-304 </td></tr><tr><td> O-ftalaldeído (OPA) </td><td> Sigma Chemical Co </td><td> 79.760-5g </td></tr><tr><td> Ácido bórico </td><td> Fisher Cientificos </td><td> BP168-500 </td></tr><tr><td> Borato de sódio </td><td> Fisher Cientificos </td><td> RDCS0330500 </td></tr><tr><td> Mercaptoetanol </td><td> Fisher Cientificos </td><td> 45-000-231 </td></tr><tr><td> Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc. </td><td> LC-20AT </td></tr><tr><td> Coluna Zorbax ODS (4.6x150mm) </td><td> Agilent Technologies </td><td> 443905-902 </td></tr><tr><td> Shimatzu detector RF-10Axl fluorescência </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc. </td><td> RF-10AXL </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio </td><td> Fisher Cientificos </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> FB1 padrões </td><td> Sigma Chemical Co. </td><td> F1147-1mg </td></tr><tr><td> Clorofórmio </td><td> VWR </td><td> MK444410 </td></tr><tr><td> 13 mm com filtro de seringa de 0,45 membrana de nylon UM (HPLC) </td><td> Ciências da Vida Pall </td><td> 4426 </td></tr><tr><td> Ergosterol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 45480-50G-F </td></tr><tr><td> Cintilação frascos </td><td> VWR </td><td> 66021-602 </td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio </td><td> Vicam </td><td> G1124 </td></tr></tbody></table>

quantificação da colonização fúngica, esporogênese, e produção de micotoxinas utilizando bioensaios kernel

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

O apodrecimento de grãos por semente de fungos que infectam representa um dos maiores desafios econômicos à produção mundial de cereais, para não mencionar os riscos graves para a saúde humana e animal. Entre a produção de cereais, o milho é sem dúvida a cultura mais afetada, devido ao patógeno induzidas por perdas na integridade de grãos e sementes de contaminação por micotoxinas. As duas micotoxinas mais prevalentes e problemático para os produtores de milho e alimentos e processadores de alimentos são aflatoxina e fumonisina, produzida por Aspergillus flavus e Fusarium verticillioides, respectivamente. Recentes estudos moleculares em planta-patógeno interações têm demonstrado promessa em compreender os mecanismos específicos associados com a resposta das plantas à infecção por fungos e contaminação por micotoxinas 1,2,3,4,5,6. Porque muitos laboratórios são usando ensaios de kernel para estudar organismos patogénicos de plantas interacções, não há uma necessidade de um método padronizado para quantificar diferentes parâmetros biológicos, de modoresultados de diferentes laboratórios podem ser cross-interpretado. Para um meio robusto e reprodutível para análises quantitativas de sementes, temos desenvolvido ensaios em laboratório e os métodos do kernel posteriores a quantificar o crescimento de fungos, biomassa e contaminação com micotoxinas. Quatro grãos de milho esterilizados são inoculadas em frascos de vidro com a suspensão fúngica (10 6) e incubadas durante um período predeterminado. Frascos de amostra são então seleccionados para a enumeração de conídios por análise de biomassa hemocitómetro, ergosterol baseada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), a quantificação aflatoxina utilizando um método AflaTest fluorómetro, e quantificação de fumonisina por HPLC.

A devastação das culturas de cereais por fungos que infectam sementes de suscitou numerosos esforços de pesquisa para entender melhor planta-patógeno interações. Para estudar sementes de fungos interações em um ambiente de laboratório, nós desenvolvemos um método robusto para a quantificação de reprodução dos fungos, biomassa e contaminação por micotoxinas utilizando bioensaios de kernel.

Quantificação da colonização fúngica, esporogênese, e produção de micotoxinas Utilizando Bioensaios Kernel

O apodrecimento de grãos por fungos que infectam sementes representa um dos maiores desafios econômicos para a produção de cereais em todo o mundo, sem mencionar os riscos graves...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar com precisão a biossíntese de micotoxinas, deterioração e crescimento, a fim de estudar as interações moleculares entre sementes e fungos. Isso é realizado primeiramente montando um bioensaio com grãos. Em seguida, os fungos do gênero *Fusarium* são enumerados e, então, as micotoxinas são quantificadas.Por fim, a biomassa fúngica é medida. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram os efeitos da fisiologia da semente no desenvolvimento reprodutivo e no metabolismo secundário de fungos micotoxigênicos por meio da quantificação da biomassa de kedia e de metabólitos secundários, utilizando técnicas de enumeração de esporos acopladas à cromatografia líquida de alta eficiência. A principal vantagem de propagar esta técnica é padronizar métodos em múltiplos laboratórios, de modo que os resultados de diferentes laboratórios possam ser comparados e interpretados mutuamente.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de interações moleculares entre sementes e microrganismos, como o modo pelo qual fungos patogênicos subvertem o metabolismo de lipídios da planta como uma estratégia virulenta. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque diferentes cepas de angi apresentam padrões distintos de crescimento e desenvolvimento. Por isso, é essencial que você otimize as condições para a sua interação favorita entre fungo e semente duas semanas antes de realizar o labirinto.Cultura do bioensaio com grãos. Os patógenos fúngicos em ágar batata dextrose ou PDA a 28 graus Celsius. Quando estiver pronto para iniciar, selecione grãos semelhantes em idade, forma e tamanho, e coloque-os em tubos de 50 mililitros. Superfície.Esterilize os grãos adicionando etanol 70% e agitando os tubos à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, agite com água estéril por um minuto e com hipoclorito de sódio 6% por 10 minutos. Enxágue com água estéril três vezes, agitando por cinco minutos cada vez.Em seguida, seque os grãos com toalhas de autoclave para infectar com Aspergillus flavus. Use uma agulha de 18 fios para criar uma pequena ferida, com 0,5 centímetros de profundidade, no lado do embrião de cada grão. Para infecção por Fusarium verticillioides, use uma lâmina de barbear para fazer um corte de 0,5 milímetro de profundidade.Prepare a suspensão do inóculo adicionando cinco mililitros de solução autoclavada de 0,1% de tween 20 às placas cultivadas e use um espalhador celular para raspar os esporos. Remova o micélio por gravidade, filtrando a solução através de pelo menos quatro camadas de gaze autoclavada. Utilize um hemocitômetro para calcular a concentração de esporos e ajuste para dez elevado a seis esporos por mililitro.Para ambas as espécies fúngicas. Crie uma câmara de umidade em um recipiente de plástico forrando-o com cinco folhas de papel-toalha e adicionando 100 mililitros de água estéril. Em seguida, coloque quatro grãos em cada autoclave.Frasco de vidro de 20 mililitros na instalação. Pese-os e registre sua massa. Adicione 200 microlitros de suspensão de esporos a cada tampa do frasco e vortexe para revestir uniformemente os grãos com a suspensão.Em seguida, afrouxe as tampas para permitir livremente a troca de ar e coloque os frascos na câmara de umidade. Incube os grãos em um fotoperíodo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro a 28 graus Celsius por sete dias ou até o estágio desejado. Após o período de infecção, adicione cinco milímetros de autoclave 0,01% entre 20 e os frascos de simulação contendo grãos infectados e vortexe completamente por um minuto. Usando uma ponteira de pipeta de grande porte, dilua imediatamente a suspensão de esporos transferindo duas alíquotas separadas de 200 microlitros para tubos einor de dois mililitros contendo 1,8 mililitros de Tween 20 0,01%.Utilize um hemocitômetro para contar cada alíquota duas vezes. Para quantificar a aflatoxina, adicione os grãos de uma única amostra a um copo de liquidificador de 50 mililitros com 20 mililitros de metanol 80% e 0,05 gramas de cloreto de sódio. Tampe e bata em alta velocidade por um minuto.Coloque um papel-filtro umedecido sobre um recipiente de coleta limpo e despeje o extrato no filtro. Transfira 10 mililitros do filtrado para um recipiente limpo. Adicione 20 mililitros de água destilada e misture bem.Filtre a amostra através de um filtro de microfibra de vidro de 1,5 mícron em um copo limpo. Aplique um mililitro do extrato filtrado em uma coluna de teste ALE e, usando ar comprimido, force o extrato filtrado através da coluna a uma taxa de uma a duas gotas por segundo. Lave a coluna duas vezes com um mililitro de água destilada, passando-a pela coluna a uma taxa de uma a duas gotas por segundo, até que o ar passe através dela.Elua a coluna com um mililitro de metanol grau HPLC a 100% a uma taxa de uma a duas gotas por segundo, coletando em um Q VET de vidro. Adicione um mililitro do revelador de teste ale ao EIT e misture bem. Coloque o Q VET em um fluorímetro calibrado e leia aos 60 segundos. Para análise de acin B um ou FB um, adicione 10 mililitros de uma solução 50 50 de acetonida trihal em água a cada amostra de bioensaio de grão e extraia durante a noite à temperatura ambiente sem agitação.Misture o extrato com seis mililitros de água desionizada e aplique a uma coluna de fase sólida C18 previamente condicionada com dois mililitros de acetonitrila, seguidos por dois mililitros de água. Após a aplicação da amostra, lave a coluna com dois mililitros de água, seguidos por dois mililitros de acetonitrila em água. Elua a amostra contendo FB1 para análise por HPLC com dois mililitros de acetonitrila em água.Derivar o FB um transferindo um mililitro da coluna EIT para um vial contendo 0,1 mililitro de tampão borato e 0,1 mililitro de aldeído e incubando por 10 minutos. Interromper a reação adicionando 0,5 mililitro de uma solução de acetonitrila e ácido bórico 0,01 molar. Analisar o FB um por HPLC utilizando um gradiente linear de acetonitrila e fosfato de sódio 0,1 molar.Compare as amostras com uma curva padrão de FB para analisar o cultivo de esteróis, o fungo em milho por sete a 14 dias. Após o período de incubação, adicione 10 mililitros de clorofórmio-metanol a cada frasco. Agite bem as amostras e, em seguida, incube os frascos no escuro à temperatura ambiente por 24 horas.Centrifugue as amostras a 5.000 RPM durante três minutos. Em seguida, filtre o sobrenatante através de uma membrana de náilon de 0,45 mícron. Injete a amostra diretamente em uma coluna HBLC e elua com metanol 100% a uma taxa de fluxo de 1,5 mililitros por minuto.Quantifique as amostras comparando as áreas dos picos com uma curva padrão gerada a partir de padrão para CLAE ou goole. Após a inoculação e incubação em uma câmara de umidade por dois a três dias. O crescimento fúngico deve começar a aparecer nos grãos como mostrado aqui.O crescimento vegetativo setenta dias após o tratamento em grãos inoculados deve ser claramente visível, enquanto os controles simulados devem permanecer não infectados; períodos de incubação mais longos favorecem um crescimento vegetativo mais abundante. Esta figura mostra que o tipo selvagem de flavus NR RL 3 3 5 7 exibiu valores máximos de colonização, acúmulo de aflatoxina e produção de kedia aos quatro, seis e oito dias, respectivamente. No entanto, quando a contaminação por micotoxinas e a colonização foram comparadas por unidade de massa fresca, os níveis mais elevados foram observados aos quatro e seis dias, respectivamente.Apresentam-se aqui os cromatogramas representativos de fumonisina e rol obtidos por CLAE, utilizando os métodos demonstrados neste vídeo. Os níveis de fumonisina variam de 3.500 a 8.000 nanogramas por grama de grão, e os níveis de rol variam de 5.000 a 10.000 nanogramas por grama de grão. Após a conclusão dos bioensaios com grãos, ação, micotoxinas e biomassa fúngica podem ser todos medidos em dois a quatro dias, dependendo do número de amostras experimentais.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de executar os métodos em um campo o mais estéril possível, seguindo este protocolo. Outros métodos, como fito, harmônicos, lipidômica e proteômica, transcriptômica ou outras interatomias, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais genes, proteínas e vias hormonais estão envolvidos nessas importantes interações entre reinos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Para estudar os processos de desenvolvimento de ascósporos em Gibberella zeae, um procedimento de coleta em condições estéreis é filmado de forma a gerar o maior nível de informação para a descrição do protocolo. Isso deve facilitar a reprodutibilidade do experimento, um aspecto crucial quando completa do genoma testes perfil de expressão são implementadas.

Gibberella zeae produção de ascósporos e Coleta de Experimentos de Microarray.

Extração de proteínas para análise proteômica em espécies de fungos requer um alto nível de padronização a ser realizado de acordo com as informações mínimas sobre um experimento proteômica (MIAPE) orientações. Nós apresentamos um vídeo protocolo que inclui um procedimento para minimizar viés experimental durante a indução da toxina e extração de proteínas...

Indução toxina e Extração de Proteínas de Fusarium Spp. Culturas de Estudos Proteômica

Cruzamentos sexuais e isolamento da progênie recombinante são importantes ferramentas de pesquisa para o fungo...

Desenvolvimento Sexual e descarga de ascósporos em Fusarium graminearum</em

Aqui descrevemos um protocolo para determinar a carga fúngica pulmonar em camundongos com aspergilose invasiva pela quantificação de prata de methanamine modificada de Gomori coloração em cortes histológicos. Uso desse método resultou em resultados comparáveis com menos animais comparados a avaliação da carga fúngica por PCR quantitativo de DNA fúngico de pulmão.

Histológica quantificação para determinar o pulmão carga fúngica em aspergilose Experimental

Aqui nós apresentamos um protocolo para análise de crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxinas em grãos de milho expressar uma proteína antifúngica.  Estamos usando uma estirpe de GFP-expressando a. flavus monitorado a infecção e a propagação do fungo em sementes maduras em tempo real. O ensaio é rápido, confiável e reprodutível.

Inibição do crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxina em milho transgénicos que expressar o inibidor de α-amilase de Lablab purpureus L.

Descrevemos um método modificado à base de ágar projetado para quantificar os efeitos antifúngicos de produtos derivados de plantas. Tanto contribuições voláteis quanto não voláteis para a atividade antifúngica podem ser avaliadas através deste protocolo. Além disso, a eficácia contra fungos pode ser medida em estágios-chave de desenvolvimento em uma única configuração experimental.

Medindo atividade antifúngica volátil e não volátil de produtos de biocontrole

Apresentamos um protocolo de imagem ao vivo sem rótulos usando técnicas de microscopia de luz transmitida para capturar imagens, analisar e quantificar a cinética de crescimento do fungo filamentoso A. nidulans em culturas submersas e mídia sólida. Este protocolo pode ser usado em conjunto com microscopia de fluorescência.

Análise quantitativa da taxa de crescimento de nidulans aspergillus usando microscopia ao vivo e software de código aberto

Aqui apresentamos um protocolo baseado no sistema de isca mealworm (Tenebrio molitor)-isca que foi utilizado para isolar e selecionar fungos entomopatômicos (EPF) a partir de amostras de solo. Uma fórmula eficaz de número de conidia (ECN) é usada para selecionar EPF tolerante ao alto estresse com base em características fisiológicas para controle microbiano de pragas no campo.

Isolamento e Seleção de Fungos Entomopatômicos de Amostras de Solo e Avaliação da Virulência Fúngica contra Pragas de Insetos

Este protocolo visa fornecer procedimentos detalhados para coleta, fixação e manutenção de amostras de plantas micoheterotróficas, aplicando diferentes técnicas de microscopia, como microscopia eletrônica de varredura e transmissão, microscopia de luz, confocal e fluorescência para estudar a colonização fúngica em tecidos e sementes geridas com fungos micorrizais.

Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

Este manuscrito detalha um protocolo de inoculação otimizado que utiliza bainhas de folhas de milho destacadas para estudos citológicos, fisiológicos e moleculares reprodutíveis de interações do milho com fitopatógenos fúngicos. As bainhas foliares facilitam a observação em tempo real das interações celulares entre a planta viva e o fungo em tecidos não fixos.

Bainhas de milho destacadas para imagens de células vivas da infecção por patógenos fúngicos foliares de milho

Aprenda a quantificar micotoxinas e biomassa fúngica em sementes usando bioensaios de grãos. Este método padronizado permite analisar interações planta-patógeno e proteger safras de cereais.

Quantificação da colonização fúngica, esporogênese, e produção de micotoxinas Utilizando Bioensaios Kernel

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